毛細(xì)管電泳分析河蜆湯與巨噬細(xì)胞的相互作用

鄒堅(jiān)橋，高觀禎，楊多佳，汪惠勤，柯李晶*，彭彰文，周建武，饒平凡，金義光，余兆碩，羅思浩

（1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035 2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京100850）

毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離場(chǎng)所，在高壓電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)力下，帶電粒子依據(jù)淌度和分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)快速分離的電泳技術(shù)，具有高效、簡(jiǎn)便、檢出限低、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，毛細(xì)管電泳廣泛應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜的食品檢測(cè)分析，例如Li等[1]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測(cè)食品中的納他霉素含量；田春秋等[2]利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)牛奶中的青霉素中間體以及3 種青霉素類藥物；劉鳴暢等[3]將毛細(xì)管電泳用于檢測(cè)摻假燕窩中銀耳成分。基于不同細(xì)胞和不同生理活性條件下細(xì)胞表面帶電性的差異，毛細(xì)管電泳是細(xì)胞分離分析的有效手段。例如Lu 等[4]利用毛細(xì)管電泳鑒別不同動(dòng)物的紅細(xì)胞；溫桂蘭等[5]采用毛細(xì)管電泳研究釀酒酵母凋亡細(xì)胞。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，具有識(shí)別、吞噬和清除凋亡細(xì)胞及非功能性的胞外成分等功能，其在不同環(huán)境和生理?xiàng)l件下有著明顯的形態(tài)和功能差異[7-9]，常作為評(píng)估食品組分對(duì)人體作用的試驗(yàn)細(xì)胞模型。程安瑋等[10]發(fā)現(xiàn)甘草多糖能激活巨噬細(xì)胞，提高其吞噬能力和能量代謝水平，同時(shí)可分泌多種具有殺瘤作用的活性因子；Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)豬骨湯中納米膠粒與巨噬細(xì)胞作用后，被迅速內(nèi)化，防止活性氧自由基引起的線粒體功能障礙和吞噬抑制；杜華英等[12]認(rèn)為河蜆糖蛋白通過(guò)影響巨噬細(xì)胞吞噬能力來(lái)發(fā)揮免疫活性。李杰萍等[6]利用毛細(xì)管電泳定量分析巨噬細(xì)胞中5-脂氧合酶信使核糖核酸表達(dá)。然而，目前尚未見用毛細(xì)管電泳分離巨噬細(xì)胞的研究。

河蜆湯具有良好的保肝護(hù)肝功效，在煮湯過(guò)程中產(chǎn)生大量的自組裝活性納米膠粒[13-15]，納米膠粒被攝食進(jìn)入消化道后，首先與包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的黏膜細(xì)胞發(fā)生相互作用，其效應(yīng)不明。作者先期研究已建立河蜆湯納米膠粒的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離分析方法[16]。本文以河蜆湯為例，嘗試?yán)妹?xì)管區(qū)帶電泳，觀測(cè)河蜆湯與巨噬細(xì)胞作用后湯的多尺度組分與納米膠粒的變化，以及巨噬細(xì)胞相應(yīng)的表觀形貌、表面電荷和功能的變化，以期建立一種簡(jiǎn)便、快速的研究食品成分-人體相互作用的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將河蜆（臺(tái)灣花蓮立川漁場(chǎng)饋贈(zèng)）與水按物料比1∶1 煮沸60 min，冷卻后紗布過(guò)濾，濾過(guò)液即為粗制的河蜆湯。

胎牛血清（FBS），購(gòu)于以色列Biological Industries 公司；0.25%胰酶消化液、青霉素-鏈霉素混合溶液、DMEM 培養(yǎng)基、D-Hank's 細(xì)胞平衡液等細(xì)胞培養(yǎng)試劑，購(gòu)于杭州蒂恩延源科技有限公司；甲醇（色譜純）、硼酸、硼砂、二水合磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉、葡萄糖等試劑，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用試劑除特別說(shuō)明外均為分析純，水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

SD 大鼠（SPF 級(jí)，180～200 g）由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀及非涂層石英毛細(xì)管，購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter 公司；CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)于日本Hitachi Koki 公司；1300SeriesⅡ生物安全柜，購(gòu)于美國(guó)Thermo Forma公司；Scepter 2.0 手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器，購(gòu)于美國(guó)Molecular Devices 公司；NU-8500 二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)于美國(guó)NUAIRE 公司；DMI3000B 熒光倒置顯微鏡，購(gòu)于美國(guó)Leica 公司；VCX750 超聲破碎儀，購(gòu)于美國(guó)Sonics&Materials 公司；Costar3470培養(yǎng)平板，購(gòu)于美國(guó)Coming 公司。

1.3 方法

1.3.1 河蜆湯、河蜆湯納米膠粒樣品制備 將粗制的河蜆湯經(jīng)5 000 g 離心10 min 后，得到的上清液即為河蜆湯樣品（Clam soup）。取上述河蜆湯置于100 ku 超濾離心管內(nèi)，4 ℃下5 000 g 離心30 min，超純水重懸離心3 次，最終截留部分重懸即可得到河蜆湯納米膠粒（UF-NPs），濾過(guò)部分即為河蜆湯超濾濾過(guò)液（UF-solution）。3 個(gè)樣品凍干后置于-30 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 原代大鼠巨噬細(xì)胞的提取與純化 將大鼠脫頸處死后，在75%酒精中浸泡3 min，注射DMEM 培養(yǎng)基10 mL 于腹腔內(nèi)，輕柔大鼠腹部3 min，靜置7 min。在無(wú)菌條件下剪開大鼠腹腔，小心吸取腹腔液體至離心管中。以2 000 r/min，23℃水平離心5 min，去上清，加10 L 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至25 mm 培養(yǎng)皿后置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。待巨噬細(xì)胞基本貼壁后，用PBS 沖洗2～3 次，再重新加入培養(yǎng)基置于恒溫箱中培養(yǎng)，達(dá)到純化巨噬細(xì)胞的目的。試驗(yàn)遵照浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（編號(hào)：No.2016R10031）。

1.3.3 巨噬細(xì)胞懸浮液制備 用2.5%胰酶消化液消化培養(yǎng)皿中的巨噬細(xì)胞，以2 000 r/min，23℃水平離心5 min，去上清，再加入含4.6%葡萄糖的0.02 mol/L，pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次，最終通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器制備不同細(xì)胞濃度的巨噬細(xì)胞懸浮液。為了保持活細(xì)胞的表面特性，須每次試驗(yàn)前新鮮制備細(xì)胞懸液。

1.3.4 巨噬細(xì)胞與河蜆湯中組分的相互作用 稱取河蜆湯、UF-NPs 和UF-solution 凍干粉，用DHank's 細(xì)胞平衡液配置成質(zhì)量濃度為3，1，2 mg/mL 的溶液，過(guò)0.22 μm 無(wú)菌過(guò)濾膜。將3 種樣品加入已貼壁24 h 的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為300×104個(gè)/mL，置于培養(yǎng)箱中共孵育。

1.3.5 電泳條件 毛細(xì)管在第1 次運(yùn)行前用甲醇、1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液分別沖洗5，30，10，20 min；樣品間用0.1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液分別沖洗3，5，10 min。

1.3.5.1 河蜆湯、河蜆湯納米膠粒和河蜆湯超濾濾過(guò)液電泳條件[16]非涂層石英毛細(xì)管柱62 cm×50 μm，有效長(zhǎng)度52 cm；運(yùn)行緩沖液為0.05 mol/L 硼酸硼砂緩沖液，pH 8.7；分離電壓20 kV，壓力（0.5 psi）進(jìn)樣10 s，分離柱溫25 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

1.3.5.2 巨噬細(xì)胞電泳條件 非涂層石英毛細(xì)管柱65 cm×150 μm，有效長(zhǎng)度58 cm；運(yùn)行緩沖液為：分離電壓15 kV，壓力（0.3 psi）進(jìn)樣15 s，分離柱溫25 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 巨噬細(xì)胞的毛細(xì)管電泳行為

巨噬細(xì)胞的緩沖液條件參考Lu 等[4]，選定含4.6%葡萄糖的0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。由于細(xì)胞濃度會(huì)直接影響巨噬細(xì)胞的聚集程度和進(jìn)樣量，從而影響巨噬細(xì)胞的毛細(xì)管電泳表現(xiàn)。試驗(yàn)配制5 個(gè)不同濃度的巨噬細(xì)胞懸浮液，分別為5×104，10×104，30×104，60×104，150×104個(gè)/mL（依濃度換算進(jìn)樣細(xì)胞個(gè)數(shù)為32，64，191，382，955個(gè)），考察巨噬細(xì)胞的毛細(xì)管電泳行為，結(jié)果見圖1。

通過(guò)對(duì)比150×104個(gè)/mL 高濃度細(xì)胞破碎前后的毛細(xì)管電泳圖（圖1e、1f）可知，正常的巨噬細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)多個(gè)紫外吸收峰，而破碎后的巨噬細(xì)胞僅在6～7 min 出現(xiàn)了吸收值低且拖尾嚴(yán)重的小峰，這可能是大量的細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)容物造成的，故證明毛細(xì)管電泳可以有效地區(qū)分完整的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞碎片。

從圖1a～圖1e 可以看出，細(xì)胞濃度會(huì)影響細(xì)胞的遷移時(shí)間和出峰個(gè)數(shù)，其中細(xì)胞的遷移時(shí)間隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加而延長(zhǎng)，范圍在7～13 min 之內(nèi)，這說(shuō)明巨噬細(xì)胞濃度與巨噬細(xì)胞的毛細(xì)管電泳行為間存在高度響應(yīng)性。同時(shí)，細(xì)胞存在遷移時(shí)間不穩(wěn)定、出峰個(gè)數(shù)易變的特點(diǎn)，分析原因可能是因?yàn)榧?xì)胞聚集導(dǎo)致表面電位改變[17]，不同細(xì)胞周期的細(xì)胞表面帶電性不同[18-19]，細(xì)胞與毛細(xì)管的吸附等。這一現(xiàn)象說(shuō)明了高靈敏度的毛細(xì)管電泳可以檢測(cè)到巨噬細(xì)胞群體中細(xì)微差異，也符合動(dòng)物組織分離制得的原代細(xì)胞往往包含處于不同周期或分化狀態(tài)的細(xì)胞個(gè)體。原代分離的巨噬細(xì)胞常常同時(shí)包含M1 和M2 兩種活化類型，毛細(xì)管電泳中的多個(gè)細(xì)胞峰是否對(duì)應(yīng)不同活化類型的細(xì)胞，有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

圖1 不同濃度的巨噬細(xì)胞毛細(xì)管電泳圖Fig.1 Electropherogram of different concentration of macrophages by CE

2.2 巨噬細(xì)胞與河蜆湯組分的相互作用

2.2.1 巨噬細(xì)胞-河蜆湯混懸液中可溶性成分的變化 河蜆湯中組分與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)2 h后，小心吸取上清液，4 ℃下2 000 r/min 離心10 min，采用毛細(xì)管電泳分離分析上清的成分，結(jié)果如圖2所示。

從圖2c 可知，河蜆湯納米膠粒在毛細(xì)管電泳中遷移時(shí)間為4.6 min，與前期研究結(jié)果一致[16]。采用激光動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)得UF-NPs 的平均水合粒徑和Zeta 電位分別為（69.6±0.8）nm 和（-13.4±0.6）mV，光散射成像法（Nanosight NS300）測(cè)定納米膠粒數(shù)量為（43.2±0.6）×108particles/mL。

比較河蜆湯與巨噬細(xì)胞作用前后的電泳圖譜，可知河蜆湯與巨噬細(xì)胞混懸液中的成分既有原生成分的減少或消失（以數(shù)字1、2、3 表示），也生成了一些新成分（以字母A、B、C、D 表示）。河蜆湯及其超濾濾過(guò)液中的1、2、3 號(hào)物質(zhì)的紫外吸收峰面積明顯減少，其中2 號(hào)完全消失，河蜆湯納米膠粒中的2 號(hào)物質(zhì)也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，表明巨噬細(xì)胞吞噬吸收了河蜆湯中的組分。前期研究已知經(jīng)分子篩色譜分離的河蜆湯中的大分子組分（蛋白多糖）和小分子組分，在湯的毛細(xì)管電泳分離中的泳動(dòng)時(shí)間分別為7.5～9.5 min 和4.3 min[16]；對(duì)照?qǐng)D2 可知，1 號(hào)組分為河蜆湯的小分子成分，2、3 號(hào)組分為湯中的大分子組分。其中，2 號(hào)組分在超濾分離的河蜆湯伴生納米膠粒中也少量存在，其分子質(zhì)量應(yīng)該接近超濾截留的分子質(zhì)量10 ku，又根據(jù)河蜆湯納米膠粒的主要成分為蛋白多糖[15]，湯中很可能存在這類蛋白多糖單體，推測(cè)具有紫外吸收且分子質(zhì)量較大的2 號(hào)組分可能是蛋白多糖單體。1 號(hào)和3 號(hào)組分究竟為何種化合物，尚有待進(jìn)一步研究。

圖2 河蜆湯（a）、河蜆湯超濾濾過(guò)液（b）、河蜆湯納米膠粒（c）與巨噬細(xì)胞作用2 h 前后的毛細(xì)管電泳圖Fig.2 Electropherogram of clam soup（a），UF-solution（b），UF-NPs（c）interact with macrophages before and after 2 h

作用2 h 后的混懸液出現(xiàn)了原本不存在的新物質(zhì)A、B、C、D，表明在短時(shí)間內(nèi)河蜆湯中組分即可刺激巨噬細(xì)胞分泌新的物質(zhì)，或被細(xì)胞降解、代謝產(chǎn)生新的物質(zhì)。河蜆湯的主成分為蛋白和多糖[15]，可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[20-21]，新物質(zhì)A、B、C、D 是否為細(xì)胞因子尚有待進(jìn)一步研究。

2.2.2 巨噬細(xì)胞-河蜆湯混懸液中納米膠粒的變化 為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞對(duì)河蜆湯組分的吞噬情況，用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的河蜆湯納米膠粒，加入已貼壁24 h的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為300×104個(gè)/mL。置于培養(yǎng)箱中分別孵育24 h 和48 h 后，小心吸取上清液置于超濾管中，4 ℃下5 000 g 離心至溶液全部透過(guò)，用硼酸硼砂運(yùn)行緩沖液重懸后，利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 與巨噬細(xì)胞作用24 h 和48 h 后河蜆湯超濾截留納米膠粒變化情況Table 1 The modification of UF-NPs with macrophage for 24 h and 48 h

試驗(yàn)結(jié)果表明，河蜆湯納米膠粒與巨噬細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間作用后，峰面積值明顯減少。24 h 后峰值減少6%，細(xì)胞吞噬納米膠粒的數(shù)量約為8.7×102particles/cell，48 h 后峰面積值減少15%，細(xì)胞吞噬納米膠粒數(shù)量約為2.13×103particles/cell。由此可知，48 h 內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)河蜆湯中納米膠粒有持續(xù)性吞噬的作用。Li 等[22]研究發(fā)現(xiàn)24 h 內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)不同形態(tài)糖納米膠粒具有持續(xù)吞噬現(xiàn)象，其中球形納米膠粒的內(nèi)化數(shù)量顯著高于圓柱形，其內(nèi)化機(jī)制是通過(guò)氯氰菊酯和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，可為研究巨噬細(xì)胞吞噬河蜆湯納米膠粒的機(jī)制提供參考。

2.2.3 河蜆湯納米膠粒對(duì)巨噬細(xì)胞電泳行為的影響 將1.3.4 節(jié)中河蜆湯納米膠粒作用2 h 后的巨噬細(xì)胞，按1.3.3 節(jié)的方法制成20×104個(gè)/mL 和150×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，考察河蜆湯納米膠粒對(duì)巨噬細(xì)胞電泳行為的影響，如圖3所示。

圖3 巨噬細(xì)胞與河蜆湯納米膠粒作用2 h 前后的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.3 Electropherogram of macrophages interact with UF-NPs before and after 2 h

從圖3 可知，河蜆湯納米膠粒作用2 h 后的巨噬細(xì)胞，與初始狀態(tài)的巨噬細(xì)胞相比，其電泳遷移率加快，遷移時(shí)間縮短。細(xì)胞在20×104個(gè)/mL 低濃度時(shí)，出峰時(shí)間提前2.42 min；在150×104個(gè)/mL高濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞整體的出峰時(shí)間提前了2.24 min，具有一致性。細(xì)胞電泳淌度是表征細(xì)胞表面電荷的參數(shù)之一[23]，因此，細(xì)胞出峰時(shí)間改變的原因可能是巨噬細(xì)胞吞噬河蜆湯納米膠粒后，細(xì)胞膜電位發(fā)生變化，降低巨噬細(xì)胞的表面電荷，減小荷質(zhì)比而加快其電泳遷移率。

2.2.4 河蜆湯納米膠粒對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響為了考察河蜆湯中組分對(duì)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)生理狀態(tài)及形態(tài)的影響，將質(zhì)量濃度為1 mg/mL 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基配制的河蜆湯納米膠粒溶液，加入已貼壁24 h 的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)皿中。置于培養(yǎng)箱中分別作用0，0.5，1，2 h 后進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。

圖4 巨噬細(xì)胞與河蜆湯納米膠粒作用前、后的形態(tài)變化（200×）Fig.4 The picture of macrophages' morphological changes at different time interact with UF-NPs（200×）

從圖4 可知，加入河蜆湯納米膠粒0.5，1，2 h后的巨噬細(xì)胞，在形態(tài)上與加入之前相比出現(xiàn)了顯著變化，細(xì)胞快速拉長(zhǎng)并呈梭狀分化，這一現(xiàn)象表明河蜆湯納米膠粒能快速促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化。巨噬細(xì)胞活化為M1 型和M2 型時(shí)，膜電位分別表現(xiàn)為增加（去極化）和減少（超極化），巨噬細(xì)胞拉長(zhǎng)形變常常與M2 型活化有關(guān)；而河蜆湯納米膠粒具有消除自由基的活性，胞內(nèi)自由基水平的降低可引起細(xì)胞膜超極化而降低膜電位，這與上述細(xì)胞毛細(xì)管電泳遷移率的測(cè)定結(jié)果相一致。由此推斷，巨噬細(xì)胞在內(nèi)化河蜆湯納米膠粒后，被誘導(dǎo)活化為M2 型巨噬細(xì)胞[24-25]，可表現(xiàn)出炎癥抑制作用。這一推斷尚需進(jìn)一步用特異性抗體標(biāo)記等方法來(lái)確證。

綜上，毛細(xì)管區(qū)帶電泳可用于分析細(xì)胞與復(fù)雜食品體系中單體組分和納米級(jí)聚集體的相互作用；對(duì)比其它常用方法，如流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫法、熒光染色法等[22]，具有樣品前處理簡(jiǎn)單、分辨率高、快速無(wú)損等優(yōu)勢(shì)，并可同時(shí)測(cè)定細(xì)胞、食品組分各自在互作后的變化；但單獨(dú)使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，無(wú)法直接鑒定未知成分。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，原代大鼠巨噬細(xì)胞可被毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離，操作簡(jiǎn)單、方便快速、靈敏度高；但存在細(xì)胞遷移時(shí)間易受細(xì)胞濃度影響、出峰個(gè)數(shù)多、重現(xiàn)性不佳等問題，有待進(jìn)一步研究解決。同時(shí)，毛細(xì)管區(qū)帶電泳可靈敏檢測(cè)河蜆湯組分與巨噬細(xì)胞作用前后的變化，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞會(huì)選擇性吸收河蜆湯中可溶性組分，持續(xù)內(nèi)吞湯中的自組裝納米膠粒，發(fā)生活化（可能為M2 型）而產(chǎn)生形態(tài)學(xué)改變，并影響細(xì)胞的毛細(xì)管電泳行為，同時(shí)在細(xì)胞上清中可檢測(cè)到4 種新生成分。

本研究證實(shí)毛細(xì)管電泳可用于包括溶質(zhì)與膠體顆粒在內(nèi)的食品多尺度組分與細(xì)胞互作過(guò)程的快速分析，表征二者各自的成分和表面荷電性的變化，是研究食品組分-人體相互作用的一種新方法，如與光散射、質(zhì)譜、特異性熒光標(biāo)記等檢測(cè)手段聯(lián)用，則可以進(jìn)一步提高方法的準(zhǔn)確性，獲取更豐富的成分和細(xì)胞生理信息。