李 燕，蔡儒安，潘如梨，陳佑儒，鄭曉杰，謝登恩

（1 溫州科技職業(yè)學(xué)院（溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）溫州市特色食品資源工程技術(shù)研究中心 浙江溫州325006 2 臺(tái)灣大仁科技大學(xué) 臺(tái)灣屏東90741 3 臺(tái)灣大仁科技大學(xué)藥學(xué)研究所 臺(tái)灣屏東90741）

糖尿病是因胰島素分泌不足或胰島素抵抗而產(chǎn)生的以高血糖為特征的代謝性疾病。目前全球約有4.25 億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年，患有糖尿病的人數(shù)將達(dá)到6.29 億人[1]。我國是糖尿病第一大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，成年糖尿病患者人數(shù)約1.14 億，其中2 型糖尿病患者占90%以上[2]。目前，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病后在世界范圍內(nèi)的第三大嚴(yán)重危害人類健康的非傳染性疾病[3-4]。

青錢柳（Cyclocarya paliurus）為金錢李或金錢柳，系雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬落葉喬木，是我國瀕臨滅絕的珍稀樹種之一，屬國家二級(jí)保護(hù)樹種，主要生長于我國南部亞熱帶的山區(qū)，分布于廣西、江西、湖南、浙江、福建、四川等省[5]。大量研究表明，青錢柳富含多糖、黃酮、皂苷等活性成分，其提取物具有降血糖、降血脂、降血壓等功效。2013年，青錢柳葉被國家衛(wèi)生和健康委員會(huì)列入新資源食品目錄[6]。以青錢柳葉為原料研制的保健茶，成為我國第一個(gè)獲得美國FDA 認(rèn)可的保健茶。青錢柳因廣泛的藥用和食用價(jià)值具有良好的市場前景。

青錢柳作為具有降血糖功效的功能性食品原料，近年來備受關(guān)注。本試驗(yàn)以青錢柳葉為原料，用水浸提獲得粗提物，研究青錢柳水提物對(duì)胰腺細(xì)胞的增殖作用，并通過鏈脲佐菌素/煙酰胺（STZ/NA）誘導(dǎo)建立預(yù)防型2 型糖尿病小鼠模型，用青錢柳水提物灌胃4 周，觀察糖尿病小鼠血糖、血脂等指標(biāo)的變化，研究該水提物對(duì)糖尿病小鼠的抗發(fā)炎和預(yù)防糖尿病的作用，為青錢柳的精深加工及在保健食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康ICR 品系小鼠，雄性，4 周齡，20.0～25.0 g，購自臺(tái)灣樂斯科生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于臺(tái)灣大仁科技大學(xué)動(dòng)物中心，具空調(diào)設(shè)備，溫度維持在（25±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，喂以市售飼料，自由進(jìn)水，適應(yīng)一周后開始進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 材料與試劑

青錢柳葉，由浙江省文成縣青錢柳種植合作社提供。

RIN-m5F 細(xì)胞為大鼠胰島β 細(xì)胞瘤細(xì)胞，購于臺(tái)灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存研究中心。煙堿酸（NA）、鏈脲佐菌素（STZ）、格列本脲（Gly）、DMSO、胰蛋白酶、MTT、佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）、吲哚美辛（Indomethacin），美國Sigma 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國Hyclone；血糖試紙，德國貝朗有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

SB-1000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Eyela；無菌操作臺(tái)，臺(tái)灣Tsai Hsin；BC2D 循環(huán)恒溫水浴槽，臺(tái)灣Hipoint；NU-4750 CO2培養(yǎng)箱，美國NuAire；Gs-300fl 倒立熒光顯微鏡，日本Mirage；MX-305 高速離心機(jī)，日本Tomy；Mqx-200 酶聯(lián)免疫分析儀，美國Biotek；HA330 殺菌斧，臺(tái)灣Hipoint；血糖儀，德國Omnitest Plus；測厚儀，日本Peacock。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 青錢柳水提物制備 取200.0 g 青錢柳干葉加入3 L 的蒸餾水中，以水煎煮2 次，合并濾液，將過濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥得到青錢柳粉末30 g，得率為15%。冷藏條件下保存，使用時(shí)用純水溶解，配制成所需濃度溶液。

1.4.2 MTT 法測定青錢柳水提物細(xì)胞增殖試驗(yàn)稱取30.0 mg MTT，加入6.0 mL 磷酸鹽緩沖液，配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 的MTT 溶液，并保存于4 ℃冰箱備用。將處于對(duì)數(shù)生長期的RINm5F 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以104個(gè)/孔接種于96 孔盤中，接種體積為200 μL/孔，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h后移除舊培養(yǎng)基，再加入100.0 μL 無血清培養(yǎng)基，分別含0.0，25.0，50.0，100.0，250.0 及500.0 μg/mL 質(zhì)量濃度的青錢柳，再培養(yǎng)12～48 h，于每個(gè)孔中加入30.0 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)3 h。向每孔中加入150.0 μL 的DMSO，避光振蕩10 min 后，用酶聯(lián)免疫分析儀在490 nm 檢測吸光值（OD）。

細(xì)胞增殖率（%）＝[（試驗(yàn)組OD 值-對(duì)照組OD值）/對(duì)照組OD 值]×100

1.4.3 降血糖分組及給藥 取健康ICR 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，禁食不禁水12～14 h 后，稱重，根據(jù)體重S 型分組，分為6 組：空白對(duì)照組（Control組）、誘發(fā)組（STZ 組）、陽性藥對(duì)照組（Gly 組）、青錢柳低劑量組（L 組）、青錢柳中劑量組（M 組）和青錢柳高劑量組（H 組）?？瞻讓?duì)照組和誘發(fā)組給予純水，陽性藥對(duì)照組予格列本脲（Gly），青錢柳低、中、高劑量組分別給予青錢柳樣品（劑量分別為100.0，200.0，500.0 mg/kg），每天灌胃給藥1 次，連續(xù)28 d。

1.4.4 STZ/NA 誘發(fā)糖尿病小鼠模型 第1 次灌胃樣品后，進(jìn)行誘發(fā)糖尿病試驗(yàn)：誘發(fā)組、陽性藥對(duì)照組和青錢柳低、中、高劑量組分別腹腔注射NA（劑量為200.0 mg/kg）保護(hù)小鼠胰臟，30 min后，腹腔注射誘發(fā)糖尿病藥物STZ（劑量為120.0 mg/kg）；空白對(duì)照組對(duì)應(yīng)腹腔注射2 次生理鹽水（劑量為10.0 mL/kg）。4 d 后將STZ 劑量減半，其它操作相同，進(jìn)行第2 次誘發(fā)。再過1 周后，采用尾部靜脈取血測定誘發(fā)組小鼠空腹血糖值，根據(jù)空腹血糖數(shù)值，判斷是否誘發(fā)成功。

1.4.5 血清生化指標(biāo)的檢測 給藥試驗(yàn)結(jié)束后，禁食12～14 h，CO2昏迷小鼠，取肝門靜脈中的血液，放置30 min，3 000 r/min 離心，取上層血清，寄送臺(tái)灣尚捷醫(yī)事檢驗(yàn)所對(duì)其中的血糖、總蛋白質(zhì)、總膽固醇及三酸甘油脂4 項(xiàng)生化指標(biāo)，以全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.4.6 抗發(fā)炎試驗(yàn)分組及給藥 取健康ICR 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，測量小鼠耳朵厚度，根據(jù)體重S 型分組，分為6 組：空白對(duì)照組（Control）、誘發(fā)組（TPA 150 μg/mL）、PC 陽性藥對(duì)照組（吲哚美辛25.0 mg/mL）、青錢柳低L 組（5.0 mg/mL）、青錢柳M 組（12.5 mg/mL）和青錢柳H 組（25.0 mg/mL）。測定小鼠右耳厚度，并將150 μg/mL TPA 20 mL 涂抹于小鼠耳朵，2 h 后重新測定小鼠耳朵厚度，并將對(duì)應(yīng)藥物涂抹于相應(yīng)組別小鼠耳朵，記錄0，2，12 h 和24 h 的小鼠耳朵厚度。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 糖尿病鼠體重、血清總蛋白、血糖、三酸甘油脂、總膽固醇均采用（±s，n=5），抗發(fā)炎小鼠耳朵厚度采用（±s，n=6）表示，運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各指標(biāo)組間差異采用Duncan 檢驗(yàn)，a、b、c、d 表示經(jīng)Duncan檢驗(yàn)加以統(tǒng)計(jì)分析后，P＜0.05 時(shí)，各組之間具有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳水提物對(duì)胰島RIN-m5F 細(xì)胞增殖作用

胰腺內(nèi)胰島中央?yún)^(qū)的β 細(xì)胞是胰島素表達(dá)的主要場所。目前2 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制并未完全明確，但眾多研究表明，2 型糖尿病的發(fā)病原因與胰島素抵抗和胰島β 細(xì)胞受損有密切關(guān)系[7-8]。圖1 和表1 研究了青錢柳水提物對(duì)大鼠胰島RINm5F 細(xì)胞的增殖作用，可以看出隨著青錢柳水提物濃度的提高，對(duì)RIN-m5F 細(xì)胞的增殖作用逐漸增大，但當(dāng)青錢柳水提物的質(zhì)量濃度大于50.0 μg/mL 后，青錢柳水提物對(duì)胰腺細(xì)胞的增殖作用逐漸減弱，這可能與低劑量興奮效應(yīng)有關(guān)[9]。低劑量興奮效應(yīng)指當(dāng)機(jī)體在受到外來因素的影響時(shí)，高劑量發(fā)生抑制，低劑量反而產(chǎn)生興奮效應(yīng)[10]。

從表1 可以看出，青錢柳水提物對(duì)RIN-m5F細(xì)胞的增殖作用并不是隨著時(shí)間的延長而增大的，培養(yǎng)時(shí)間為48 h 的OD 值普遍小于24 h，而由1b 圖中可以看出，在50.0 μg/mL 質(zhì)量濃度的青錢柳水提物作用24 h 下，對(duì)胰島RIN-m5F 細(xì)胞具有最顯著的增殖作用。另外由圖1c 可以看出，當(dāng)青錢柳水提物的質(zhì)量濃度大于250.0 μg/mL 時(shí)，且經(jīng)過48 h 的培養(yǎng)后，對(duì)胰島RIN-m5F 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

表1 青錢柳水提物對(duì)胰腺細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of Cyclocarya paliurus extract on proliferation of pancreatic cell

圖1 不同濃度青錢柳水提物對(duì)胰腺細(xì)胞增生率的影響Fig.1 The effect of Cyclocarya paliurus extract concentration on proliferation rate of pancreatic cell

從圖2 可以看出，50.0 μg/mL 青錢柳水提物作用組的胰島RIN-m5F 細(xì)胞數(shù)量明顯大于500 μg/mL 青錢柳水提物組，而500 μg/mL 青錢柳水提物組，與空白對(duì)照組數(shù)量相當(dāng)。這也說明了青錢柳水提物在低濃度時(shí)有促進(jìn)胰腺細(xì)胞增殖的作用，當(dāng)水提物達(dá)到一定濃度，則會(huì)抑制胰腺細(xì)胞的生長。

圖2 倒置顯微鏡視野下胰島RIN-m5F 細(xì)胞12 h 生長情況Fig.2 The growth of RIN-m5F cell for 12 h under inverted microscope

2.2 青錢柳水提物降血糖、降血脂功效研究

2.2.1 青錢柳水提物對(duì)小鼠體重的影響 在試驗(yàn)期間持續(xù)觀察各組小鼠的體重變化情況發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠攝食、飲水及排尿都正常；糖尿病模型組小鼠進(jìn)食、飲水及排尿量都有明顯增加。由表2 中14 d 和21 d 小鼠體重可以看出，青錢柳H 劑量組的體重（33.7，34.7 g）與STZ 組（30.1，31.5 g）有顯著性差異（P＜0.05），甚至比糖尿病常用降糖藥物格列本脲Gly 組（32.5 g）更接近空白組。這說明青錢柳水提物能促進(jìn)糖尿病小鼠體重正增長，有減輕糖尿病小鼠消瘦癥狀的作用。

表2 糖尿病小鼠體重（g）Table 2 The weight of experimental mice（g）

2.2.2 青錢柳水提物對(duì)糖尿病小鼠血糖血脂的影響 血糖升高是2 型糖尿病的主要特征之一，其癥狀表現(xiàn)為持續(xù)的血糖升高，并會(huì)在一定程度上導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，產(chǎn)生糖毒性[11]。血糖值從側(cè)面反映了胰島β 細(xì)胞的分泌功能[12]。從圖3a 中可以看出，STZ 造模組小鼠血糖高達(dá)837.8 mg/dL，說明成功誘導(dǎo)了糖尿病小鼠模型，且相對(duì)于空白對(duì)照組135.8 mg/dL 顯著升高，而青錢柳水提物各劑量組血糖值都低于造模組，其中青錢柳水提物M 組效果最顯著，血糖值降到506.3 mg/dL，比Gly 組616.0 mg/dL 降血糖效果更好。

糖尿病病人體內(nèi)利用糖的水平上升，儲(chǔ)存糖的水平相對(duì)低下，因此會(huì)繼發(fā)蛋白質(zhì)、甘油三酯等分解代謝加強(qiáng)。由圖3b 可看出，STZ 誘發(fā)組總蛋白值為4.7 g/dL，其它各劑量組總蛋白的恢復(fù)量都與STZ 誘發(fā)組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尤其青錢柳水提物M 組總蛋白最高，為5.4 g/dL，已經(jīng)超過Gly 組5.0 g/dL，說明一定濃度的青錢柳水提物具有恢復(fù)糖尿病小鼠總蛋白含量的作用。

2 型糖尿病是一種具有多種表型的疾病，其特征除了高血糖之外，還伴隨著血脂紊亂[13]。圖3c和圖3d 可以看出，與空白對(duì)照組相比，STZ 造模組的TG 和TC 水平顯著提高，而青錢柳水提物各劑量組可以明顯降低TG 和TC 水平，其中青錢柳水提物M 組的效果最佳。青錢柳水提物M 組的TG 值為152.3 mg/dL，與STZ 造模組200.0 mg/dL具有顯著性差異（P＜0.05），且與空白組TG 值143.5 mg/dL 比較接近。圖3d 中青錢柳水提物M組的TC 值132.5 mg/dL 與STZ 組170.0 mg/dL 對(duì)比，也具有顯著性差異，甚至比Gly 組157.8 mg/dL降膽固醇效果更為顯著。以上研究結(jié)果說明，青錢柳水提物可以改變糖尿病小鼠的血脂紊亂，其中以M 組效果最佳。

圖3 不同劑量組小鼠血糖、總蛋白、血脂、膽固醇變化Fig.3 The variation of blood glucose，total protein，triglycerides and cholesterol of different groups

2.3 青錢柳水提物抗發(fā)炎試驗(yàn)

2 型糖尿病的主要病理特征是胰島素抵抗和胰島β 細(xì)胞功能衰竭。隨著對(duì)2 型糖尿病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)與β 細(xì)胞功能衰竭有關(guān)，大量研究表明，炎癥因子如白細(xì)胞介素類、腫瘤壞死因子α、C 反應(yīng)蛋白和核因子-kB 等可以通過血液或旁分泌的作用影響胰島素的敏感性和β 細(xì)胞功能，因此，抑制炎癥因子能夠改善胰島素抵抗，保護(hù)胰島β 細(xì)胞[14-15]。由表3 可以看出，TPA 藥物組小鼠耳朵的腫脹度與空白組有顯著差異，在作用12 h 后TPA 誘發(fā)組與青錢柳各劑量組有顯著性差異，并且隨著作用時(shí)間的延長和青錢柳水提物濃度的增大，抗發(fā)炎效果在逐漸增強(qiáng)。與TPA誘發(fā)組相比，青錢柳水提物H 組作用12 h 和24 h后，小鼠耳朵的腫脹度分別降低26.9%和27.2%，大于消炎藥吲哚美辛（PC 組）。以上研究表明，青錢柳水提物具有很好的抗發(fā)炎效果。

表3 青錢柳水提物對(duì)小鼠耳朵抗發(fā)炎作用效果Table 3 The anti-inflammatory effect of Cyclocarya paliurus extract on the ears of mice

3 結(jié)論

2 型糖尿病作為遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性疾病，是一種復(fù)雜的糖代謝疾病，可引起多器官和組織功能失調(diào)[16]。隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年升高，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病。在生物活性成分的降血糖研究中，以STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型最為常用。STZ 對(duì)胰島β細(xì)胞具有高度選擇性毒性作用，會(huì)促使胰島β 細(xì)胞功能受損、胰島素合成減少，從而引發(fā)糖尿病[17]。然而大劑量注射STZ 易引起對(duì)胰島β 細(xì)胞的廣泛破壞而形成I 型糖尿病，小劑量多次注射STZ 又不易成功造模。煙酰胺（NA）可以有效清除STZ 產(chǎn)生的NO 及氧自由基，保護(hù)部分胰島β 細(xì)胞，從而對(duì)STZ 誘導(dǎo)的糖尿病起到預(yù)防作用[18]。本研究選用200.0 mg/kg 的NA 預(yù)先保護(hù)胰島β 細(xì)胞，再給與STZ 破壞，可以成功誘導(dǎo)2 型糖尿病[19-20]。此外，本文為了證實(shí)青錢柳水提物在預(yù)防糖尿病的效果，采用先給小鼠灌胃青錢柳各劑量組水提物，然后再誘發(fā)糖尿病的方式，以期探討其青錢柳水提物在預(yù)防糖尿病中的調(diào)節(jié)功效。

圖4 不同劑量組水提物對(duì)小鼠耳朵抗發(fā)炎作用效果Fig.4 The anti-inflammatory effect comparison of different groups

糖尿病是以胰島素抵抗或胰島β 細(xì)胞凋亡為病理基礎(chǔ)的代謝性疾病，眾多研究表明，2 型糖尿病的發(fā)生與胰島β 細(xì)胞受損有密切聯(lián)系[7]。本研究以大鼠胰島Rin-m5F 細(xì)胞研究青錢柳水提物對(duì)胰島β 細(xì)胞的增殖作用，由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，50.0 μg/mL 青錢柳水提物在作用24 h 時(shí)，胰島β細(xì)胞達(dá)到最佳增殖率71.0%，這表明青錢柳水提物可以通過保護(hù)胰島，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，達(dá)到預(yù)防糖尿病的作用。Zhao 等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，青錢柳乙醇提取物可以顯著降低活性氧族（ROS）的產(chǎn)生和胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，緩解STZ 對(duì)小鼠胰腺NIT-1 細(xì)胞的損傷，降低血糖。Xiao 等[22]對(duì)青錢柳葉降血糖的機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)青錢柳水提物可以通過調(diào)節(jié)MAPK 和Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而保護(hù)高脂和STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的胰島細(xì)胞，并緩解胰島β 細(xì)胞凋亡。栗靜[23-24]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討了青錢柳提取物預(yù)防糖尿病的作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)青錢柳提取物可以上調(diào)和胰腺細(xì)胞功能存活相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)，通過保護(hù)胰島，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，改善肝臟組織的異常代謝來預(yù)防糖尿病。這些與本試驗(yàn)的研究結(jié)果基本一致。

脂毒性導(dǎo)致的胰島素分泌功能障礙是罹患2型糖尿病的重要原因之一。除了高血糖之外，2 型糖尿病還伴隨著血脂紊亂，如總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平提高。本文研究結(jié)果顯示，青錢柳水提物各劑量組可以明顯降低STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖、血脂和血膽固醇水平，與STZ 造模組具有顯著性差異，表明適當(dāng)劑量的青錢柳水提物能有效調(diào)節(jié)脂肪代謝。Liu 等[25]研究表明青錢柳對(duì)糖尿病小鼠的降血脂作用與三萜物質(zhì)有關(guān)，三萜的含量與血脂水平呈負(fù)相關(guān)。

糖尿病的發(fā)生與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系，在糖尿病的早期、進(jìn)程及并發(fā)癥的發(fā)生過程中，氧化應(yīng)激都為重要原因之一[26]。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生會(huì)促進(jìn)促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，而這些促炎介質(zhì)會(huì)引起β 細(xì)胞的功能紊亂，從而引發(fā)胰島素抵抗和β 細(xì)胞凋亡。本研究表明，青錢柳水提物H 組對(duì)青錢柳小鼠耳朵有明顯的抗發(fā)炎效果，比PC 組消炎藥吲哚美辛抗發(fā)炎效果更顯著。栗靜[24]研究也表明，青錢柳提取物可以降低氧化應(yīng)激水平，降低炎癥因子TNF-α 和IL-6 的水平。Liu 等[27]從青錢柳葉中分離出多種具有顯著抗發(fā)炎活性的達(dá)瑪烷型三萜皂苷，其中11 種為新的3，4-seco-三萜皂苷，是未來潛在的天然抗炎藥物。

綜上所述，適當(dāng)濃度的青錢柳水提物，可以通過抑制炎癥、促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，從而保護(hù)胰島組織，降低血糖，調(diào)節(jié)脂肪代謝紊亂，以預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。青錢柳葉作為藥食同源的植物，含有多種重要的功能性物質(zhì)，在預(yù)防糖尿病中有顯著作用[28]。本研究為青錢柳的精深加工和功能食品的進(jìn)一步開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)和參考價(jià)值。