張廷婷，趙文穎，謝倍珍，2，3*，劉 紅，2，3

（1 北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院環(huán)境生物學(xué)與生命保障技術(shù)研究所 北京100083 2 北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心 北京100083 3 北京航空航天大學(xué)空天生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)工程國際聯(lián)合研究中心 北京100083）

大量研究表明，長期高脂肪飲食或可誘發(fā)機(jī)體多種慢性疾病的發(fā)生，包括肥胖、非酒精性脂肪肝與高脂血癥等[1-3]。高脂飲食中的大量脂質(zhì)會(huì)引發(fā)血脂代謝異常，血脂水平增高，進(jìn)而誘發(fā)高脂血癥。目前，臨床上常使用他汀類藥物抑制體內(nèi)膽固醇的合成，起到降低膽固醇的功效[4]，然而，這類藥物可能對肝功能造成損傷，引發(fā)不良反應(yīng)[5]。目前已證實(shí)功能性食品成分包括植物固醇和膳食纖維等具有降血脂的作用[6-7]。植物固醇在體內(nèi)可與膽固醇形成競爭關(guān)系，抑制體內(nèi)膽固醇的吸收。膳食纖維可與體內(nèi)的膽固醇相結(jié)合，刺激腸道蠕動(dòng)。

黑木耳是一種肉質(zhì)鮮美，藥食同源的真菌類植物，富含蛋白質(zhì)（10.6%）、糖類（65%）、粗纖維（20%）以及大量的生物活性物質(zhì)，如黑木耳多糖、多酚類物質(zhì)等[8-9]，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、抑菌等藥用價(jià)值[10-16]。謝意珍等[17]發(fā)現(xiàn)灌胃3 mL 0.25 g/kg 體重的黑木耳多糖，能夠顯著降低高脂飲食大鼠的血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平（P<0.05）。何嘉烽[18]發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠經(jīng)黑木耳多糖預(yù)防性給藥后達(dá)到降低總膽固醇，提高高密度脂蛋白膽固醇的預(yù)防高脂血癥效果。

黑木耳對血脂的有益調(diào)節(jié)作用或與其對腸道微生物結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。腸道微生物與飲食有著天然的聯(lián)系，一方面，飲食會(huì)部分地通過調(diào)節(jié)腸道微生物組成直接影響人類健康，攝入的食物部分在胃和小腸被消化吸收，而較難消化的食物可能會(huì)進(jìn)入大腸并改變腸道菌群的多樣性[19-20]。大量研究證明腸道菌群改變與肥胖、糖尿病、結(jié)腸癌及情緒等健康狀況相關(guān)[21-25]。另外，腸道微生物可以發(fā)酵未消化的食物，生成的代謝產(chǎn)物會(huì)對人體健康產(chǎn)生潛在影響，膳食纖維發(fā)酵生產(chǎn)的短鏈脂肪酸已被證實(shí)對機(jī)體健康有益[26]。張放放等[27]發(fā)現(xiàn)黑木耳對腸道菌群的體外干預(yù)富集了雙歧桿菌，而關(guān)于黑木耳的體內(nèi)調(diào)節(jié)菌群作用研究較少。黑木耳中豐富的多糖及多酚等生物活性物質(zhì)可能在腸道菌群的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前對黑木耳生理功能的研究大都針對黑木耳中的重要活性物質(zhì)黑木耳多糖，而忽視了對黑木耳中其它膳食纖維及多酚類物質(zhì)的研究。對于黑木耳及其多糖預(yù)防高脂血癥功效的差異，以及與腸道菌群結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的相關(guān)性等尚未見研究報(bào)道。本文研究黑木耳及其主要生物活性物質(zhì)——黑木耳多糖對高脂飲食大鼠誘發(fā)高脂血癥的預(yù)防作用以及對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

5 周齡健康雄性SD 大鼠 【生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001】，北京維通利華生物科技有限公司。常規(guī)飼料與高脂飼料，北京科澳協(xié)力有限公司。常規(guī)飼料蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物供能比分別為23.1%，11.8%，65.1%，總能3.4 kcal/g，高脂飼料蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物供能比分別為11.3%，38.3%，50.4%，總能4.23 kcal/g，飼料配方見表1（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0010）。

表1 大鼠飼料配方Table 1 Rat feed formula

黑木耳（Auricularia auricula）和黑木耳多糖（Auricularia auriculapolysaccharides），中國黑龍江省丹江老黑山鎮(zhèn)農(nóng)場。將黑木耳用蒸餾水清洗數(shù)次至水澄清后泡發(fā)8 h、40 ℃烘箱烘干后保存于4 ℃冰箱中備用。取一定量的黑木耳送至西安國聯(lián)質(zhì)量檢測技術(shù)股份有限公司檢測其中的黑木耳多糖含量，經(jīng)檢測黑木耳中的黑木耳多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.96%，購買的黑木耳多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。

總膽固醇（Total Cholesterol，TC）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）測定試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇（High-density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）測定試劑盒，北京中生北控生物科技股份有限公司；油紅“O”染色試劑盒，武漢谷歌生物科技有限公司；DNA 強(qiáng)力提取試劑盒（PowerSoilRDNA Isolation Kit），北京百邁客生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CM1520 型冰凍切片機(jī)，德國徠卡公司；LV100ND 型金相顯微鏡，北京新卓儀器有限公司；LC-20AT 型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.2 樣品收集與處理 在1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)選取6 只大鼠無菌收集糞便（標(biāo)記為NCD0組）。在干預(yù)性飼養(yǎng)過程中，分別于干預(yù)初始時(shí)（week 0）及之后每兩周（week 2，week 4 和week 6）對各組大鼠稱重并于次日尾尖取血1 mL，離心后取上清液作為血清樣品于-20 ℃冰箱保存。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（干預(yù)6 周），將大鼠隔夜禁食12～16 h 后于次日尾尖取血1 mL，并隨后每組隨機(jī)解剖6 只大鼠，大鼠解剖前收集新鮮糞便樣本置于滅菌的離心管內(nèi)，于-80 ℃冰箱保存；解剖大鼠后分離肝臟組織并稱重，取1 cm×1 cm×1 cm 體積的肝臟置于4%的多聚甲醛固定液中，于4 ℃冰箱保存；取盲腸內(nèi)容物于-80 ℃冰箱保存。

1.4 大鼠相關(guān)指標(biāo)測定

1.4.1 大鼠血清生化指標(biāo)的測定 大鼠血清樣品用于檢測TC、LDL-C 和HDL-C 含量。將凍貯的血清樣本室溫解凍30 min，用移液器取100 μL 血清，按相關(guān)試劑盒的使用說明，分別采用CHODPAP 法測定血清中TC 含量，采用直接法-表面活性劑清除法測定血清的LDL-C 及HDL-C 含量。

1.4.2 大鼠肝指數(shù)的測定 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，解剖大鼠、分離其肝臟并稱重，按公式（1）計(jì)算肝指數(shù)。

1.4.3 大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的觀察 取1cm×1cm×1cm 體積的肝臟組織置于涂有OCT 包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT）的樣品托上速凍，冰凍切片機(jī)切片，厚度為6 μm。組織切片按油紅“O”染色試劑盒說明進(jìn)行染色，待組織切片干燥后用金相顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.4.4 大鼠腸道代謝產(chǎn)物檢測 稱取一定量的盲腸內(nèi)容物，按2 mL/g 加入超純水，充分混勻后于4℃10 000 r/min 離心15 min，吸取上清液。將上清液過0.22 μm 濾膜，過濾液稀釋1 倍后利用高效液相色譜儀測定其中的有機(jī)酸的濃度。其中液相色譜條件設(shè)置如下：1）色譜柱：Aminex HPX-87H柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）柱溫：30 ℃；3）檢測器：紫外檢測器；4）檢測波長：215 nm；5）流動(dòng)相：5 mmol/L 硫酸水溶液；6）進(jìn)樣量：10 μL；7）流速：0.6 mL/min。

1.4.5 大鼠腸道微生物DNA 提取及測序 取一定量的凍貯糞便樣本室溫解凍30 min，按照土壤基因組DNA 強(qiáng)力提取試劑盒說明提取DNA，于-20 ℃保存。使用擴(kuò)增引物（338F 5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' 和806R 5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對樣品 16S rDNA的V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用Illumina Hiseq 2500 平臺使用QIIME v1.8.0 軟件對16S rDNA的V3-V4 區(qū)進(jìn)行高通量測序（北京百邁客生物科技有限公司）。

使用vsearch2.8.1 軟件對高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端序列合并，切除引物并去冗余；使用usearch10 軟件對序列ESV 非聚類去噪；參考Silva 數(shù)據(jù)庫，在97%的相似度水平下聚類獲得操作分類單位（Operational Taxonomic Unit，OTU）；以最小樣品數(shù)據(jù)量對OTU 等量抽樣標(biāo)準(zhǔn)化得到抽平的OTU 表；使用Rstudio 軟件分析群落的豐度、多樣性及差異并作圖。

式(10)表示根據(jù)zn,p,h,kn,p,f,wn,p計(jì)算每一個(gè)分塊p與芯片f分區(qū)交集數(shù)值上限，式(11)規(guī)約分塊p在左右兩側(cè)與f分區(qū)部分相交時(shí)重疊區(qū)域的范圍.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS v22.0 軟件（SPSS 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用單因素方差分析（One way ANOVA）方法統(tǒng)計(jì)，用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠生理指標(biāo)的影響

2.1.1 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠體重及肝臟重的影響 干預(yù)階段各組大鼠體重隨時(shí)間變化趨勢如圖1a所示。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，各組大鼠的體重?zé)o顯著性差異（P>0.05），在第6周時(shí)，HFD 組、HFA 組和HFAAP 組大鼠的體重分別比NCD 組高出16.81%（P<0.01）、3.94%（P<0.05）和13.87%（P<0.01），說明高脂飲食能夠引起大鼠體重增長從而導(dǎo)致肥胖；與HFD 組相比，HFA 組和HFAAP 組大鼠的體重分別降低了11.02%（P<0.01）和2.52%（P>0.05），表明黑木耳能夠顯著抑制高脂飲食大鼠體重的增長，預(yù)防大鼠肥胖，而黑木耳多糖對高脂飲食大鼠的體重并無明顯影響。

與NCD 組相比，HFD 組大鼠的肝重及肝指數(shù)顯著升高（P<0.05）（圖1b），肝臟是脂質(zhì)代謝的重要場所，過量脂肪的攝入在肝內(nèi)堆積引起肝臟脂質(zhì)代謝障礙，導(dǎo)致肝臟負(fù)擔(dān)加重[28]，肝重及肝指數(shù)的增加說明高脂飲食能夠造成大鼠的肝臟損傷；而HFA 組和HFAAP 組大鼠均能夠顯著降低高脂飲食大鼠的肝重及肝指數(shù)（P<0.05），且喂食黑木耳的大鼠其肝重及肝指數(shù)恢復(fù)至與正常對照組相當(dāng)?shù)乃?，二者無顯著差異。

圖1 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠體重及肝指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Auricularia auricula and Auricularia auricula polysaccharides on body weight and liver index in high-fat diet rats

2.1.2 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠血清生化指標(biāo)的影響 各組大鼠血清中TC、LDL-C 和HDL-C 的含量在干預(yù)階段的變化情況如圖2所示，試驗(yàn)開始時(shí)，各組大鼠的血清TC、LDL-C 和HDL-C 含量均無顯著差異（P>0.05）。干預(yù)期間，NCD 組大鼠血清生化指標(biāo)均保持穩(wěn)定，而HFD 組大鼠的血清TC 和LDL-C 含量隨著飼喂時(shí)長的增加迅速上升，HDL-C 含量迅速下降，在干預(yù)結(jié)束時(shí)HFD 組大鼠的血清生化指標(biāo)均與NCD 組大鼠呈現(xiàn)出顯著性差異，表明持續(xù)飼喂高脂飲食能夠?qū)е麓笫蟮难迳笜?biāo)異常，形成高脂血癥。

圖2 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of Auricularia auricula and Auricularia auricula polysaccharides on serum biochemical parameters in high-fat diet rats

HFA 組及HFAAP 組大鼠的血清生化指標(biāo)與HFD 組呈現(xiàn)出相似的增加或降低趨勢，但有一定的改善。與HFD 組大鼠相比，HFA 和HFAAP 組大鼠的血清TC 和LDL-C 含量均顯著降低，且HFA 組大鼠的血清TC 含量較HFAAP 組降低了12.79%（P<0.01），但兩組大鼠的血清LDL-C 含量無顯著差異（P>0.05）；HFA 組大鼠的血清HDL-C含量相比于HFD 組升高11.11%（P<0.01），而HFAAP 組無顯著性差異（P>0.05）。血脂是機(jī)體血液內(nèi)所含脂質(zhì)的總稱，其中包括膽固醇、甘油三脂、膽固醇脂、β-脂蛋白、磷脂等，脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常使其中一種或多種脂質(zhì)高于正常稱為高脂血癥。大鼠的血清生化指標(biāo)數(shù)據(jù)表明，黑木耳能夠顯著抑制高脂飲食TC、LDL-C 含量升高和HDLC 含量降低，而黑木耳多糖僅對TC、LDL-C 水平升高具有顯著的抑制作用，且黑木耳較黑木耳多糖具有更明顯的降低血清TC 水平的作用。

2.1.3 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠肝臟及其脂肪堆積的影響 黑木耳及黑木耳多糖對肝內(nèi)脂類代謝的影響由肝臟油紅“O”染色結(jié)果反映，肝細(xì)胞內(nèi)紅染脂肪滴的體積與脂肪堆積程度呈正比。圖3 結(jié)果顯示，NCD 組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)未見明確的紅染脂肪滴；HFD 組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大片的紅染脂肪滴，肝臟脂肪堆積程度較為嚴(yán)重；HFA 組與HFAAP 組大鼠的肝臟脂肪堆積程度較HFD 組均有所減輕，且HFA 組減輕效果更明顯。

圖3 大鼠的肝臟組織油紅“O”染色結(jié)果（×20）Fig.3 Results of oil red “O” staining in liver tissues of rats（× 20）

2.2 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道代謝及菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道代謝的影響 各組大鼠盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸及總短鏈脂肪酸濃度的檢測結(jié)果見圖4，可以看出，與NCD 組相比，HFD 組大鼠的乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的含量均顯著降低（P<0.05）；HFA 組大鼠的乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸含量均顯著升高（P<0.05）；而HFAAP 組大鼠的短鏈脂肪酸中僅乙酸和總短鏈脂肪酸的含量有所升高（P<0.05）。結(jié)果表明黑木耳能夠顯著增加高脂飲食大鼠的腸道代謝產(chǎn)物中乙酸和丁酸的含量，分析其原因可能是黑木耳中豐富的膳食纖維能夠作為腸道代謝底物經(jīng)發(fā)酵生成短鏈脂肪酸，從而增加了盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量。

圖4 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道代謝產(chǎn)物的影響Fig.4 Effects of Auricularia auricula and Auricularia auricula polysaccharides on intestinal metabolites in high-fat diet rats

2.2.2 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響 通過高通量測序檢測分析黑木耳及黑木耳多糖對大鼠腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)的影響。本試驗(yàn)中樣品的平均測序量為54 588 條序列，最少的樣品序列達(dá)到40 278 條。通過對原始序列拼接過濾抽平后，按照97%的相似度劃分OTU，以便后續(xù)分析。

圖5a 為樣品的稀釋性曲線，反映樣品測序數(shù)據(jù)量合理度?？梢钥闯?，隨著測序量的增加，新增OTU 的數(shù)量逐漸增加并趨向平坦，說明測序量合理，測序深度足以覆蓋大多數(shù)細(xì)菌。

Alpha 多樣性通常用來衡量物種多樣性及均勻度。其中，Chao1 指數(shù)（圖5b）用于衡量物種多樣性，Simpson 指數(shù)（圖5c）用于衡量物種均勻度。如圖所示，與NCD0 組相比，NCD 組大鼠物種多樣性及均勻度均顯著提高，說明6 周的飼養(yǎng)使大鼠菌群更加豐富且均勻；HFD 組大鼠糞便菌群的物種多樣性指數(shù)Chao1 相比于NCD 組顯著降低，而HFA 組和HFAAP 組相比于HFD 組均有所升高，且HFA 組的升高作用更為顯著；與NCD 組相比，HFD 組大鼠的物種均勻度降低，黑木耳多糖的干預(yù)使高脂飲食大鼠物種均勻度有所提高，黑木耳則改善了部分大鼠的物種均勻度，說明高脂飲食導(dǎo)致大鼠的腸道菌群多樣性及均勻度降低，黑木耳及黑木耳多糖的干預(yù)明顯提高了高脂飲食大鼠的腸道菌群多樣性并在一定程度上使物種分布更加均勻。

為了更好地表征個(gè)體間微生物組成的相似性，選用Beta 多樣性來衡量。圖5d 中，NCD0 組與NCD 組大鼠菌群完全分離，說明喂食常規(guī)飼料的大鼠在6 周的飼養(yǎng)結(jié)束后糞便菌群發(fā)生了較大變化；HFD 組大鼠的菌群與NCD 組很好地分離，說明高脂飲食使大鼠菌群結(jié)構(gòu)改變；通過比較HFD組、HFA 組及HFAAP 組大鼠的菌群分布，可以看出喂食黑木耳及黑木耳多糖的大鼠菌群更傾向于遠(yuǎn)離HFD 組，且HFA 組趨勢更明顯。

圖5 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道菌群豐度及多樣性的影響Fig.5 Effects of Auricularia auricula and Auricularia auricula polysaccharide on intestinal flora abundance and diversity in high-fat diet rats

將OTU 的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對可得到每個(gè)OTU 對應(yīng)的物種分類信息，對各組樣本在門分類學(xué)水平上作物種分布圖（圖6a），同時(shí)對各個(gè)樣本的物種豐度進(jìn)行聚類分析，以比較主要腸道菌群的相似性和差異性，結(jié)果見圖6b。由圖6a 可以看出，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為各組大鼠腸道菌群內(nèi)含量最多的3 個(gè)菌門。與NCD 組相比，HFD 組大鼠的擬桿菌門的相對豐度升高，厚壁菌門的相對豐度降低；與HFD組相比，HFAAP 組大鼠的厚壁菌門的相對豐度升高，HFA 組和HFAAP 組大鼠的擬桿菌門的相對豐度降低。熱圖分析中的顏色梯度由藍(lán)色到紅色表示相對豐度由低到高。熱圖分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD組擬桿菌門豐度較高，黑木耳及黑木耳多糖干預(yù)的大鼠放線菌門、疣微菌門等豐度有所提升。接著，對各組樣本在屬水平下的物種信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制豐度排名前13 的菌屬及低豐度菌屬堆疊柱狀圖，結(jié)果見圖6c?？梢钥闯觯cNCD 組相比，高脂飲食組大鼠糞便中的普雷沃菌屬相對豐度顯著升高；與HFD 組相比，HFA 組及HFAAP 組大鼠的擬桿菌屬、薩特氏菌屬及副擬桿菌屬相對豐度升高，普雷沃菌屬、羅氏菌屬和布勞特氏菌屬相對豐度降低。

圖6 黑木耳及黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of Auricularia auricula and Auricularia auricula polysaccharides on the structure of intestinal flora in high-fat diet rats

為了明確造成組間差異的關(guān)鍵物種，采用火山圖對組間物種進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見圖7。從圖中可以看出，與NCD 組相比，HFD 組大鼠紡錘鏈桿屬和布勞特氏菌屬豐度顯著上調(diào)，并未發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào)的菌屬；相比于HFD 組大鼠，HFA 組的普雷沃菌屬、布勞特氏菌屬及屬水平未注釋的瘤胃球菌科下的菌屬等顯著下調(diào)，擬桿菌屬、副擬桿菌屬和屬水平未注釋的紫紅球菌科下的菌屬顯著上調(diào)，HFAAP 組的非消化糖桿菌屬和副擬桿菌屬顯著上調(diào)，普雷沃菌屬顯著下調(diào)；HFA 組相比于HFAAP 組擬桿菌屬和屬水平未注釋的紫紅球菌科下的菌屬顯著上調(diào)，非消化糖桿菌屬顯著下調(diào)。

圖7 差異物種火山圖Fig.7 Volcanic map of different genus

最后，為了進(jìn)一步闡釋腸道菌群與其代謝物之間的相關(guān)性，以相關(guān)性及顯著性P值作為篩選條件來評判短鏈脂肪酸與菌群屬水平（相對豐度前20 的菌屬）的相關(guān)關(guān)系（圖8），圖中有顏色的點(diǎn)均為P值小于0.05 時(shí)的相關(guān)性大小。從圖中可以看出，短鏈脂肪酸含量與副擬桿菌屬、薩特氏菌屬及擬桿菌屬存在顯著正相關(guān)，與乳酸桿菌屬及普雷沃菌屬呈負(fù)相關(guān)。

圖8 腸道菌群與其代謝物相關(guān)性聚類熱圖Fig.8 Cluster heat map of intestinal flora and its metabolites

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食能夠引起大鼠肥胖，同時(shí)還會(huì)引起血清總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇含量升高，低密度脂蛋白膽固醇含量降低，即血脂代謝異常，造成高脂血癥。肝臟是脂類代謝的關(guān)鍵場所，人體內(nèi)血脂的相對恒定主要靠肝細(xì)胞調(diào)節(jié)，肝細(xì)胞能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)化成膽汁酸，并分泌膽汁，促進(jìn)脂肪在腸道的消化和吸收[29]。當(dāng)肝臟功能受損時(shí)，膽汁的生成和排泄出現(xiàn)障礙，體內(nèi)的血脂代謝也會(huì)發(fā)生異常。然而，膳食纖維能夠減少腸道對膽固醇的吸收從而降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量[6-7]，黑木耳富含豐富的蛋白質(zhì)、粗纖維以及大量的生物活性物質(zhì)如黑木耳多糖、多酚類物質(zhì)等。如本試驗(yàn)所述，黑木耳能夠明顯抑制高脂飲食所導(dǎo)致的體重增長，從而預(yù)防肥胖，且黑木耳和黑木耳多糖能夠降低高脂飲食大鼠的肝脂肪堆積，并可能通過改善其肝臟功能途徑發(fā)揮預(yù)防血脂異常的作用，從而促進(jìn)肝臟代謝。膳食纖維能夠刺激腸胃蠕動(dòng)，同時(shí)還能在腸道中發(fā)酵，生成短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)機(jī)體代謝[26]。因此，黑木耳及其多糖的降血脂作用可能與黑木耳中含有的膳食纖維、多酚類物質(zhì)等功能性成分密切相關(guān)。

盡管機(jī)體的微生物群落組成存在很大的個(gè)體差異，但主要由放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門組成，飲食組成對腸道菌群有重要影響，這些細(xì)菌的相對比例隨飲食依賴性變化。飲食對機(jī)體狀況的改善離不開腸道菌群的介導(dǎo)。因此，在飲食切換后的幾天，便可以檢測到糞便菌群的變化[30-32]。Wu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，與脂肪攝入呈正相關(guān)但與纖維攝入呈負(fù)相關(guān)的細(xì)菌門主要是擬桿菌門和放線菌門，而厚壁菌門和變形菌門則顯示相反的關(guān)聯(lián)。在本研究中發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠的糞便中擬桿菌門豐度升高而厚壁菌門豐度降低，而黑木耳及其多糖的干預(yù)在一定程度上逆轉(zhuǎn)了高脂飲食中優(yōu)勢菌群豐度的分布，說明擬桿菌門和厚壁菌門的豐度比例在脂肪的代謝中發(fā)揮重要作用，黑木耳及黑木耳多糖能夠預(yù)防脂肪攝入造成的菌群結(jié)構(gòu)的改變。在屬水平上，本文的差異物種火山圖顯示高脂飲食僅顯著提高了紡錘鏈桿屬和布勞特氏菌屬的豐度，說明高脂飲食是通過富集相應(yīng)的菌屬以改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)。Wang 等[34]也同樣發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者的糞便樣本中紡錘鏈桿屬和布勞特氏菌屬明顯增加。Shen 等[35]在非酒精性脂肪性肝炎的患者中發(fā)現(xiàn)布勞特氏菌屬的豐度顯著高于健康受試者，且其豐度的增加響應(yīng)于高脂飲食的攝入[36]。本文中食用黑木耳的大鼠顯著降低了布勞特氏菌屬的豐度，說明高脂飲食造成的大鼠肝重及肝指數(shù)上升，肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷可能與布勞特氏菌屬豐度的升高有關(guān)，黑木耳的干預(yù)降低了其豐度從而改善了肝臟受損情況。

富含膳食纖維的飲食可增加腸道放線菌門和疣微菌門的相對豐度[37]。本文的物種豐度聚類熱圖顯示黑木耳及黑木耳多糖的干預(yù)使高脂飲食大鼠糞便菌群中放線菌門和疣微菌門豐度提高，根據(jù)火山圖推測可能是提高了非消化糖桿菌屬和紫紅球菌科下菌屬的豐度。非消化糖桿菌屬已被發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎患者中顯著減少[38]，紫紅球菌科在帕金森患者的糞便菌群中顯著減少[39]。本文中黑木耳多糖的攝入使高脂飲食大鼠糞便菌群中非消化糖桿菌屬豐度顯著提升，同時(shí)其豐度也顯著高于HFA 組大鼠，說明黑木耳多糖可能是通過對非消化糖桿菌屬的富集在一定程度上改善了肝臟損傷，確保脂質(zhì)在肝臟的正常代謝以預(yù)防高脂血癥。另一方面，黑木耳干預(yù)的高脂飲食大鼠有較高豐度的紫紅球菌科，表明黑木耳中除多糖外的其它生物活性物質(zhì)可能還對機(jī)體健康的其它方面起到積極作用，越來越多的數(shù)據(jù)證明黑木耳還具有降血糖[40-42]、抗血栓[43-44]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[45-46]等益處。除此之外，與HFD 和HFAAP 組相比，HFA 組大鼠腸道中擬桿菌屬豐度升高，瘤胃球菌科豐度降低，而二者在HFD 和HFAAP 組間無差異。擬桿菌屬為腸道中的共生菌，為機(jī)體提供必需的營養(yǎng)；瘤胃球菌科在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的腸道中富集，復(fù)合多糖的攝入及運(yùn)動(dòng)的干預(yù)后使肥胖大鼠的瘤胃球菌科豐度顯著降低[47]，在小鼠體內(nèi)也同樣發(fā)現(xiàn)高脂飲食所造成的瘤胃球菌科豐度的增加[48-49]。說明黑木耳中除黑木耳多糖作用外，其它生物活性物質(zhì)還可能通過富集擬桿菌屬，降低瘤胃球菌科豐度來抵抗高脂飲食對血脂代謝的影響，使得HFA 組在血清指標(biāo)以及大鼠體重控制等方面均有更好的表現(xiàn)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)黑木耳及黑木耳多糖的干預(yù)均顯著提高了副擬桿菌屬豐度、降低了普雷沃菌屬的豐度。有研究發(fā)現(xiàn)，食用纖維素的大鼠副擬桿菌屬豐度較高[37]，副擬桿菌屬的豐度與人類體重指數(shù)（Body Mass Index，BMI）有顯著的負(fù)相關(guān)性[50]。小鼠研究則表明了普雷沃菌屬介導(dǎo)黏膜炎癥，可以通過增加免疫細(xì)胞和各種基質(zhì)細(xì)胞中炎性介質(zhì)的釋放來誘導(dǎo)疾病和炎癥特征[51]。因此，黑木耳及黑木耳多糖的干預(yù)還可能通過上調(diào)代謝有益菌副擬桿菌屬的豐度，下調(diào)促炎菌普雷沃菌屬的豐度，起到對高脂飲食大鼠高脂血癥的預(yù)防作用。

黑木耳中富含的膳食纖維可以作為腸道代謝底物，在盲腸內(nèi)產(chǎn)酸菌的發(fā)酵下生成短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸和丁酸。乙酸是細(xì)菌為宿主提供能量的主要來源；丙酸能夠抑制肝臟內(nèi)膽固醇和脂肪酸的合成[52]；丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能量來源[53]。短鏈脂肪酸不僅能增強(qiáng)腸道上皮屏障功能，對降低體重及促進(jìn)血脂代謝產(chǎn)生重要作用[54]，而且可使腸道內(nèi)具有疾病調(diào)節(jié)功能的細(xì)菌富集從而影響機(jī)體代謝[24]。本文在對短鏈脂肪酸及菌群變化相關(guān)性的探討中發(fā)現(xiàn)副擬桿菌屬、薩特氏菌屬和擬桿菌屬與短鏈脂肪酸有較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，與乳酸桿菌屬及普雷沃菌屬呈負(fù)相關(guān)；在屬水平物種圖中發(fā)現(xiàn)高脂飲食導(dǎo)致大鼠糞便菌群中普雷沃菌屬豐度升高，黑木耳及黑木耳多糖的干預(yù)富集了副擬桿菌屬、薩特氏菌屬和擬桿菌屬。研究發(fā)現(xiàn)，食用纖維素的大鼠腸道中副擬桿菌屬豐度較高且其糖酵解產(chǎn)物為有益的乙酸和琥珀酸[37，55]；擬桿菌屬是乙酸、丁酸及琥珀酸鹽的生產(chǎn)者[56-57]。本文研究發(fā)現(xiàn)黑木耳和黑木耳多糖干預(yù)均能夠增加盲腸內(nèi)的短鏈脂肪酸的含量，后者對抑制高脂飲食大鼠的體重增加及促進(jìn)血脂代謝都具有重要的作用，因此猜測黑木耳及其多糖可能通過增加富集產(chǎn)生短鏈脂肪酸的有益菌來提高盲腸中短鏈脂肪酸的含量以預(yù)防高脂飲食大鼠體重增加、促進(jìn)血脂代謝。

綜上，黑木耳及其多糖可能通過改善高脂飲食大鼠的肝臟功能、增加短鏈脂肪酸含量以及調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等途徑調(diào)節(jié)血脂水平，對高脂血癥的發(fā)生起到一定的預(yù)防作用，且黑木耳對肝臟功能的改善、短鏈脂肪酸的提高及菌群結(jié)構(gòu)的改善更為顯著。

4 結(jié)論

本研究表明：黑木耳能夠顯著預(yù)防大鼠高脂飲食引起的血清TC、LDL-C 含量升高，HDL-C 含量降低，而黑木耳多糖顯著下調(diào)LDL-C 含量，對HDL-C 有上調(diào)趨勢，黑木耳對血清TC 水平的調(diào)節(jié)作用比黑木耳多糖更明顯，降血脂效果更佳；黑木耳及黑木耳多糖對肝臟代謝都具有一定的促進(jìn)作用，且均顯著增加了盲腸內(nèi)的短鏈脂肪酸含量；腸道菌群的高通量測序分析表明黑木耳及黑木耳多糖都能夠增加高脂飲食大鼠的腸道菌群的多樣性，并引起腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。高脂飲食使與脂肪攝入呈正相關(guān)的擬桿菌門豐度提高，同時(shí)也提高了與肝炎有關(guān)的紡錘鏈桿屬和布勞特氏菌屬的豐度，造成肝指數(shù)上升，肝臟結(jié)構(gòu)損傷；黑木耳及其多糖的干預(yù)使大鼠糞便菌群中非消化糖桿菌屬或紫紅球菌科豐度提升，緩解高脂飲食攝入造成的肝炎及其它疾病，下調(diào)普雷沃菌屬以緩解高脂飲食帶來的炎癥；黑木耳同時(shí)也調(diào)節(jié)了與肥胖有關(guān)的瘤胃球菌科的豐度，說明黑木耳中除黑木耳多糖外的其它生物活性物質(zhì)主要是通過降低瘤胃球菌科來更顯著地預(yù)防高脂血癥，同時(shí)在大鼠體重的控制上發(fā)揮一定的作用。黑木耳及其多糖可能通過上調(diào)副擬桿菌屬和擬桿菌屬等的豐度來產(chǎn)生對機(jī)體有益的短鏈脂肪酸以促進(jìn)血脂代謝，預(yù)防高脂血癥。因此猜測黑木耳及其多糖可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加短鏈脂肪酸含量，并進(jìn)一步改善高脂飲食大鼠的肝臟功能等途徑發(fā)揮降血脂作用，且黑木耳降血脂的作用更顯著。本研究結(jié)果有望更好地解釋黑木耳及黑木耳多糖的降血脂作用，并為飲食干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群和改善機(jī)體健康提供理論基礎(chǔ)。