蘇孟園,楊汶珊,唐榮葉,徐杰杰,王 濤,尹紹武

(1.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)(2.江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術(shù)工程研究中心,江蘇 南京 210023)

微衛(wèi)星(microsatellite)是指以1～6個堿基為基本單位重復(fù)串聯(lián)組成的DNA序列[1],在真核、原核生物以及病毒基因組中均廣泛分布[2-3]. 微衛(wèi)星具有共顯性遺傳、多態(tài)性信息豐富和易于檢測等特點,在物種保護(hù)[4-5]、種質(zhì)資源評價[6]、種群遺傳多樣性研究[7-12]、親緣關(guān)系鑒定[13]及物種鑒定[14]等方面的應(yīng)用越來越廣泛.

花斑無須鯰(Ageneiosusmarmoratus)隸屬于脊椎動物亞門(Vertebrata)、輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鲇形目(Siluriformes)、項鰭鯰科(Auchenipteridae)、無須鯰屬(Ageneiosus),主要分布于南美洲秘魯、阿根廷、圭亞那、厄瓜多爾以及蘇里南淡水流域的底層水域,適宜的水體pH為6.5,適宜溫度為23～26 ℃,體長可達(dá)18.5 cm,可作為觀賞魚類[15]. 與鯰魚類大多具有發(fā)達(dá)的須不同,花斑無須鯰的兩頜無須,是在基因組水平上研究胡須形成發(fā)展機制并以此揭示脊椎動物生理學(xué)重要過程的一個理想的自然模型,目前以花斑無須鯰為模型在無須機制這一方面的研究已取得了一定的進(jìn)展[16]. 保護(hù)、開發(fā)花斑無須鯰遺傳資源并對花斑無須鯰基因組進(jìn)行進(jìn)一步的研究有重要意義.

目前國內(nèi)外對于花斑無須鯰這一物種的研究相對較少,對于花斑無須鯰遺傳資源的保護(hù)重視程度不夠. 迄今為止,花斑無須鯰微衛(wèi)星相關(guān)的研究尚未見報道. 本研究根據(jù)NCBI已公布的花斑無須鯰全基因組序列,利用生物信息學(xué)軟件對花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星豐度及分布情況進(jìn)行分析,旨在為花斑無須鯰遺傳資源的保護(hù)與開發(fā)、遺傳多樣性研究及與鲇形目中其他物種微衛(wèi)星特征比較分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 研究方法

1.1 花斑無須鯰基因序列的獲取

花斑無須鯰全基因組序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/71451)下載,基因組總長度約1.03 Gb,所有序列均以FASTA格式保存.

1.2 數(shù)據(jù)處理

利用微衛(wèi)星篩選軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對花斑無須鯰全基因組中符合條件的微衛(wèi)星進(jìn)行搜索. 考慮到對微衛(wèi)星軟件參數(shù)設(shè)置的不同會造成微衛(wèi)星分析結(jié)果存在差異,根據(jù)前期工作積累的經(jīng)驗[17-18],采取默認(rèn)參數(shù)設(shè)定得到的分析結(jié)果最優(yōu),即單堿基重復(fù)類型的最小拷貝數(shù)設(shè)置為10,二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)類型的最小拷貝數(shù)分別設(shè)置為6、5、5、5、5. 用Excel對搜索結(jié)果中6種堿基重復(fù)類型的完整型微衛(wèi)星進(jìn)行統(tǒng)計分析,將可循環(huán)的微衛(wèi)星序列以及各自互補的序列歸為一類,例如,對于AAC重復(fù)拷貝類別,ACA、CAA、TTG、TGT和GTT可與其歸為一類. 總體來說,單堿基包括A和C類別,共2類;二堿基包括AT、AC、AG和CG類別,共4類;三堿基包括AAC、AAG、AAT、ACC、CTG、TGA、CAG、GAG、CAT和GGC類別,共10類;四堿基、五堿基、六堿基分類方法相同且由于類型較多在此不一一列舉.

2 結(jié)果與分析

2.1 花斑無須鯰各類型微衛(wèi)星重復(fù)序列的分布特征

在1.03 Gb花斑無須鯰全基因組序列中,共篩選出符合條件的完整型微衛(wèi)星共336 037個,豐度為326個/Mb,微衛(wèi)星序列總長度為7 720 686 bp,占基因組總長度的0.75%,密度為7 496 bp/Mb.

在所統(tǒng)計的6種重復(fù)類型的微衛(wèi)星中,數(shù)量最多的為二堿基,其余依次為單堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基(見圖1). 微衛(wèi)星序列長度分布情況及所占比例基本與微衛(wèi)星數(shù)目分布情況相同(見圖2). 各類型微衛(wèi)星數(shù)量、長度、豐度及密度的變化趨勢也是按照從二堿基、單堿基、三堿基、四堿基、五堿基到六堿基逐漸遞減(見表1).

圖1 花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星各重復(fù)類型數(shù)目占比Fig.1 Distribution of number of SSRs repeat typesin A.marmoratus genome

圖2 花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星各重復(fù)類型長度占比Fig.2 Distribution of length of SSRs repeat typesin A.marmoratus genome

表1 花斑無須鯰全基因組中不同類型微衛(wèi)星統(tǒng)計Table 1 Different types of microsatellite sequences in A.marmoratus genome

2.2 花斑無須鯰6種微衛(wèi)星中各重復(fù)拷貝類別分布情況

如表2所示,在微衛(wèi)星重復(fù)類型相同的情況下,不同重復(fù)拷貝類別的微衛(wèi)星數(shù)目也存在很大差異.

表2 花斑無須鯰各類型微衛(wèi)星中前3種優(yōu)勢堿基類別及占比Table 2 The three dominant base types and proportions in each microsatellite of A.marmoratus

單堿基重復(fù)中拷貝類別為A的微衛(wèi)星數(shù)量占絕對優(yōu)勢,C拷貝類別微衛(wèi)星數(shù)量則相對較少. 二堿基中重復(fù)類別為AC的微衛(wèi)星數(shù)量最多,接下來依次為AG、AT,CG拷貝類別微衛(wèi)星數(shù)量最少. 三堿基重復(fù)中拷貝類別為AAT的微衛(wèi)星數(shù)量最多,其次分別為AAG、AAC,GGC類別微衛(wèi)星數(shù)目最少. 四堿基重復(fù)中數(shù)量最多的拷貝類別為AAAT,其次是TATC類別,其余重復(fù)拷貝類別微衛(wèi)星數(shù)量較少,在此不一一列舉,其中GGCC拷貝類別在統(tǒng)計中未發(fā)現(xiàn). 五堿基重復(fù)中數(shù)量最多的拷貝類別為AATAT,其次分別為AATAG、ATTCT,其余重復(fù)拷貝類別數(shù)量較少. 六堿基重復(fù)類型中各拷貝類別總體分布較為分散且數(shù)量均較少,無優(yōu)勢拷貝類別.

花斑無須鯰基因組序列篩選出的微衛(wèi)星中出現(xiàn)次數(shù)最多的前10種拷貝類別均出自除五堿基和六堿基以外的其他4種重復(fù)類型,總微衛(wèi)星數(shù)量為305 243個,占篩選出的全部微衛(wèi)星數(shù)量的90.84%,從拷貝類別可以看出有明顯的A、T優(yōu)勢(見表3).

表3 花斑無須鯰出現(xiàn)次數(shù)最多的10種重復(fù)拷貝類別Table 3 Top 10 repeated copy categories in A.marmoratus

2.3 花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星核心拷貝數(shù)分布情況

花斑無須鯰基因組微衛(wèi)星核心拷貝數(shù)在5-4 158次范圍均有分布,分布范圍較大,其中集中分布在 5-32 次之間的微衛(wèi)星共有330 150個,占微衛(wèi)星總數(shù)的98.25%.

如圖3所示,單堿基類型微衛(wèi)星的核心拷貝數(shù)主要集中在10-25次,共有122 383個,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的98.12%;以拷貝數(shù)為10的微衛(wèi)星數(shù)量最多,共44 325個,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的35.54%. 二堿基類型微衛(wèi)星的核心拷貝數(shù)主要集中在6-30次之間,共138 034個,占比為94.99%;以拷貝數(shù)為6的微衛(wèi)星數(shù)量最多,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的16.49%. 三堿基類型微衛(wèi)星的核心拷貝數(shù)主要集中在5-20次之間,共有35 165個,占比為95.13%;以拷貝數(shù)為5的微衛(wèi)星數(shù)量最多,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的27.57%. 四堿基類型的核心拷貝數(shù)主要集中在5-20次之間,共有24 396個,占比為98.29%;以拷貝數(shù)為5的微衛(wèi)星數(shù)量最多,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的32.61%. 五堿基類型的核心拷貝數(shù)主要集中在5-14次之間,共有3 320個,占比為95.18%;以拷貝數(shù)為5的微衛(wèi)星數(shù)量最多,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的44.47%. 六堿基類型的核心拷貝數(shù)主要集中在5-7次之間,共有665個,占比為93.01%;以拷貝數(shù)為5的微衛(wèi)星數(shù)量最多,占該類型微衛(wèi)星總數(shù)的64.48%. 6種重復(fù)類型微衛(wèi)星數(shù)量最多的拷貝數(shù)均是對應(yīng)類型設(shè)定的最小重復(fù)次數(shù). 總體上,隨著核心拷貝數(shù)的增加,6種微衛(wèi)星數(shù)量呈下降趨勢.

圖3 花斑無須鯰微衛(wèi)星各重復(fù)類型中重復(fù)類別拷貝數(shù)分布Fig.3 Distribution of different microsatellite repetitions in A.marmoratus

3 討論

3.1 花斑無須鯰全基因組中微衛(wèi)星含量分析

本研究利用生物信息軟件在全基因組范圍對花斑無須鯰的微衛(wèi)星分布情況進(jìn)行研究,相比于使用磁珠富集、錨定PCR、FIASCO等技術(shù)對微衛(wèi)星進(jìn)行篩選,本研究所利用的方法能夠大批量搜索SSR標(biāo)記,對于物種構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、分子標(biāo)記的開發(fā)等有重要意義. 篩選得到的微衛(wèi)星序列長度占基因組總長度的0.75%,這與已公布的鲀形目紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)微衛(wèi)星含量(0.77%)[19]相似,但小于人類(Homosapiens)(3%)[20]、食蟹猴(Macacafascicularis)(0.89%)[21]以及黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)(1.8%)[17]微衛(wèi)星含量,而與普通鸕鶿(Phalacrocoraxcarbo)(0.23%)[22]以及紅原雞(Gallusgallus)(0.49%)[23]微衛(wèi)星含量相比又較大. 這表明不同物種基因組中微衛(wèi)星含量不盡相同,且與物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近沒有直接關(guān)系. 甘麗萍等通過對6種鱗翅目昆蟲全基因組長度與微衛(wèi)星含量進(jìn)行分析比較時發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星數(shù)量與基因組長度之間不存在正比關(guān)系[24]. Hancock則推測微衛(wèi)星含量與染色體長度存在聯(lián)系,隨著染色體長度的增加,微衛(wèi)星含量相應(yīng)增加[25].

3.2 花斑無須鯰6種微衛(wèi)星分布情況分析

花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星中的優(yōu)勢重復(fù)類型為二堿基重復(fù),這與已公布的黃顙魚[17]、紅鰭東方鲀[19]、大鼠(Rattusnorvegicus)[26]、果蠅(Drosophilamelanogaster)[27]和蜜蜂(Apismellifera)[28]的微衛(wèi)星優(yōu)勢類型結(jié)果一致,而紅原雞[23]、綠尾虹雉(Lophophoruslhuysii)[29]、普通鸕鶿[22]、四川山鷓鴣(Arborophilarufipectus)[30]、牛(Bostaurus)[31]、綿羊(Ovisaries)[31]和豬(Susscrofa)[32]則是單堿基類型占優(yōu)勢. 此外,二斑葉螨(Tetranychusurticae)[33]、酵母(Saccharomycescerevisiae)[34]以及德國小蠊(Blattellagermanica)[35]的優(yōu)勢重復(fù)類型為三堿基重復(fù),蚊子(Anophelesgambiae)[36]則是六堿基重復(fù)占優(yōu)勢. 這表明,物種之間的優(yōu)勢微衛(wèi)星類型并不是統(tǒng)一的. 崔建洲等認(rèn)為二堿基重復(fù)類型為物種優(yōu)勢堿基類型的現(xiàn)象較為普遍[19],花斑無須鯰的微衛(wèi)星分布特征支持了這一觀點. 且根據(jù)花斑無須鯰6種微衛(wèi)星的分布情況,盡管二堿基重復(fù)類型占優(yōu)勢,但單堿基重復(fù)類型的微衛(wèi)星數(shù)目占微衛(wèi)星總數(shù)的37.12%,其他類型微衛(wèi)星都相對較少,這基本符合微衛(wèi)星數(shù)量會隨著重復(fù)基本單位的增加而減少的規(guī)律[37].

3.3 花斑無須鯰不同重復(fù)類別微衛(wèi)星特征分析

花斑無須鯰單堿基中A類別占絕對優(yōu)勢,占比為97.61%,在已報道的黃顙魚[17]、人類[20]、紅原雞[23]和中華按蚊(Anophelessinensis)[38]等大多數(shù)物種中都存在相同的現(xiàn)象.

二堿基重復(fù)類型中數(shù)量最多的類別是AC,這與已公布的黃顙魚[17]、紅鰭東方鲀[19]、普通鸕鶿[22]、蚊子[36]、大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)[39]和美麗硬仆骨舌魚(Scleropagesformosus)[40]相同,其次分別為AG和AT,而CG類別最少. 對于二堿基重復(fù)類型中AC與CG類別數(shù)量差距如此懸殊的現(xiàn)象,在研究者普遍認(rèn)為DNA復(fù)制過程中會產(chǎn)生滑移而形成微衛(wèi)星的基礎(chǔ)上[41],推測可能是由于連接AT的雙鍵比連接CG的三鍵更易斷裂,因此更易造成堿基滑動,從而導(dǎo)致AT類別比CG類別在數(shù)量上更具優(yōu)勢.

三堿基重復(fù)類型中數(shù)量最多的類別是AAT,這與已公布的黃顙魚[17]、人類[20]、紅鰭東方鲀[19]、普通鸕鶿[22]和恒河猴(Macacamulatta)[42]相一致. 有研究表明,6種重復(fù)類型微衛(wèi)星中,在基因編碼區(qū)中三堿基重復(fù)類型發(fā)現(xiàn)的最多[43],推測三堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星在生物性狀的表達(dá)中起著更重要的作用,且在人類基因組中三堿基重復(fù)與某些遺傳疾病關(guān)系密切[44],例如亨廷頓病的患病風(fēng)險會隨著(CAG)n核心拷貝數(shù)的增加而增大,根據(jù)這一規(guī)律,可通過分析該序列長度從而預(yù)測個體患病的風(fēng)險以及患病情況[45]. 因此,通過對花斑無須鯰三堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星與該種魚患病情況建立聯(lián)系,可能會對魚類疾病的研究有所幫助.

四、五、六堿基重復(fù)類型中數(shù)量最多的類別分別為AAAT、AATAT和AAATGT,未發(fā)現(xiàn)GGCC類別的微衛(wèi)星. 從出現(xiàn)次數(shù)最多的前10種類別微衛(wèi)星可以看出花斑無須鯰基因組微衛(wèi)星堿基含量存在明顯的A、T堿基優(yōu)勢. 研究表明,物種中出現(xiàn)的微衛(wèi)星數(shù)量與基因組中A、T堿基含量的高低呈正相關(guān),與C、G含量負(fù)相關(guān)[46]. 對于A、T堿基含量豐富的一種解釋是基因組序列中的CpG發(fā)生甲基化,這會使得胞嘧啶(C)非常容易通過脫氨基作用而轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T),因而C/G堿基數(shù)量減少的同時A/T堿基數(shù)量增加[47-48].

3.4 花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星核心拷貝數(shù)分析

在花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星中,除二堿基和三堿基有少許波動外,總體上,隨著拷貝數(shù)增加微衛(wèi)星數(shù)量減少. 這與黃顙魚[17]、紅原雞[23]、中華按蚊[38]和虎皮鸚鵡(Melopsittacusundulatus)[49]等絕大多數(shù)物種的微衛(wèi)星分布規(guī)律相同. 對于這種現(xiàn)象有以下解釋,Wierdl等在對微衛(wèi)星序列的突變率進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),對于GT序列,長度為105 bp時的突變率是長度為15 bp時突變率的500倍,據(jù)此得出結(jié)論認(rèn)為微衛(wèi)星的穩(wěn)定性會隨著長度的增加而降低,微衛(wèi)星長度越長越不穩(wěn)定,而微衛(wèi)星數(shù)量也會減少[50];Leopoldino等認(rèn)為微衛(wèi)星的突變率隨著拷貝數(shù)的增加而增大[51],因此微衛(wèi)星核心拷貝數(shù)越大微衛(wèi)星發(fā)生突變的概率就越大,該微衛(wèi)星數(shù)量就會減少;Ellegren研究認(rèn)為,在基因座上,長等位基因傾向于變得更短,從而抑制了微衛(wèi)星長度變長的趨勢[52]. 因此,一般情況下核心序列拷貝數(shù)較多的微衛(wèi)星數(shù)目較少.

4 結(jié)論

綜上所述,在對花斑無須鯰全基因組微衛(wèi)星分布情況進(jìn)行研究得出如下結(jié)論:基因組中微衛(wèi)星含量與物種間親緣關(guān)系并不存在直接聯(lián)系;優(yōu)勢重復(fù)類型為二堿基重復(fù)驗證了物種多以二堿基重復(fù)為優(yōu)勢類型的規(guī)律;各重復(fù)類別微衛(wèi)星都表現(xiàn)出明顯的A、T優(yōu)勢;隨著拷貝數(shù)的增加,微衛(wèi)星數(shù)量減少. 本研究對花斑無須鯰遺傳多樣性的研究以及不同物種間微衛(wèi)星分布特征的對比分析等提供了基礎(chǔ)資料.