茶多酚對(duì)大黃魚肌肉5個(gè)基因片段mRNA穩(wěn)定性的影響

趙 進(jìn)，姚福軍，勵(lì)建榮，劉 軍，管 峰，葛 建，戴賢君

（1 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州310018 2 桐廬縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 杭州311502 3 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013）

目前關(guān)于魚類等水產(chǎn)品品質(zhì)及其新鮮度的研究，主要集中于貯藏期間保鮮和加工過程的控制，分析魚類等水產(chǎn)品貯藏期間的理化、感官、微生物評(píng)價(jià)指標(biāo)的變化，或是研究活體上的基因表達(dá)對(duì)肉質(zhì)性狀的影響，很少?gòu)暮怂峤到馑竭M(jìn)行分析和評(píng)價(jià)魚類等水產(chǎn)品品質(zhì)及其新鮮度的變化。動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解是受蛋白水解酶控制，具有高度選擇性、有規(guī)律性和依靠能量的特征[1]。已知有4 類蛋白水解酶體系涉及肌肉蛋白質(zhì)的水解，分別是：鈣蛋白酶系（Calpains/calpastatin）、溶酶體蛋白酶系統(tǒng)（Cathepsins）、泛素蛋白酶體（Ubiquitin-proteasome system）和凋亡蛋白酶類（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，Caspase）[2-4]。

Seear 等[5]是第1 個(gè)分析魚宰殺后肌肉中RNA完整性的研究者。Terova 等[6]提出在貯藏期間鱸魚肌肉中RNA 降解能夠被定量檢測(cè)，并且RNA 水平可以被作為貯藏時(shí)間長(zhǎng)、短的指示物。Zhao 等[7]研究大黃魚肌肉Cathepsin L基因片段的mRNA水平具有相對(duì)穩(wěn)定性，分析其與常規(guī)肉品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)具有高度相關(guān)性，提出把Cathepsin L基因片段的mRNA 水平作為評(píng)定大黃魚貯藏期間品質(zhì)新鮮度指標(biāo)的可行性。研究貯藏期間與大黃魚肌肉降解有關(guān)蛋白酶基因的mRNA 的相對(duì)穩(wěn)定性，開展茶多酚對(duì)大黃魚mRNA 貯藏穩(wěn)定性控制相關(guān)研究，具有重要的科研和應(yīng)用意義。

茶多酚（tea polyphenols，TP）是黃烷醇類、花色苷類、類黃酮類和酚酸類等酚類物質(zhì)的總稱，其為黃綠色固體粉末，在酸性范圍穩(wěn)定，當(dāng)pH 值大于8 時(shí)易氧化成紅褐色化合物[8]。目前，茶多酚功能具體表現(xiàn)為：1）抗氧化性，茶多酚中兒茶素類化合物對(duì)O2-、-OH 自由基的清除效果明顯[9]；2）抑菌性，茶多酚能夠增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，抑制微生物生長(zhǎng)[10]。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者研究表明茶多酚能夠顯著延長(zhǎng)水產(chǎn)品貨架期，表現(xiàn)為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，減緩TVB-N 與TBA 值增長(zhǎng)等方面，體現(xiàn)保鮮效果如鯽魚[11]、白鰱魚[12]、對(duì)蝦[13]、帶魚[14]、草魚[15]、大黃魚[16]、金槍魚[17]、大黃魚片[18]、羅非魚[19]和大菱鲆[20]等水產(chǎn)品。然而，針對(duì)茶多酚在保鮮水產(chǎn)品期間通過影響肌肉中mRNA 的穩(wěn)定性及其新鮮度的研究報(bào)道非常少。

本研究通過克隆獲得大黃魚5 個(gè)基因特異性片段cDNA 序列，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析冷藏期間大黃魚肌肉中5 個(gè)基因片段mRNA 的相對(duì)水平，闡釋茶多酚對(duì)魚貯藏期間肌肉mRNA 穩(wěn)定性的影響。通過量化宰后大黃魚肌肉樣品的mRNA 降解水平，從核酸水平解析茶多酚對(duì)大黃魚保鮮的分子機(jī)制，為生物保鮮劑控制魚肉品質(zhì)及其新鮮度評(píng)價(jià)提供新的研究思路和方向。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1）采集浙江舟山地區(qū)鮮活的大黃魚6 尾，魚體質(zhì)量為（500±30）g?；铘~運(yùn)至浙江省海洋食品加工質(zhì)量控制技術(shù)與儀器工程實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行低溫處理（魚和冰比為2∶1）30 min 致死，進(jìn)行解剖去魚頭和內(nèi)臟，滅菌雙蒸水洗凈魚體后分別取魚前半背部軸上軀干肌的白色肌肉組織的一部分。接下來在無菌環(huán)境下對(duì)肌肉進(jìn)行快速切片，樣品避免污染。每尾魚取10 小塊肌肉，一共取了60 塊魚片樣品，然后將大黃魚片樣品隨機(jī)分為2 組。

2）第1 組采用2 g 茶多酚溶解于1 L 滅菌雙蒸水（2 g/L）浸泡，第2 組采用滅菌雙蒸水浸泡，浸泡時(shí)間相同為60 min。每組樣品淋干后用滅菌蒸煮袋真空包裝置于0 ℃冰箱。分別在0，5，10，15和20 d 固定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)樣品，每組每次取魚肉樣品5 塊，立即液氮凍存，用于分析和檢測(cè)大黃魚基因在冷藏時(shí)期內(nèi)肌肉組織中的mRNA 相對(duì)水平。

3）茶多酚，純度為98%（茶多酚含量≥98%，其中兒茶素含量為≥70%，EGCG 含量為45%）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA、RNA 的提取和cDNA 的合成 杭州浩基生物科技有限公司提供試劑盒，按照說明書提取、電泳和檢測(cè)濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)cDNA的合成，應(yīng)用PCR 基因擴(kuò)增儀（Bio-Rad），試驗(yàn)步驟為在200 μL RNase-free 的離心管中混合下列成分：Total RNA 2 μg，Oligo（dT）18 1 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，加DEPC 處理水至15 μL；70℃，5 min 變性，立即放到冰上。然后依次加入下列試劑：5×First-strand Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，RNase inhibitor 25 units，SuperScriptTM II RTase（Invitrogen）200 units，混合上述成分離心，42 ℃溫育1 h，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大黃魚5 個(gè)基因片段cDNA 的同源克隆和blast 分析

1）基因cDNA 片段的同源克隆。參考Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)魚類種屬的基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（如表1），用于基因同源cDNA 片段的克隆。大黃魚肌肉組織的總cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增條件和體系如下所述。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒（TIANGEN）進(jìn)行純化，克隆到pUCm-T 載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化入JM109 感受態(tài)細(xì)胞，將陽性克隆送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 大黃魚5 個(gè)基因cDNA 片段擴(kuò)增所用的引物Table 1 Primers used for cloning five genes of Pseudosciaena crocea

2）PCR 擴(kuò)增反應(yīng) 第一輪PCR 反應(yīng)體系為25 μL：包含大黃魚cDNA（原液）0.5 μL，gene -F1（10μmol/L）1.0 μL、gene-R1（10μmol/L）1.0 μL，PlatinuM PCR Supermix High Fidelity（Invitrogen）22.5 μL。反應(yīng)條件是94 ℃，2 min；35 cycles：94 ℃，30 s；55～58 ℃，30 s；68 ℃，1 min。

第二輪PCR 反應(yīng)體系為25 μL。包含：第一輪PCR 產(chǎn)物0.5 μL，gene-F2（10 μmol/L）1.0 μL、gene-R2（10 μmol/L）1.0 μL，PlatinuM PCR Supermix High Fidelity（Invitrogen）22.5 μL。反應(yīng)條件是94 ℃，2 min；35 cycles：94 ℃，30 s；60～62 ℃，30 s；68 ℃，40 s。

3）Blast 分析。根據(jù)Genbank 上已經(jīng)提交的魚類基因cDNA 序列，在網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.blast 上通過BLAST 進(jìn)行比較分析5 個(gè)基因片段cDNA 序列。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

1）根據(jù)得到的大黃魚5 個(gè)基因的部分cDNA 片段，分別設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)分析引物（如表2），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）。

表2 大黃魚5 個(gè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR 所用的引物Table 2 Primers used for five genes of Pseudosciaena crocea Real-Time PCR

2）實(shí)時(shí)定量RT-PCR 擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)體系25 μL：ddH2O 10.5 μL，SYBR Premix ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR-F（10 μmol/L）0.5 μL，PCR-R（10 μmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，1 min；45 個(gè)循環(huán)：95 ℃10 s，60～63 ℃25 s（收集熒光），熔點(diǎn)曲線分析55～95 ℃。

3）實(shí)時(shí)定量RT-PCR 基因表達(dá)差異的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。每次樣品測(cè)定重復(fù)3 次，各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平以2（Ct 內(nèi)參基因－Ct 目的基因）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 微生物評(píng)價(jià)

采用平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（PCA）傾注法，按照GB 4789.2-2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》 要求進(jìn)行測(cè)定細(xì)菌總數(shù)（TVC），步驟如下：

魚肉樣品10 g，放入已滅菌蒸煮袋中，加入90 mL 的滅菌生理鹽水，均質(zhì)器拍打均勻成稀釋液，吸取稀釋液1 mL 注入含有9 mL 滅菌生理鹽水的試管里，振搖、混勻制成1∶100 的稀釋液。重復(fù)上述操作完成10 倍遞增魚肉樣品稀釋液。選擇適宜稀釋度的樣品均液，取1 mL 加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每培養(yǎng)皿中加入15 ～20 mL 滅菌液體培養(yǎng)基（PCA），搖勻。同時(shí)，分別吸取1 mL 空白稀釋液加入2 個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。靜置冷卻后將平板倒置，放入生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)（48±2）h。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Origin 8.0（OriginLab，Northampton，MA，USA）繪圖和SPSS 18.0（SPSS，Chicago，IL，USA）等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚樣品總RNA 提取和檢測(cè)

核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA 的OD260/OD280的比值均在1.89，說明RNA 的純度較高?？俁NA 的質(zhì)量濃度為159.25 ng/μL。

2.2 大黃魚5 個(gè)基因cDNA 片段克隆與序列分析

2.2.1 大黃魚5 個(gè)基因片段cDNA 克隆 以大黃魚cDNA 為模板，分別利用簡(jiǎn)并引物（如表1）gene-F1、gene-F2 和gene-R1、gene-R2 擴(kuò)增獲得了一條相應(yīng)長(zhǎng)度堿基的特異性條帶，與預(yù)期大小相同（如圖1）。

圖1 大黃魚5 個(gè)基因片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification result of Pseudosciaena crocea five genes cDNA sequence

2.2.2 大黃魚5 個(gè)基因cDNA 片段序列測(cè)序結(jié)果

圖3 大黃魚Calpain-2 基因cDNA 片段序列Fig.3 cDNA sequence of Pseudosciaena crocea Calpain-2 gene

圖4 大黃魚Calpastatin 基因cDNA 片段序列Fig.4 cDNA sequence of Pseudosciaena crocea Calpastatin gene

圖5 大黃魚MuRF-1 基因cDNA 片段序列Fig.5 cDNA sequence of Pseudosciaena crocea MuRF-1 gene

分別根據(jù)表格1 設(shè)計(jì)的引物gene-F1、gene-R1和gene-F2、gene-R2，擴(kuò)增后獲得2 個(gè)cDNA 合成片段具有部分重疊區(qū)域，將所得每個(gè)基因cDNA片段克隆測(cè)序并去除冗余序列后，用DNAStar 軟件中的SeqMan 程序進(jìn)行電子拼接，獲得相應(yīng)長(zhǎng)度基因片段序列（如圖2～圖6所示）。2.2.3 BLAST 分析大黃魚5 個(gè)基因cDNA 片段及蛋白質(zhì)氨基酸序列 通過同源克隆，分別測(cè)序得到相應(yīng)長(zhǎng)度堿基的cDNA 片段，經(jīng)過 BLAST（http：blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.Cgi）搜索，發(fā)現(xiàn)此片段與其它魚類同源性如表3所示。因此，相應(yīng)片段被確定為大黃魚特定的基因片段，每個(gè)基因序列已提交Genbank 注冊(cè)，獲得序列號(hào)分別為：Calpain-1（GeneBank no.KF527412），Calpain-2（GeneBank no.KF527413），Calpastatin（GeneBank no.KF527409），MuRF-1（GeneBank no.KF527410）和MuRF -2（GeneBank no.KF527411）。

圖2 大黃魚Calpain-1 基因cDNA 片段序列Fig.2 cDNA sequence of Pseudosciaena crocea Calpain-1 gene

圖6 大黃魚MuRF-2 基因cDNA 片段序列Fig.6 cDNA sequence of Pseudosciaena crocea MuRF-2 gene

表3 大黃魚5 個(gè)基因cDNA 片段序列的Blast 分析及蛋白質(zhì)氨基酸序列Table 3 Blast analysis of cDNA sequence of Pseudosciaena crocea five genes

（續(xù)表3）

2.3 大黃魚冷藏期間5 個(gè)基因的mRNA 相對(duì)水平分析

真空包裝0 ℃冷藏過程中，對(duì)照組和TP 處理組大黃魚肌肉5 個(gè)基因片段mRNA 相對(duì)水平分別如圖7～圖11所示。

2.3.1 大黃魚冷藏期間Calpain-1基因的mRNA相對(duì)水平變化規(guī)律 如圖7所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，對(duì)照組大黃魚在冷藏0，5，10，15和20 d 肌肉中mRNA 含量水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且不同貯藏天數(shù)Calpain-1基因mRNA 水平兩兩之間具有差異顯著性（P＜0.05），其中冷藏第5 天和第10 天之間Calpain-1基因mRNA 水平差異不顯著。宰殺當(dāng)天的大黃魚肌肉中Calpain-1基因mRNA 含量水平最高，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，統(tǒng)計(jì)分析得到大黃魚的Calpain-1基因mRNA 含量與冷藏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.757），表明冷藏時(shí)間對(duì)mRNA 降解有重要的影響作用。

同理，如圖7所示，0 ℃真空包裝貯藏期間，茶多酚處理組（TP）大黃魚片在冷藏0，5，10，15，20 d 肌肉中Calpain-1基因mRNA 含量水平具有相對(duì)穩(wěn)定性，而且其含量水平在整個(gè)冷藏期間TP 處理組與對(duì)照組具有極顯著差異性（P＜0.01），表明TP 保鮮處理能夠顯著抑制冷藏期間大黃魚肌肉中Calpain-1基因mRNA 的降解速度，延緩Calpain-1蛋白酶的活性表達(dá)，進(jìn)而延緩了肌肉中核酸降解腐敗變質(zhì)程度。TP 處理組在宰殺當(dāng)天魚片Calpain-1基因mRNA 含量水平最高，冷藏期間不同天數(shù)魚片Calpain-1基因mRNA 水平兩兩之間具有顯著差異性（P＜0.05），但在貯藏末期第15 天和第10 天之間差異不顯著。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析得到TP 處理組魚片在冷藏期間大黃魚肉中的Calpain-1基因mRNA 含量水平與冷藏時(shí)間呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.930），表明在茶多酚的保鮮作用下，冷藏時(shí)間和Calpain-1基因的mRNA 水平呈現(xiàn)更高度緊密的負(fù)相關(guān)性。

圖7 大黃魚在0 ℃貯藏過程中Calpain-1 基因mRNA 水平Fig.7 Calpain-1 mRNA levels of Pseudosciaena crocea during storage at 0 ℃

2.3.2 大黃魚冷藏期間Calpain-2基因的mRNA相對(duì)水平變化規(guī)律 如圖8所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，對(duì)照組大黃魚在冷藏期間Calpain-2基因的mRNA 含量水平呈現(xiàn)先上升再下降的波浪式趨勢(shì)，但是含量水平在冷藏第10 天達(dá)到最大值。在整個(gè)冷藏期間，Calpain-2基因mRNA 含量水平在不同天數(shù)兩兩之間呈現(xiàn)顯著差異性（P＜0.05），統(tǒng)計(jì)分析得到大黃魚的Calpain-2 基因mRNA 含量與冷藏時(shí)間不具備相關(guān)性（r=0.151），表明冷藏時(shí)間對(duì)Calpain-2基因mRNA含量水平的影響沒有明顯的規(guī)律。

圖8 大黃魚在0 ℃貯藏過程中Calpain-2 基因mRNA 水平Fig.8 Calpain-2 mRNA levels of Pseudosciaena crocea during storage at 0 ℃

同理，如圖8所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，茶多酚處理組（TP）大黃魚片肌肉中Calpain-2基因mRNA 含量水平具有相對(duì)穩(wěn)定性，最大值出現(xiàn)在貯藏第5 天，而且在整個(gè)冷藏期間TP處理組與對(duì)照組之間的Calpain-2基因mRNA 含量水平差異不顯著，表明TP 生物保鮮處理不能顯著抑制冷藏期間大黃魚肌肉中Calpain-2基因mRNA 的降解速度。TP 處理組魚片在冷藏第5 天Calpain-2基因mRNA 含量水平最高，冷藏期間不同天數(shù)Calpain-2基因mRNA 水平兩兩之間具有顯著差異性（P＜0.05），但在貯藏末期第0 天和第20 天之間差異不顯著。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析得到在冷藏期間，TP 處理組魚片Calpain-2基因mRNA 含量水平與冷藏時(shí)間也不具有相關(guān)性（r=-0.129），表明在茶多酚保鮮作用和冷藏時(shí)間對(duì)冷藏期間大黃魚肉Calpain-2基因的mRNA 降解速度和程度沒有明顯的影響效應(yīng)。

2.3.3 大黃魚冷藏期間Calpastatin基因的mRNA相對(duì)水平變化規(guī)律 如圖9所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，對(duì)照組大黃魚在冷藏期間Calpastatin基因的mRNA 含量水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，宰殺當(dāng)天其含量水平表現(xiàn)為最大值。在整個(gè)冷藏期間，Calpastatin基因mRNA 含量水平在不同天數(shù)兩兩之間呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05），統(tǒng)計(jì)分析得到大黃魚的Calpastatin基因mRNA 含量與冷藏時(shí)間具有高度相關(guān)性（r=-0.964），表明冷藏時(shí)間對(duì)Calpastatin基因mRNA 含量水平的影響明顯。

圖9 大黃魚在0 ℃貯藏過程中Calpastatin 基因mRNA 水平Fig.9 Calpastatin mRNA levels of Pseudosciaena crocea during storage at 0 ℃

同理，如圖9所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，茶多酚處理組（TP）大黃魚片肌肉中Calpastatin基因mRNA 含量水平在冷藏期間具有相對(duì)穩(wěn)定性，但是在整個(gè)冷藏期間TP 處理組與對(duì)照組之間的Calpastatin基因mRNA 含量水平具有顯著性差異（P<0.05），處理組的魚片中含量水平處于較低水平，表明TP 生物保鮮處理能夠顯著加速冷藏期間大黃魚肌肉中Calpastatin基因mRNA 的降解速度。TP 處理組魚片在宰殺當(dāng)天Calpastatin基因mRNA 含量水平最高，冷藏期間不同天數(shù)Calpastatin基因mRNA 水平兩兩之間具有顯著差異性（P<0.05），但在貯藏初期第0 天和第5 天之間差異不顯著。同時(shí)，相關(guān)分析得到在冷藏期間，TP處理組魚片Calpastatin基因mRNA 含量水平與冷藏時(shí)間具有高度相關(guān)性（r=-0.955），表明茶多酚保鮮作用，能夠明顯加快冷藏期間大黃魚肉Calpastatin基因的mRNA 降解速度，并且冷藏時(shí)間也能夠顯著影響其降解速度，進(jìn)而對(duì)魚肉的腐敗變質(zhì)產(chǎn)生影響。這個(gè)結(jié)果正好印證了Calpastatin 酶作為Calpain 酶特異性抑制劑的作用效應(yīng)，能夠解釋大黃魚中Calpastatin基因片段mRNA 的水平較低的情況下，Calpain-1基因片段的mRNA 含量水平反而維持較高的水平，說明試驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信度。

2.3.4 大黃魚冷藏期間MuRF-1基因的mRNA相對(duì)水平變化規(guī)律 如圖10所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，對(duì)照組大黃魚在冷藏期間MuRF-1基因的mRNA 含量水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，宰殺當(dāng)天其含量水平表現(xiàn)為最大值。在整個(gè)冷藏期間，MuRF-1基因mRNA 含量水平在不同天數(shù)兩兩之間呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），統(tǒng)計(jì)分析得到大黃魚的MuRF-1基因mRNA 含量與冷藏時(shí)間具有高度相關(guān)性（r=-0.965），表明冷藏時(shí)間對(duì)MuRF-1基因mRNA 含量水平的影響明顯。

同理，如圖10所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，茶多酚處理組（TP）大黃魚片肌肉中MuRF-1基因mRNA 水平在冷藏期間也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但是在整個(gè)冷藏期間TP 處理組與對(duì)照組之間的MuRF-1基因mRNA 含量水平具有極顯著差異（P<0.01），處理組的魚片中含量水平處于較高水平，表明TP 處理能夠顯著抑制冷藏期間大黃魚肌肉中MuRF-1基因mRNA 的降解速度。TP 處理組魚片在宰殺當(dāng)天MuRF-1基因mRNA 含量水平最高，冷藏期間不同天數(shù)MuRF-1基因mRNA 水平兩兩之間具有顯著性差異（P<0.05）。同時(shí)，相關(guān)分析得到在冷藏期間，TP 處理組魚片MuRF-1基因mRNA 含量水平與冷藏時(shí)間具有高度相關(guān)性（r=-0.983），表明茶多酚處理能夠明顯抑制冷藏期間大黃魚肉MuRF-1基因的mRNA 降解速度，冷藏時(shí)間也能夠顯著影響其降低速度，進(jìn)而對(duì)魚肉的新鮮度產(chǎn)生影響。

圖10 大黃魚在0 ℃貯藏過程中MuRF-1 基因mRNA 水平Fig.10 MuRF-1 mRNA levels of Pseudosciaena crocea during storage at 0 ℃

2.3.5 大黃魚冷藏期間MuRF-2基因的mRNA相對(duì)水平變化規(guī)律 如圖11所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，對(duì)照組大黃魚在冷藏期間MuRF-2基因的mRNA 含量水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，宰殺當(dāng)天其含量水平表現(xiàn)為最大值。在整個(gè)冷藏期間，MuRF-2基因mRNA 含量水平在不同天數(shù)兩兩之間呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），統(tǒng)計(jì)分析得到大黃魚的MuRF-2基因mRNA 含量與冷藏時(shí)間具有高度相關(guān)性（r=-0.915），表明冷藏時(shí)間對(duì)MuRF-2基因mRNA 含量水平的影響明顯。

同理，如圖11所示，0 ℃真空包裝低溫貯藏過程中，茶多酚處理組（TP）大黃魚片肌肉中MuRF-2基因mRNA 水平在冷藏期間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且在整個(gè)冷藏期間TP 處理組與對(duì)照組之間的MuRF-2基因mRNA 含量水平具有極顯著差異（P<0.01），處理組的魚片中含量處于較高水平，表明TP 生物保鮮處理能夠顯著抑制冷藏期間大黃魚肌肉中MuRF-2基因mRNA 的降解速度。TP 處理組魚片在宰殺第10 天MuRF-2基因mRNA 含量水平最高，冷藏期間不同天數(shù)MuRF-2基因mRNA 水平兩兩之間具有顯著性差異（P<0.05）。同時(shí)，相關(guān)分析得到在冷藏期間，TP 處理組魚片MuRF-2基因mRNA 含量水平與冷藏時(shí)間具有一定的相關(guān)性（r=-0.654），表明茶多酚保鮮能夠一定程度抑制冷藏期間大黃魚肉MuRF-2基因片段的mRNA 降解速度，冷藏時(shí)間也能夠顯著影響其降低速度，進(jìn)而對(duì)魚肉的腐敗變質(zhì)產(chǎn)生影響。

圖11 大黃魚在0 ℃貯藏過程中MuRF-2 基因mRNA 水平Fig.11 MuRF-2 mRNA levels of Pseudosciaena crocea during storage at 0 ℃

2.4 微生物菌落數(shù)（TVC）變化

通常新鮮魚肉的TVC 值為102～104CFU/g，水產(chǎn)品微生物種類及數(shù)量受多種因素影響，如品種、生活環(huán)境、加工、儲(chǔ)存和銷售等環(huán)節(jié)中微生物的污染，特別是魚肉貯藏環(huán)境和溫度的影響。研究結(jié)果顯示，0 ℃冷藏期間大黃魚肌肉樣品對(duì)照組和TP組都具有較好的初始品質(zhì)，在貯藏期末（20 d）的樣品微生物總數(shù)分別為8.4 lg（CFU/g）和6.9 lg（CFU/g），對(duì)照組和TP 處理組樣品的菌落總數(shù)之間存在極顯著差異（P＜0.01）。與我們前期的研究結(jié)果一致，表明0.2%的茶多酚處理能夠有效抑制大黃魚0 ℃冷藏期間微生物菌落的生長(zhǎng)與繁殖[18]。

在0 ℃冷藏期間，對(duì)照組和TP 處理組的線性回歸方程分別為y（對(duì)照組）= 0.256x+3.59，R2=0.983，P＜0.05；y（TP）=0.190x+3.385，R2=0.988，P＜0.05。以7 lg（CFU/g）作為水產(chǎn)品微生物的腐敗臨界值，根據(jù)上述回歸方程可以得出，0 ℃冷藏期間真空包裝條件下對(duì)照組和0.2%茶多酚處理組的大黃魚片樣品貨架期分別為13.32 d 和19.03 d。

3 結(jié)論

目前，關(guān)于魚類貯藏期間肉質(zhì)新鮮度的分析與評(píng)價(jià)，大部分研究都是側(cè)重于分析其死后的色、味、形和微生物繁殖等方面，或是研究魚宰殺之前基因?qū)ζ淙赓|(zhì)性狀的影響效應(yīng)。而本研究針對(duì)貯藏期間大黃魚肌肉核酸降解水平，運(yùn)用熒光定量PCR 分子生物學(xué)技術(shù)分析，克隆、篩選和鑒定了大黃魚5 個(gè)特異性的基因片段cDNA，結(jié)果顯示冷藏期間大黃魚肌肉中Calpain-1、Calpastatin、MuRF-1和MuRF-2等4 個(gè)基因片段mRNA 具有相對(duì)穩(wěn)定性，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)mRNA 水平呈下降趨勢(shì)，與貯藏時(shí)間顯示為顯著負(fù)相關(guān)性。同時(shí)，大黃魚貯藏期間肌肉微生物指標(biāo)可以佐證茶多酚對(duì)冷藏大黃魚肌肉的新鮮度保持作用，進(jìn)而解釋了茶多酚處理對(duì)大黃魚肌肉的核酸降解規(guī)律的影響效應(yīng)，是通過影響肌肉核酸分子mRNA 穩(wěn)定性，從而控制大黃魚肌肉的新鮮度，為研究冷藏期間茶多酚對(duì)魚肉品質(zhì)控制機(jī)理提供了新的思路和方向。因此，結(jié)合評(píng)價(jià)魚肉品質(zhì)，可以更準(zhǔn)確地闡釋大黃魚在冷藏期間新鮮度變化的內(nèi)在機(jī)理，使得常規(guī)的肉品質(zhì)指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果更具可靠性，分析結(jié)果更具科學(xué)性和準(zhǔn)確性。