李 鑫， 高佩然， 邊秀舉， 王麗宏， 李會彬， 劉 暢， 董康挺， 孫鑫博

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河北省作物生長調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 保定 071000)

植物原生質(zhì)體是指細(xì)胞壁以內(nèi)的原生質(zhì)部分，即細(xì)胞通過質(zhì)壁分離后，去除細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包被的裸露細(xì)胞，具有細(xì)胞全能性，其廣泛應(yīng)用于植株再生[1]、體細(xì)胞雜交[2]、基因功能研究[3]、植物生化過程研究[4]等。自1960年Cocking等[5]首次利用纖維粗制酶，從番茄(Solanumlycopersicum)根尖分離出原生質(zhì)體以來，現(xiàn)已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]和煙草(NicotianatabacumL.)[7]中建立了原生質(zhì)體分離系統(tǒng)。馬暉玲等[8]在草地早熟禾(PoapratensisL.)‘午夜Ⅱ號’中建立了原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)體系，并再生出完整植株；李妮娜[9]在陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)中建立了原生質(zhì)體分離體系，并以此為受體獲得了能夠有效表達(dá)融合蛋白的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)。然而在匍匐翦股穎中并未有成功分離原生質(zhì)體的報(bào)道，因此高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的開發(fā)可為后期匍匐翦股穎的基因功能研究提供基礎(chǔ)。

瞬時表達(dá)是近年來發(fā)展的一種快速的、高效的檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，逐漸應(yīng)用到生物學(xué)各研究領(lǐng)域中[10]。同時，原生質(zhì)體作為一種理想的單細(xì)胞系統(tǒng)，因沒有細(xì)胞壁的限制，成為構(gòu)建植物瞬時表達(dá)體系的良好試驗(yàn)材料[11]。在植物原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時表達(dá)時間短、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化效率高，被廣泛應(yīng)用到基因克隆與分析、啟動子活性、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作分析等方面[10]。尹啟琳[12]通過瞬時表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了小麥(TriticumaestivumL.)‘濟(jì)麥22號’TaCKX1基因靶向編輯載體，并通過測序檢測了相關(guān)基因突變。Zhang等[13]利用瞬時表達(dá)系統(tǒng)，在水稻(OryzasativaL.)原生質(zhì)體中進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫印跡分析、亞細(xì)胞定位、雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)，并通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)研究光反應(yīng)過程。對于匍匐翦股穎高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究缺乏，因此建立其瞬時表達(dá)體系將有利于基礎(chǔ)功能研究的發(fā)展。

匍匐翦股穎是一種常見的冷季型草坪草，它屬于禾本科翦股穎屬多年生草本[14]。匍匐翦股穎原產(chǎn)于歐亞大陸，在我國華北、東北、西北均有分布，其葉片質(zhì)地良好、匍匐莖發(fā)達(dá)，低矮致密的葉片結(jié)構(gòu)能夠形成觀賞性較強(qiáng)的草坪，以及良好的耐低修剪、耐寒性、耐陰性、耐踐踏性等特性[15]。此外，匍匐翦股穎耐鹽性極強(qiáng)，對重金屬也有良好的吸收作用，因此，也可以作為鹽堿地修復(fù)、礦山恢復(fù)的生態(tài)草種[16]。但由于匍匐翦股穎是一種異源多倍體植物，其種子生產(chǎn)困難，并具有自交不親和性的遺傳特性，很難通過傳統(tǒng)育種方法來進(jìn)行遺傳改良。因此，通過基因工程手段進(jìn)行匍匐翦股穎的遺傳改良已成為研究的熱點(diǎn)。目前，匍匐翦股穎轉(zhuǎn)基因技術(shù)較為成熟[17]，然其瞬時表達(dá)體系研究較為滯后，嚴(yán)重制約了匍匐翦股穎在分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

本試驗(yàn)以匍匐翦股穎‘Penn-A4’為研究對象，探討各因素對原生質(zhì)體制備的影響，旨在為今后匍匐翦股穎體細(xì)胞雜交、遺傳轉(zhuǎn)化、產(chǎn)業(yè)育種等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取匍匐翦股穎‘Penn-A4’的無菌苗葉片為材料，進(jìn)行葉肉原生質(zhì)體的分離。

無菌苗的培養(yǎng)：將種子放入滅菌過的50 ml離心管中，加入消毒劑(成分：次氯酸鈉漂白劑20%，無菌水80%)，將離心管在150 r·min-1的搖床上室溫?fù)u晃30 min。在超凈工作臺中倒掉消毒劑，用無菌水沖洗種子5遍直至洗凈，將種子放在干凈濾紙上吹干，然后用鑷子均勻鋪在滅過菌的MS培養(yǎng)基上，封好瓶口，溫度25 ℃、濕度40%、光周期為12 h光照/12 h黑暗、無菌條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)試劑

酶解液：1.5%的纖維素酶、0.5%的果膠酶、0.6 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1MES，4 mmol·L-1CaCl2、0.1%的β-巰基乙醇和250 mg·L-1頭孢噻肟。

W5溶液：154 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1CaCl2，5 mmol·L-1KCl和2 mmol·L-1MES。

MMG溶液：0.6 mol·L-1甘露醇、15 mmol·L-1MgCl2和4 mmol·L-1MES。

40% PEG溶液：0.6 mol·L-1甘露醇，100 mmol·L-1CaCl2和40% PEG4000(聚乙二醇4000)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)重復(fù)梯度試驗(yàn)，分別改變植物培養(yǎng)時間、酶液滲透壓、酶解時間中的一個變量，確定匍匐翦股穎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳體系。1)不同的植物培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間2，3，4和6周、酶液甘露醇濃度0.6 mol·L-1、酶解時間4 h；2)不同的酶液滲透壓。常用的滲透壓穩(wěn)定劑主要有甘露醇、蔗糖、山梨醇等，其中甘露醇在原生質(zhì)體分離中的應(yīng)用最為廣泛[18]。培養(yǎng)時間4周、酶解時間4 h、酶液甘露醇濃度0.4，0.5，0.6和0.7 mol·L-1；3)不同的酶解時間。培養(yǎng)時間4周、酶解時間2，3，4和5 h、酶液甘露醇濃度0.6 mol·L-1。

1.4 原生質(zhì)體提取方法

用全新的、鋒利的刀片將匍匐翦股穎無菌苗的葉片在含0.6 mol·L-1甘露醇浸泡液的無菌培養(yǎng)皿中切割細(xì)碎。用鑷子將細(xì)碎葉片迅速放入含15 mL酶解液的無菌培養(yǎng)皿中浸沒，放置搖床中28 ℃，40 r·min-1振蕩培養(yǎng)。酶解完成后的材料用濾布(Miracloth)過濾，除去未完全酶解的原生質(zhì)體和雜質(zhì)。將濾液在1000 r·min-1條件下離心5 min，去掉上清液收集原生質(zhì)體。向原生質(zhì)體加入預(yù)冷的15 mL W5溶液，低速(30 rpm)震蕩1 h使其懸浮，用Miracloth過濾，1000 r·min-1離心5 min，棄上清。再次用預(yù)冷的W5溶液洗滌原生質(zhì)體，棄上清，以W5溶液重懸后收集純凈的原生質(zhì)體。用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)匍匐翦股穎原生質(zhì)體數(shù)量，取分離純化后的原生質(zhì)體懸浮液滴在載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察原生質(zhì)體質(zhì)量及數(shù)量，計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)原生質(zhì)體數(shù)量，重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

原生質(zhì)體的密度(個·mL-1)=大方格(0.1 mm3，即0.1 μL)的原生質(zhì)體數(shù)×104

1.5 瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建

PUC質(zhì)粒載體中含有35S啟動子和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，能夠在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)，可以被用作亞細(xì)胞定位質(zhì)粒載體。AsHSP26.8基因是一個葉綠體定位的小熱激蛋白，已在水稻原生質(zhì)體中證實(shí)其定位在葉綠體中[19]。根據(jù)AsHSP26.8基因序列設(shè)計(jì)兩端帶有BamHI酶切位點(diǎn)的引物AsHSP26-F:AGGATCCATGGCTGCA-GCGAACGCCCCCTTC;AsHSP26-Loc-PUC-R:GGGATCCACTGGACCTGCACGTCGATGACC，以高溫處理過的野生型匍匐翦股穎cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增(表1)，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體PUC-AsHSP26.8。

表1 PCR擴(kuò)增條件

1.6 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化與觀察

將收集好的原生質(zhì)體重懸浮于MMG溶液中。分別將2 μg GFP空載體和融合蛋白表達(dá)載體PUC-AsHSP26.8放入1.5 mL離心管中，加入100 μL Mmg重懸液混勻后，然后加入70 μL的40% PEG溶液，輕輕混勻后室溫放置15 min以完成轉(zhuǎn)化。隨后用30 mL的W5溶液重新懸浮原生質(zhì)體溶液，常溫條件下過夜培養(yǎng)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光蛋白信號。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行序列比對和分析；使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 匍匐翦股穎葉肉原生質(zhì)體的分離

以無菌環(huán)境中培養(yǎng)了4周的匍匐翦股穎無菌幼苗幼嫩葉片為試驗(yàn)材料(圖1a)，按本文“1.4”的方法進(jìn)行操作(圖1b)，收集得到明顯的聚集在一起的原生質(zhì)體(圖1c)。用光學(xué)顯微鏡觀察得到的原生質(zhì)體，雜質(zhì)少，體積大，數(shù)量多(圖1d)，可進(jìn)行下一步的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

圖1 匍匐翦股穎原生質(zhì)體的分離

2.2 原生質(zhì)體提取條件優(yōu)化

2.2.1無菌苗培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體分離的影響 原生質(zhì)體的提取效率與植物組織類型及植物葉片幼嫩程度有關(guān)系，首先需要確定原生質(zhì)體提取分離效果最佳的無菌苗培養(yǎng)時間。本研究選擇培養(yǎng)時間為2，3，4和6周的無菌苗材料，酶解后分別檢測分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量。原生質(zhì)體個數(shù)隨著培養(yǎng)時間呈現(xiàn)上升后下降的趨勢。培養(yǎng)4周的無菌苗得到原生質(zhì)體的平均產(chǎn)量均顯著高于其他培養(yǎng)時間(P<0.05)，達(dá)到最高值為6.75×106個·g-1(表2；圖2a)。所以最適的材料是培養(yǎng)4周的無菌苗。

2.2.2酶液滲透壓對原生質(zhì)體分離的影響 酶液滲透壓直接影響到原生質(zhì)體的質(zhì)量，分別選取甘露醇濃度為0.4，0.5，0.6和0.7 mol·L-1的不同滲透壓條件下進(jìn)行原生質(zhì)體的提取。甘露醇濃度為0.4 mol·L-1時，原生質(zhì)體平均產(chǎn)量為1.85×106個·g-1，0.5 mol·L-1時為3.90×106個·g-1，0.6 mol·L-1時為6.75×106個·g-1，0.7 mol·L-1時為4.70×106個·g-1。其中濃度為0.4 mol·L-1時原生質(zhì)體產(chǎn)量最低，0.6 mol·L-1時產(chǎn)量最高，且和其他濃度相比達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)(表2；圖2b)。所以選擇酶液滲透壓為0.6 mol·L-1甘露醇濃度。

2.2.3酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響 在適宜的酶解液、培養(yǎng)時間和滲透壓的條件下，酶解反應(yīng)時間也能夠明顯影響提取原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。酶解2 h時的原生質(zhì)體產(chǎn)量最低為4.50×106個·g-1，酶解3 h和5 h時的平均產(chǎn)量相當(dāng)，無顯著性差異，酶解時間4 h時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高為6.75×106個·g-1，且原生質(zhì)體破裂數(shù)量相較最少(表2；圖2c)。所以選擇4 h為合適的酶解時間。

表2 不同條件下的原生質(zhì)體產(chǎn)量

圖2 不同條件下的原生質(zhì)體產(chǎn)量

2.3 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

從基因組數(shù)據(jù)庫中下載AsHSP26.8的基因序列，根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)引物，以高溫處理過的野生型匍匐翦股穎cDNA為模板，用Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，片段長度約為700 bp(圖3a)。將擴(kuò)增片段連上載體pGEM-T Easy，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證和測序，提取正確的pGEM-AsHSP26.8質(zhì)粒。然后分別對pGEM-AsHSP26.8和PUC載體進(jìn)行BamHI單酶切。將pGEM-AsHSP26.8單酶切后的小片段(約700 bp)和單酶切后的PUC載體(約5 000 bp)(圖3b)，使用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，挑取單克隆菌斑，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取PUC-AsHSP26.8質(zhì)粒，經(jīng)酶切(圖3c)與測序鑒定，完成PUC-AsHSP26.8重組載體的構(gòu)建。

圖3 PUC-AsHSP26.8載體的構(gòu)建

2.4 亞細(xì)胞定位分析

分別將AsHSP26.8-GFP和GFP空載體通過PEG介導(dǎo)入制備好的匍匐翦股穎原生質(zhì)體,室溫條件下培養(yǎng)12 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。在激發(fā)光為488 nm條件下，AsHSP26.8-GFP和GFP空載體觀察到了綠色熒光；在激發(fā)光為580 nm條件下，觀察到原生質(zhì)體葉綠體自發(fā)熒光呈現(xiàn)紅色熒光(圖4)。GFP空載體的熒光蛋白定位于整個細(xì)胞質(zhì)中，構(gòu)建的質(zhì)粒AsHSP26.8-GFP定位于葉綠體上，與AsHSP26.8[19]在水稻的原生質(zhì)體定位情況一致。上述結(jié)果表明，提取的匍匐翦股穎原生質(zhì)體可用于蛋白亞細(xì)胞定位等相關(guān)分析。

圖4 AsHSP26.8-GFP和GFP空載體的亞細(xì)胞定位

3 討論

匍匐翦股穎作為一種具有眾多優(yōu)良性狀的觀賞性草坪草，由于其轉(zhuǎn)基因技術(shù)復(fù)雜、耗時長、表達(dá)水平低使得其在遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究受到了限制，而通過利用原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化克服了這一障礙。目前，關(guān)于分離匍匐翦股穎原生質(zhì)體和制備瞬時轉(zhuǎn)化體系的研究未見報(bào)道。因此，本研究在擬南芥原生質(zhì)體制備的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化原生質(zhì)體分離條件，首次建立了匍匐翦股穎原生質(zhì)體分離制備瞬時轉(zhuǎn)化體系，該體系可以為其它草坪草的瞬時轉(zhuǎn)化體系的建立提供參考。

目前常用的原生質(zhì)體分離方法與Yoo等[6]在擬南芥構(gòu)建的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系相似，多以葉肉為材料通過纖維素酶和果膠酶酶解分離得到原生質(zhì)體，并使用離心法純化。植物的各個器官如根、莖、葉、種子及愈傷組織等都能分離出原生質(zhì)體[20]。目前許多禾本科植物如小麥[12]和柳枝稷(PanicumvirgatumL.)[21]制備原生質(zhì)體所采用的試驗(yàn)材料是黃化苗，而匍匐翦股穎幼苗葉片細(xì)弱柔軟，且在暗處和遮光培養(yǎng)時，難以得到足夠的試驗(yàn)材料用于提取原生質(zhì)體。同樣又選用了土壤中培養(yǎng)的幼苗進(jìn)行試驗(yàn)，提取到的匍匐翦股穎原生質(zhì)體質(zhì)量也不太理想。此外，與作物相比，匍匐翦股穎無菌苗生長速度相對較慢，植株相對細(xì)小，用于提取原生質(zhì)體時，需要準(zhǔn)備較多的試驗(yàn)材料。在今后的研究中我們將繼續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)體系，期望能夠快速產(chǎn)生無菌苗或者可以用在培養(yǎng)室里培養(yǎng)的小苗甚至是匍匐莖上生長的新的植株作為材料，從而大大提高試驗(yàn)效率。

由于植物原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的保護(hù)和束縛，容易攝取外源DNA等遺傳物質(zhì)，原生質(zhì)體制備會受很多因素影響[20]。獲得植物高質(zhì)量原生質(zhì)體，需要優(yōu)化酶液組合與濃度、酶解時間和酶解滲透壓等幾個關(guān)鍵因素[22]。其中最重要的是酶液滲透壓，只有在維持一定的滲透壓才能保證原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對于匍匐翦股穎來說，最佳滲透壓是0.6 mol·L-1，低于0.6 mol·L-1時原生質(zhì)體會失水變癟，造成多余碎片，過高導(dǎo)致吸水膨脹而破裂，直接影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。對比匍匐翦股穎與其他植物的原生質(zhì)體分離體系，發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎所需的滲透壓濃度和近緣物種如水稻[13]、柳枝稷[21]是一致的，可能由于親緣關(guān)系相近的物種間細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似所致。酶解時間是另一個獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體的重要條件，分離原生質(zhì)體是植物去除細(xì)胞壁的過程，所以細(xì)胞壁成分和外植體幼嫩程度會極大的影響提取原生質(zhì)體的酶解時間。酶解時間過短，酶解過程不充分，無法分離出原生質(zhì)體；酶解時間過長，會破壞已分離出的原生質(zhì)體，影響獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量。本試驗(yàn)過程中選取培養(yǎng)4周的匍匐翦股穎無菌苗葉片，這一時期的葉片細(xì)胞幼嫩，細(xì)胞壁成分中纖維素含量較少，同時操作過程中將匍匐翦股穎葉片切割足夠細(xì)碎，會縮短酶解時間，減少因酶解液過度酶解而造成原生質(zhì)體破碎的情況。最佳組合下酶解4 h時就能夠獲得最多產(chǎn)量的原生質(zhì)體，產(chǎn)量能達(dá)到6.75×106個·g-1，在一定程度上加快了試驗(yàn)進(jìn)程。本試驗(yàn)得出本研究在獲得的最佳組合條件下進(jìn)行原生質(zhì)體制備，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量及大小均適用于亞細(xì)胞定位的試驗(yàn)觀察。

4 結(jié)論

本研究建立了一套能夠高效獲取匍匐翦股穎原生質(zhì)體的方法，以培養(yǎng)4周的匍匐翦股穎無菌苗葉片為材料，在甘露醇為0.6 mol·L-1的酶解液中酶解4 h能夠獲得產(chǎn)量為6.75×106個·g-1的原生質(zhì)體。通過40% PEG-4000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化匍匐翦股穎原生質(zhì)體，觀察到并證實(shí)小熱激蛋白AsHSP26.8清晰定位在葉綠體上。利用該體系，有利于進(jìn)行匍匐翦股穎基因亞細(xì)胞定位及功能研究。