洋蔥γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶AcGGT的克隆與鑒定

徐歡歡，李逸，高偉，王永勤，劉樂(lè)承

洋蔥γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的克隆與鑒定

徐歡歡1,2，李逸1，高偉1，王永勤2，劉樂(lè)承1

1長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434025；2北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097

【】蔥屬植物代謝產(chǎn)生的蒜氨酸具有重要的藥學(xué)價(jià)值，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是蒜氨酸合成中作為脫谷氨?；襟E的關(guān)鍵酶。研究洋蔥γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因的功能，揭示γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在洋蔥蒜氨酸合成途徑中的作用，為體外合成蒜氨酸提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步深入研究洋蔥蒜氨酸合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。以洋蔥為材料，依據(jù)洋蔥RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR從洋蔥中克隆γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建CaMV 35S-AcGGT-GFP載體，利用微粒轟擊技術(shù)，以金粉-質(zhì)粒微載體轟擊洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，構(gòu)建帶有的釀酒酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)表達(dá)，利用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺的方法測(cè)定轉(zhuǎn)入的釀酒酵母總蛋白的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析該基因在洋蔥組織間差異表達(dá)模式；利用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺的方法測(cè)定組織間內(nèi)源性轉(zhuǎn)肽酶酶活性?？寺～@得，長(zhǎng)度為1 869 bp；生物學(xué)信息學(xué)分析顯示，洋蔥編碼622個(gè)氨基酸，蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示具有谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，跨膜區(qū)分析推測(cè)GGT蛋白具有跨膜區(qū)，氨基酸多重比對(duì)結(jié)果顯示植物中的GGT具有一定的保守性，進(jìn)化分析表明AcGGT與大蒜AsGGT2親緣關(guān)系最接近。CaMV 35S-AcGGT-GFP融合蛋白的熒光信號(hào)位于液泡中，表明該基因編碼蛋白位于液泡。外源表達(dá)AcGGT蛋白的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入的酵母谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性顯著高于對(duì)照，表明編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶活性。組織差異表達(dá)結(jié)果分析顯示，該基因的表達(dá)主要在葉鞘，鱗莖和葉鞘次之；不同組織谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性顯示，在葉中活性最高，葉鞘次之。相關(guān)性分析顯示組織間谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性與表達(dá)相關(guān)性不顯著。克隆了洋蔥。洋蔥蒜氨酸合成途徑中脫谷氨酰化先于S-加氧。的表達(dá)與洋蔥內(nèi)源性的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性相關(guān)性不顯著，洋蔥中可能存在多個(gè)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因。

洋蔥；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；生物信息學(xué)；亞細(xì)胞定位；真核表達(dá)；表達(dá)模式

0 引言

【研究意義】洋蔥（L.）是蔥屬二年生草本植物，富含多種活性物質(zhì)[1-4]。其中，含硫化合物是洋蔥風(fēng)味物質(zhì)的主要成分，使洋蔥不僅具有食用價(jià)值還有藥用價(jià)值[5-6]。大量研究表明這類物質(zhì)具有抗氧化活性，并且在抗癌細(xì)胞增殖和降低糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)中起重要作用[7-11]。蒜氨酸是洋蔥中重要的含硫化合物，也是大蒜素合成的前體，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）作為脫谷氨?；竻⑴c蒜氨酸合成途徑[12-14]。因此，克隆洋蔥并鑒定功能，闡明該基因在蒜氨酸合成途徑中的作用，對(duì)利用分子設(shè)計(jì)育種改善洋蔥品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在蒜氨酸生物合成途徑中，GGT能夠催化γ-谷氨酰基從γ-谷氨?；囊浦疗渌?，使γ-谷酰胺半胱氨酸化合物脫去谷氨?；a(chǎn)生脫氧蒜氨酸（S-allyl-L-cysteine，SAC）[15-17]。因此，GGT作為脫谷氨酰化酶參與蒜氨酸的合成，是蒜氨酸合成的重要步驟。前人利用(NH4)2SO4沉淀和疏水作用層析（苯基-瓊脂糖柱）的方法從枯草芽孢桿菌[18]、番茄果實(shí)[19]、香菇[20]、大蒜[21]和洋蔥[22-24]中純化獲得GGTs并對(duì)蛋白的部分特性進(jìn)行了鑒定。這些研究中發(fā)現(xiàn)，GGT通常由1個(gè)主要亞基和1個(gè)次要亞基組成[24]。其中，大蒜GGTs相對(duì)分子質(zhì)量為68 kD，由2個(gè)異質(zhì)亞基54和14 kD組成[21]。在洋蔥中，發(fā)芽鱗莖的GGT由36—39 kD大亞基和25 kD小亞基組成，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)休眠鱗莖中的GGTs為55 kD亞基和一個(gè)22 kD亞基。此外，研究還發(fā)現(xiàn)pH、金屬離子、氨基酸對(duì)洋蔥GGTs活性具有促進(jìn)作用[23-24]。大蒜中已被鑒定了3個(gè)編碼GGTs的基因、和，相應(yīng)的重組蛋白可以使γ-谷氨?；?S-烯丙基-L-半胱氨酸脫谷氨酰化，產(chǎn)生脫氧蒜氨酸[13]。【本研究切入點(diǎn)】洋蔥中GGTs蛋白的部分特性已被鑒定，但編碼GGTs的基因及功能鑒定的研究卻鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究克隆，闡明該基因及編碼蛋白的理化性質(zhì)，并鑒定外源蛋白的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，檢測(cè)在組織間的表達(dá)模式及組織間谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性的差異，為后續(xù)GGTs特性的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)所用洋蔥材料均為紫冠洋蔥，取自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心基地。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 RNA提取試劑盒（Quick RNA Isolation Kit）購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script? 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Yeastmaker? Yeast Transformation System2）購(gòu)自上海寶生物有限公司；DNA marker、2×TransStart?FastPfu Fly PCR Mix、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、蛋白定量試劑盒（Easy Protein Quantitative Kit）購(gòu)自TransGen Biotech。無(wú)縫克隆試劑盒（2×Seamless Cloning Mix）、大量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自（DP109-01）北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 菌株及載體 pEASY-Blunt Zero載體、大腸桿菌感受態(tài)（Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell）購(gòu)自TransGen Biotech；酵母菌株BY2777由NBRP（National BioResource Project）提供；pYES2、PYBA1332載體均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心公共平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 試驗(yàn)所用引物均由Primer5.0軟件設(shè)計(jì)（表1），由博邁德生物科技公司（北京）合成。

1.2 洋蔥總RNA的提取和cDNA合成

選擇無(wú)病蟲害的洋蔥鱗莖，用RNA提取試劑盒提取洋蔥總RNA，并用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 洋蔥AcGGT的克隆

根據(jù)北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心公共平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)獲得序列，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增的編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為洋蔥cDNA 1 μL、10 μmol·L-1的上下游引物（GGT-F和GGT-R）各1 μL、2×TransStart?FastPfu Fly PCR Mix10 μL，加水補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，拍照，切膠并利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收，純化回收后連接到載體pEASY-Blunt Zero中。

轉(zhuǎn)化篩選后，將陽(yáng)性克隆送北京博邁德生物科技公司測(cè)序，測(cè)序得到的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。利用DNAMAN軟件及NCBI將測(cè)序驗(yàn)證正確的序列進(jìn)行拼接，并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST對(duì)其核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；利用TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN對(duì)編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 AcGGT亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建及分析

用Ⅰ和Ⅰ雙酶切PYBA1332植物表達(dá)載體，將pEASY-T5-質(zhì)粒作為模板，使用PYBA1332-GGT-F及PYBA1332-GGT-R進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)BM無(wú)縫克隆試劑盒提供的方法將回收的PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接完成后使用Trans-T1感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選完成后將陽(yáng)性克隆送博邁德生物科技公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證PYBA1332-GGT- EGFP與預(yù)期結(jié)果一致。

使用大量質(zhì)粒提取試劑盒分別提取PYBA1332空載體以及PYBA1332-GGT-EGFP質(zhì)粒，制作金粉-質(zhì)粒微載體，靶距為9 cm，氦氣壓力為1350PSI以金粉-質(zhì)粒微載體在基因槍介導(dǎo)下轟擊已預(yù)培養(yǎng)8 h的洋蔥內(nèi)表皮（轟擊條件為：氦氣壓為1 350 Psi，真空度為28 kPa，轟擊聚類為9 cm），25℃培養(yǎng)12 h后，利用OLYMPUSFV300激光共聚焦顯微鏡觀察，并拍照。

1.6 釀酒酵母表達(dá)載體pYES2-GGT的構(gòu)建

使用Ⅰ及Ⅰ雙酶切pYES2釀酒酵母表達(dá)載體，將pEASY-T5-GGT質(zhì)粒作為模板，使用pYES2-GGT-F及pYES2-GGT-R進(jìn)行擴(kuò)增，BM無(wú)縫克隆試劑盒將回收的PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接完成后使用Trans-T1感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選完成后將陽(yáng)性克隆送博邁德生物科技公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證pYES-GGT與預(yù)期結(jié)果一致后，提取質(zhì)粒備用。

1.7 AcGGT的真核表達(dá)與總蛋白質(zhì)的提取

依據(jù)酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Yeastmaker? Yeast Transformation System2)將pYES2和pYES2-GGT轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY2777酵母中，利用SD Base-Ura篩選陽(yáng)性克隆。培養(yǎng)2—3 d后挑選單菌落利用酵母陽(yáng)性克隆快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行鑒定，鑒定完畢后使用2%D-半乳糖代替葡萄糖的SD Base-Ura培養(yǎng)2 d。總蛋白的提取按照北京酷來(lái)搏科技有限公司非變性酵母蛋白提取試劑盒提取，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 重組AcGGT酵母總蛋白的定量與酶活性測(cè)定

依據(jù)Bradford[25]方法定量酵母總蛋白。通過(guò)分析酵母總蛋白中γ-谷氨?；衔锂a(chǎn)生的脫谷氨?；衔锏牧縼?lái)進(jìn)行GGT酶活性的測(cè)定。在6 h的孵育期間，脫谷氨?；幕衔锏臄?shù)量線性增加。根據(jù)Orlowski等[10]方法，通過(guò)分光光度法確定以γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺為底物的脫谷氨?；钚?。

1.9 不同組織AcGGT相對(duì)表達(dá)量及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶測(cè)定

RNA的提取與cDNA的合成與1.2.1描述一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體系為：10 μmol·L-1上、下游引物各0.8 μL、2×SYBR Green Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL和ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR測(cè)定Ct值，利用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

精確稱取約0.1 g洋蔥組織，加提取液1.0 mL充分研磨，于4℃，10 000 r/min離心15 min，取粗酶液上清液待測(cè)。通過(guò)分析粗酶液上清中γ-谷氨?；衔锂a(chǎn)生的脫谷氨?；衔锏牧縼?lái)進(jìn)行GGT酶活性的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 AcGGT的克隆

以cDNA為模板，利用特異引物在預(yù)先篩選的退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 900 bp產(chǎn)物（圖1），通過(guò)測(cè)序得到1 869 bp的CDS序列，經(jīng)NCBI比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的大蒜（GenBank：JQ409456.1）相似性達(dá)96%。在NCBI的ORF finder查找開放閱讀框并翻譯其對(duì)應(yīng)的氨基酸，結(jié)果顯示，所克隆得到的序列具有一個(gè)1 869 bp完整的開放閱讀框，推導(dǎo)編碼622個(gè)氨基酸（圖2），命名為。

2.2 AcGGT的生物信息學(xué)分析

采用ProtParam在線分析工具，對(duì)AcGGT蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為67.7，等電點(diǎn)（）為6.07，分子式為C3024H4755N811O895S28，不穩(wěn)定指數(shù)為33.37，脂肪族指數(shù)為89.25。通過(guò)氨基酸多重比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物中的GGT除N端外都具有一定的保守性（圖3），與前人預(yù)測(cè)的N-連接糖基化位點(diǎn)相似，并且也具有保守的蛋白裂解酶位點(diǎn)。

M：DL5000 DNA Marker；1—3：AcGGT

圖2 AcGGT編碼區(qū)序列

NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，編碼蛋白從氨基酸第66—622位為一個(gè)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶超級(jí)結(jié)構(gòu)域（圖4-A）。利用SOPMA對(duì)AcGGT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的形式及其所占比例分別為46.02%α-螺旋、15.17%延伸鏈、6.94%β-轉(zhuǎn)角和31.88%無(wú)規(guī)則卷曲（圖4-B）；利用TMHMM Server V.2.0對(duì)AcGGT蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析顯示該蛋白第24—46位具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（圖5）。

利用MegA6軟件對(duì)21種GGT氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。結(jié)果表明，洋蔥GGT氨基酸序列與大蒜AsGGT1、AsGGT2、AsGGT3有較高同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離AsGGT2最近，GGT發(fā)育樹與生物進(jìn)化的物種樹基本一致，符合物種進(jìn)化規(guī)律，說(shuō)明GGT基因編碼區(qū)在物種間具有保守性。

2.3 AcGGT亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及分析

為了預(yù)測(cè)AcGGT編碼蛋白在大蔥中的亞細(xì)胞定位情況，利用基因槍介導(dǎo)在洋蔥內(nèi)表皮中瞬時(shí)表達(dá)帶有GFP的，將轟擊過(guò)后的洋蔥內(nèi)表皮組織在25℃暗培養(yǎng)12 h，在激光共聚焦顯微鏡下掃描拍攝其在細(xì)胞中的定位（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶有GFP的AcGGT重組融合蛋白在洋蔥液泡中具有微弱信號(hào)，這一結(jié)果可能是由于的序列較長(zhǎng)，含有靶向細(xì)胞器的信號(hào)序列，這與大蒜AsGGT2定位于液泡中的結(jié)果一致。

黑線：預(yù)測(cè)的GGT蛋白信號(hào)肽；*：預(yù)測(cè)的N-連接糖基化位點(diǎn)；箭頭：表示大亞基和小亞基之間的保守蛋白酶切割位點(diǎn)

A：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；B：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 洋蔥AcGGT編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

*：洋蔥AcGGT *：Allium cepa AcGGT

2.4 AcGGT在酵母中的表達(dá)及活性分析

根據(jù)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能夠?qū)⒐劝滨?duì)硝基苯胺中γ-谷氨?；D(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對(duì)硝基苯胺的方法測(cè)定酵母總轉(zhuǎn)肽酶活性。按照上述方法，37℃孵育6 h后，轉(zhuǎn)入的酵母總蛋白酶液催化生成0.76 μmol·mg-1對(duì)硝基苯胺；而轉(zhuǎn)入PYES2空載體的催化生成0.54 μmol·mg-1（圖8）。轉(zhuǎn)入的酵母總蛋白的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性顯著高于未轉(zhuǎn)入外源基因的酵母總蛋白，結(jié)果表明，AcGGT蛋白具有谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶功能。

圖7 35S-GGT-GFP 在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析

**：與對(duì)照組顯著性差異（p<0.01）

2.5 AcGGT在洋蔥中的組織表達(dá)差異性及內(nèi)源性谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性分析

利用qRT-PCR方法檢測(cè)在洋蔥不同組織中的表達(dá)（圖9）。結(jié)果表明，在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他組織中的表達(dá)量，其次是葉鞘，而在鱗莖中幾乎不表達(dá)。

根據(jù)上述方法測(cè)定洋蔥不同組織谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，結(jié)果顯示，在葉中活性最高，葉鞘和鱗莖次之。

相關(guān)性分析顯示在洋蔥中的表達(dá)與內(nèi)源性轉(zhuǎn)肽酶活性相關(guān)性不顯著（=0.269，＞0.05）。

3 討論

蒜氨酸是蔥屬植物中富含的一類含硫化合物，也是大蒜素合成的主要底物[26]。前人根據(jù)放射性追蹤法及化學(xué)分析的結(jié)果中提出的從大蒜中的半胱氨酸生物合成蒜氨酸的途徑，其中研究最廣泛的步驟是生物合成中間體中去除γ-谷氨?；?，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）作為脫谷氨酰化酶參與蒜氨酸合成[26-29]。因此，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在蒜氨酸合成途徑中起著關(guān)鍵作用[24,27,29]。本研究克隆了一個(gè)編碼洋蔥GGT蛋白的一個(gè)基因，并利用生物信息學(xué)分析鑒定了該基因的基本性質(zhì)，通過(guò)異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶功能。

在前人提出的蒜氨酸生物合成途徑中，根據(jù)脫谷氨?；蚐-加氧反應(yīng)順序的不同，從中間體γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸到蒜氨酸有2條不同路線[13,30-31]。大蒜AsGGT1、AsGGT2和AsGGT3對(duì)γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸具有脫谷氨?；钚?，而這些GGT對(duì)γ-谷氨酰S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜幾乎沒有脫谷氨基活性，表明大蒜蒜氨酸的合成主要是先脫谷氨?；?，然后加氧合成蒜氨酸[13]。在休眠的洋蔥鱗莖中的GGTs對(duì)蒜氨酸的生物合成中間體表現(xiàn)出很高的底物特異性，證實(shí)GGT催化γ-谷氨酰S-烯丙基-L-半胱氨酸生物合成中的脫谷氨酰基的觀點(diǎn)[23]。然而，在發(fā)芽的洋蔥鱗莖中純化的GGTs對(duì)谷胱甘肽和谷胱甘肽S-結(jié)合物表現(xiàn)出很高的親和力，但利用γ-谷氨酰-S-丙烯-L-半胱氨酸亞砜作為底物的親和力較差，這表明洋蔥至少有2個(gè)不同的GGT蛋白，它們?cè)隗w內(nèi)具有不同的功能[24]。此外，在大蒜的膨大時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中顯示，在大蒜鱗莖膨大時(shí)期中均處于高度表達(dá)狀態(tài)，表明該基因在大蒜鱗莖膨大過(guò)程中具有重要作用[32]。在本研究中鑒定的編碼洋蔥GGT的基因，該基因與同源性最高，進(jìn)化分析顯示與歸于同一分支。由此，表明該基因在洋蔥中的蒜氨酸合成途徑中的作用與大蒜中一致。綜上所述，推測(cè)在洋蔥蒜氨酸合成過(guò)程中，γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸到蒜氨酸的順序是脫谷氨?；扔赟-加氧反應(yīng)。

另外，通過(guò)分析該基因的組織表達(dá)水平以及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性發(fā)現(xiàn)，洋蔥的表達(dá)與谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性相關(guān)性不顯著，所以推測(cè)洋蔥中可能存在多個(gè)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因。然而，編碼洋蔥GGTs蛋白的其他基因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

克隆了洋蔥，并提供了外源表達(dá)酶促反應(yīng)數(shù)據(jù)。洋蔥蒜氨酸合成途徑中脫谷氨酰化先于S-加氧；的表達(dá)與洋蔥內(nèi)源性的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性相關(guān)性不顯著，表明洋蔥中可能存在多個(gè)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因。

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Cloning and identification of γ-glutamyl transpeptidasegene from onion ()

Xu Huanhuan1,2, Li Yi1, Gao Wei1, Wang Yongqin2, Liu Lecheng1

1College of horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2Vegetable Research Center, Beijing Academy of agriculture and forestry/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P.R. China/Beijing Key Laboratory of Vegetable Germplasm Improvement, Beijing 100097

【】Alliin metabolized by Allium plants had important pharmaceutical value. γ-glutamyl transpeptidase was a key enzyme in the deglutamylation step of the process of alliin synthesis. Studying the function of γ-glutamyl transpeptidase gene in onion can reveal the role of γ-glutamyl transpeptidase in alliin synthesis pathway, providing theoretical basis for alliin synthesisand laying a foundation for further study on alliin synthesis mechanism. 【】Using onion as material, the primers were designed according to onion RNA-seq database, and the gene, γ-glutamyl transpeptidase, was cloned from onion by RT-PCR and analyzed by bioinformatics. The CAMV 35S-AcGGT-GFP vector was used to bombard onion inner epidermis cells with gold powder plasmid microcarrier by particle bombardment technology, and the subcellular localization ofwas determined by fusion green fluorescent expression protein. The Saccharomyces cerevisiae expression vector withwas constructed, transforming and inducing the expression of, and using the method of transforming glutamyl-p-nitroaniline to p-nitroaniline by γ-glutamyl transpeptidase to determine the glutamyl transpeptidase activity of the total protein of Saccharomyces cerevisiae transferred into. Real time quantitative PCR was used to analyze the differential expression pattern of the gene in onion tissues. The activity of endogenous transpeptidase in onion tissues was determined by the method of γ-glutamyl transpeptidase catalyzing the production of p-nitroaniline from p-nitroaniline. 【】was cloned and its length was 1 869 bp. Bioinformatics analysis showed thatencoded 622 amino acids, protein domain prediction showed that it had glutamyl transpeptidase domain, secondary structure was mainly α - helix, transmembrane region analysis suggested that GGT protein had transmembrane region, amino acid multiple alignment results showed that GGT in plants had certain conservation, evolutionary analysis showed thatwas related to garlic, and the relationship is closest. The fluorescence signal of CaMV 35S-AcGGT-GFP fusion protein was located in the vacuole, indicating that the protein encoded by CaMV 35S-AcGGT-GFP was located in the vacuole. The results of glutamyl transpeptidase activity assay showed that the glutamyl transpeptidase activity of yeast transformed withwas significantly higher than the control, indicating that the protein encoded byhad transpeptidase activity. The results of differential expression analysis ofshowed that the expression ofwas mainly in leaf sheath, bulb and leaf sheath followed by. The activity of glutamyl transpeptidase in different tissues, the highest activity in leaf, followed by leaf sheath. Correlation analysis showed that there was no significant correlation between the activity of transglutaminase and the expression of. 【】The enzymatic reaction data of exogenousexpression were obtained. the deglutination of alliin synthesis pathway preceded S-oxygenation; there was no significant correlation betweenexpression and endogenous transglutaminase activity in onion, suggesting that there may be multiple transglutaminase genes in onion.

onion; γ-glutamyl transpeptidase; bioinformatics; subcellular localization; eukaryotic expression; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.012

2020-11-12；

2021-01-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31972409，31572119）、北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力項(xiàng)目（KJCX20200113）

徐歡歡，E-mail：sr19951010@126.com。通信作者王永勤，E-mail：wangyqly@163.com。通信作者劉樂(lè)承，E-mail：516119@yangtzeu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）