受體相互作用蛋白激酶1在小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型中的作用

夏思穎 楊亞楠 閆香珍 章海兵 羅禮君

受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIP1)是受體相互作用蛋白(RIP)激酶家族中的一員，它們是一類具有特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，是細(xì)胞應(yīng)激的重要傳感器，是激活多種細(xì)胞死亡途徑并控制炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[1]。RIP1與凋亡相關(guān)受體結(jié)合參與依賴半胱天冬酶(Caspase)調(diào)控的細(xì)胞凋亡[2]，也在Caspase受抑制時(shí)參與細(xì)胞壞死性凋亡[3]。同時(shí)，RIP1通過(guò)激酶依賴性和非依賴性兩種方式調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)[4]。當(dāng)RIP1信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)可導(dǎo)致過(guò)度的炎癥或細(xì)胞死亡，因此RIP1對(duì)生物體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控起重要作用[1]。在常見(jiàn)口腔疾病中，牙周炎作為一種與多種系統(tǒng)性疾病相關(guān)的慢性炎癥性疾病[5]，目前已有研究報(bào)道稱牙周炎涉及細(xì)胞凋亡[6]，但細(xì)胞壞死性凋亡對(duì)于牙周炎的發(fā)生發(fā)展的作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建RIP1基因條件性敲除小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，進(jìn)一步明確RIP1在牙周炎致病過(guò)程中的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源及分組

選擇2019 年就診于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的18～60 歲患者為研究對(duì)象，分為牙周炎組和牙周健康組，研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本的收集均取得患者知情同意。牙周炎組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷為Ⅲ～Ⅳ期牙周炎(根據(jù)2018年牙周分類標(biāo)準(zhǔn)[7]：牙間鄰面最嚴(yán)重的位點(diǎn)附著喪失≥ 5 mm，影像學(xué)顯示牙槽骨吸收至牙根1/2或根尖1/3)；(2)不伴有其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病及免疫系統(tǒng)疾病的患者。牙周健康組納入標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)牙周組織健康，其特征為無(wú)探診出血、牙齦無(wú)紅腫、無(wú)附著喪失和無(wú)牙槽骨骨喪失；(2)不伴有其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病及免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)小鼠，對(duì)照組為野生型(WT)C57/BL6小鼠，實(shí)驗(yàn)組為相同背景下巨噬細(xì)胞條件性敲除RIP1基因的小鼠(RIP1-/-)。所有小鼠均為6～8 周齡雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后建立牙周炎模型。

1.3 Western blot分析

實(shí)驗(yàn)組為牙周炎組患者在行翻瓣術(shù)中收集的牙齦組織，對(duì)照組為牙周健康組患者行阻生齒拔除術(shù)中收集的牙齦組織。組織在液氮中充分研磨，加入RIPA裂解液(P0013B，碧云天)和1% Cocktail tablets蛋白酶抑制劑(Bimake公司, 美國(guó))，冰上裂解30 min后離心, 收集上清，BCA法(碧云天)檢測(cè)濃度。加入上樣緩沖液后置于100 ℃金屬浴中10 min，每組取含20 μg蛋白等體積行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜(Millipore公司，美國(guó))，用5%脫脂奶粉室溫下封閉90 min，加入RIP1(1∶1 000)及GAPDH(1∶5 000)一抗4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜3 次，每次15 min，加入熒光二抗避光孵育2 h，同樣方式洗膜，雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR公司，美國(guó))進(jìn)行熒光顯影，使用Image J繪制定量圖。

1.4 小鼠牙周炎模型的建立

分別選取6 只6～8 周RIP1條件性敲除(RIP1-/-)小鼠及6 只6～8 周野生型(WT)C57/BL6小鼠，通過(guò)腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)進(jìn)行麻醉，在右側(cè)上頜第二磨牙牙頸部用5-0絲線結(jié)扎誘導(dǎo)牙周炎。7 d后將各組小鼠頸脫位法處死，取上頜骨用4%多聚甲醛固定, 運(yùn)用Micro CT(μCT50，SCANCO，瑞士)進(jìn)行掃描成像后測(cè)量各組小鼠右側(cè)上頜第二磨牙頰側(cè)牙尖和溝裂及腭側(cè)牙尖和溝裂的釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂(cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距離，分析牙槽骨喪失量(alveolar bone loss,ABL)。

1.5 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

提取各組小鼠上頜骨對(duì)照側(cè)及實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織，在液氮中充分研磨，TRIZOL法提取各組RNA，檢測(cè)濃度后每組取1 μg RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用基因特異性引物和SYBR GREEN qRT-PCR試劑盒(Roche公司，瑞士)檢測(cè)兩組小鼠牙齦組織相關(guān)炎癥因子mRNA水平的表達(dá)差異。引物序列見(jiàn)表 1。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 牙周炎患者牙齦組織中RIP1蛋白的表達(dá)量

Western blot結(jié)果顯示，牙周炎患者牙齦組織中RIP1蛋白表達(dá)明顯低于牙周健康者(圖 1)。

2.2 RIP1-/-敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)性牙周炎中牙槽骨喪失量增多

Micro CT三維重建分析結(jié)果顯示，建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的RIP1-/-小鼠患側(cè)的牙槽骨喪失量均大于WT組小鼠(圖 2)。說(shuō)明抑制小鼠體內(nèi)RIP1的表達(dá)可以加重其實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨的吸收。

2.3 RIP1-/-小鼠的牙齦組織中炎癥因子表達(dá)

qRT-PCR(LightCycler96，Roche，瑞士)檢測(cè)野生型小鼠及RIP1敲除小鼠牙齦組織相關(guān)炎癥因子TNF-α(A)、IL-6(B)、iNOS(C)、IL-11(D)、Arg-1(E)和IL-10(F)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

qRT-PCR結(jié)果顯示，在未建立牙周炎模型的對(duì)照側(cè)牙齦組織中，RIP1-/-組小鼠相比于WT組小鼠促炎因子TNF-α、IL-11及抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)升高，在已建立牙周炎模型的實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中，RIP1-/-組小鼠相比于WT組小鼠促炎因子IL-6、IL-11及抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)升高，促炎因子iNOS的表達(dá)反而降低(圖 3)，同時(shí)，WT組小鼠的實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中抑炎因子Arg-1與對(duì)照側(cè)相比有所升高，而RIP1-/-組小鼠的實(shí)驗(yàn)側(cè)牙齦組織中促炎因子IL-6和抑炎因子Arg-1與對(duì)照側(cè)相比有所升高，結(jié)果說(shuō)明抑制小鼠體內(nèi)RIP1的表達(dá)可以改變小鼠牙齦組織中炎癥因子的表達(dá)。

圖 1 牙周炎患者及牙周健康者牙齦組織RIP1蛋白的表達(dá)

圖 2 RIP1-/-敲除小鼠及WT小鼠上頜骨Micro CT掃描結(jié)果

圖 3 野生型小鼠及RIP1-/-敲除小鼠牙齦組織相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示牙周炎患者的牙齦組織中RIP1表達(dá)下降，同時(shí)在巨噬細(xì)胞條件性敲除RIP1基因小鼠上建立牙周炎模型后觀察到與對(duì)照組相比牙槽骨的喪失量增加，并且牙齦組織中炎癥相關(guān)因子的表達(dá)趨勢(shì)改變，提示抑制RIP1可能會(huì)改變小鼠本身對(duì)于炎癥的反應(yīng)，并且會(huì)促進(jìn)小鼠牙周炎中的促炎和抗炎進(jìn)程。

牙周炎作為一種慢性炎癥性疾病，涉及多種細(xì)胞死亡方式。牙周炎患者牙齦組織中與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)上升[9]，且細(xì)胞凋亡受牙齦組織中特定的腺苷受體調(diào)節(jié)[10]，并會(huì)造成成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、骨鈣素等的表達(dá)降低[11]。壞死性凋亡在牙周炎中的具體作用尚未明確，但已有研究表明，牙齦卟啉單胞菌通過(guò)RIP1/RIP3/混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)信號(hào)通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞的死亡[12]，并且單核細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)可以觸發(fā)炎癥和牙周膜成纖維細(xì)胞的壞死性凋亡[13]。也有研究顯示，抑制RIP3/caspase-8可以保護(hù)牙周膜干細(xì)胞并促進(jìn)炎性微環(huán)境中牙周組織再生[14]，但是，缺乏更多的研究證實(shí)與壞死性凋亡密切相關(guān)的RIP1在牙周炎中的作用。

RIP1參與炎癥和多種細(xì)胞死亡方式，現(xiàn)有研究顯示，RIP1在受到某些蛋白泛素化或去泛素化修飾時(shí)，與FADD(fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)as相關(guān)死亡域蛋白)、caspase-8形成復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]；當(dāng)caspase-8受抑制時(shí)，RIP1與RIP3形成復(fù)合體誘導(dǎo)壞死性凋亡，激活MLKL破壞細(xì)胞膜造成細(xì)胞死亡[15]。有研究報(bào)道，當(dāng)抑制炎癥浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞中的RIP1會(huì)增加caspase-3的激活，并且改變巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮抑炎作用M2巨噬細(xì)胞減少而促炎相關(guān)的M1巨噬細(xì)胞增加[16]。RIP1參與NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)泛素化RIP1受到與NF-κB通路正向調(diào)節(jié)物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase 1，TAK1)復(fù)合物等調(diào)控，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)；當(dāng)RIP1受到NF-κB的負(fù)調(diào)控因子泛素編輯酶A20和去泛素化酶CYLD等作用時(shí)可發(fā)揮抑炎反應(yīng)[1]。也有研究發(fā)現(xiàn)，造血細(xì)胞中的RIP1缺乏會(huì)刺激細(xì)胞因子及趨化因子的釋放并產(chǎn)生一定的組織炎癥后造成造血功能衰竭并影響骨髓的生成[17]。因此，根據(jù)本研究的結(jié)果推測(cè)RIP1可能參與牙周炎癥的過(guò)程，但由于RIP1功能的多重性，同時(shí)炎癥與細(xì)胞死亡也存在多種復(fù)雜的關(guān)聯(lián)[18]以及牙周炎病因的復(fù)雜性[19]，本研究尚無(wú)法準(zhǔn)確解釋RIP1影響牙周炎的具體機(jī)制，這也是本實(shí)驗(yàn)中RIP1基因條件性敲除小鼠牙齦組織中促炎和抗炎因子表達(dá)趨勢(shì)不同的可能原因。

在RIP1的結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)氨基端激酶域、一個(gè)中間域和一個(gè)羧基端死亡域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的不同位點(diǎn)都對(duì)炎癥與細(xì)胞死亡起重要作用。例如，RIP1中間域Lys377處被特異性泛素化時(shí)，對(duì)TNF-α激活NF-κB通路起關(guān)鍵作用[20]；RIP1中間域中的受體相互作用同型相互作用基序(receptor-interacting protein homotypic interaction motif，RHIM)與RIP3中的RHIM形成是壞死性凋亡的必需復(fù)合物[21]；RIP1的死亡結(jié)構(gòu)域與FADD相互作用觸發(fā)凋亡[22]。因此，未來(lái)或許可以條件性敲除RIP1中的某些位點(diǎn)，以進(jìn)一步探究RIP1對(duì)牙周炎的具體作用及機(jī)制。

綜上，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明牙周炎患者牙齦組織中相比于牙周健康者RIP1的表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)，在小鼠體內(nèi)條件性敲除RIP1基因會(huì)造成其實(shí)驗(yàn)性牙周炎中牙槽骨喪失量增多，并引起炎癥因子的表達(dá)改變，表明RIP1可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)從而影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展，這都為進(jìn)一步探究RIP1在牙周炎中的作用提供了基礎(chǔ)。