黔北麻羊TGFβ2基因克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

張 艷，敖 葉，洪 磊，周志楠，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

轉(zhuǎn)化生長因子β2 基因（Transforming Growth Factor Beta 2，TGFβ2）是TGF-β超家族成員之一，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在哺乳動物卵巢顆粒細(xì)胞增殖、分化、卵泡發(fā)育和繁殖等方面發(fā)揮重要作用[1]。TGF-β信號廣泛參與到尼羅羅非魚的性腺發(fā)育中，尤其是對于卵母細(xì)胞的生長發(fā)育具有重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ2基因不僅參與調(diào)節(jié)雌性綿羊性腺及卵巢卵泡細(xì)胞的生長發(fā)育[3]，還有助于雞排卵后卵泡的退化[4]；TGFβ2基因還可作為南方黃牛肌肉生長發(fā)育有利的候選基因[5]。張增榮等[6]在雞的不同組織及不同生長發(fā)育階段均檢測到了TGFβ2基因的表達(dá)，表明TGFβ2基因廣泛參與了雞各個階段的生長發(fā)育，說明TGFβ2基因是影響雞肌肉生長發(fā)育的重要候選基因。綜上，TGFβ2基因不僅參與機體正常生長發(fā)育，還可能影響著動物的生殖發(fā)育，與哺乳動物繁殖性能有關(guān)。

黔北麻羊體格較大，體質(zhì)結(jié)實，四肢粗壯，屬肉用型品種；具有抗病性強、耐粗飼等特點；被毛分為深褐色及淺褐色2 種，是貴州地方三大山羊品種之一[7-9]。本實驗以黔北麻羊為研究對象，采用T-克隆技術(shù)獲得黔北麻羊TGFβ2基因編碼區(qū)序列，生物信息學(xué)方法分析其蛋白結(jié)構(gòu)功能；RT-qPCR 技術(shù)分析黔北麻羊TGFβ2基因在各性腺軸組織中的表達(dá)特征，初步探究黔北麻羊TGFβ2基因在性腺軸組織的表達(dá)水平和蛋白結(jié)構(gòu)功能，為探析其高繁殖潛力的分子調(diào)控機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究實驗動物由貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司提供，選取成年3 歲黔北麻羊母羊6 只，屠宰后分別采集黔北麻羊母羊的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5 個性腺軸組織，羊只屠宰方法及其注意事項參考貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》（DB22/T 2740-2017），采集的組織樣品使用錫箔紙包做好防污染處理并標(biāo)注，置于液氮中運回實驗室，移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑及儀器 TRIzol＠Reagent RNA 提取試劑盒、熒光定量試劑Ultra SYBR Mixture、膠回收試劑盒等購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Genstar，美國）、液氮、三氯甲烷、0.5%TAE 緩沖液、異丙醇、75%乙醇、西班牙瓊脂糖、氨芐青霉素（三水）購自貴州艾瑞特生物有限公司；pMD-19T 克隆載體、DNAMarker600、DNA Marker2000 購自大連寶生物工程有限公司，T4 DNA 連接酶、LB Broth 培養(yǎng)基購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。紫外可見分光光度計（型號為NANODROP2000）、37℃恒溫?fù)u床購自Thermo Fisher 有限公司；電泳儀（DYY-2C 型）、掌上離心機、振蕩器購自北京六一儀器廠；PCR 擴增儀（C1000 Touch ?）、實時熒光定量PCR 儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II）購自美國BIO-RAD 有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI-GenBank 數(shù)據(jù)庫中上傳的山羊（Capra hircus）TGFβ2基因的mRNA 外顯子拼接序列（登錄號：XM_018060159.1），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計實時熒光定量與CDS 區(qū)克隆擴增引物，以β-actin為內(nèi)參基因。引物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。引物詳細(xì)信息見表1。

表1 引物序列信息

1.3.2 總RNA 提取與cDNA 第一鏈的合成 采用Trizol法提取組織總RNA，使用超微量分光光度計檢測組織RNA 的濃度和純度，觀察光密度比值（OD260/OD280），峰圖單一且OD260/OD280比值在1.8～2.0 的組織RNA于-80℃冰箱中保存。RNA 統(tǒng)一定量后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3.3 實時熒光定量PCR 與數(shù)據(jù)分析 以β-actin 為內(nèi)參基因，運用RT-qPCR 技術(shù)對TGFβ2基因在黔北麻羊性腺軸組織的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。擴增程序：95℃預(yù)變性105 s；95℃變性15 s，62.7℃退火15 s，68℃延伸30 s，40 個循環(huán)；95℃變性5 s；最后由機器自動設(shè)置（基礎(chǔ)溫度60℃，每5 s 增加0.5℃擴增至95℃）進(jìn)行熔解曲線收集。擴增體系：2×Ultra SYBR Mixture 5.5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 ng/μL，ddH2O補足10 μL。采用2-ΔΔCt法分析TGFβ2基因在黔北麻羊性腺軸5 個組織中的差異表達(dá)量，用SPSS 19.0 軟件分析黔北麻羊不同組織中的表達(dá)水平，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 則表示差異極顯著。

1.3.4 PCR擴增黔北麻羊TGFβ2基因CDS 區(qū) 以cDNA 第一鏈為模板，RT-PCR 擴增黔北麻羊TGFβ2基因的CDS 區(qū)。TGFβ2基因CDS 區(qū)PCR 擴增條件：95 ℃預(yù) 變 性3 min；95 ℃變 性45 s，59 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃終延伸5 min，4℃保存，PCR 擴增體系為20 μL：cDNA 2 ng/μL，上、下游引物（10 pmol/L）各1.5 μL，2× Es Taq MasterMix10 μL，H2O 補足20 μL。并對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.5 目的基因TGFβ2的克隆 按照北京康為世紀(jì)有限公司膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收，并檢測膠回收產(chǎn)物濃度與純度；將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T 載體進(jìn)行連接反應(yīng)（金屬浴16℃，12 h），涂板轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α；37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)；并挑取平板上的白斑放入10 mL 含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 搖12～16 h；待菌液渾濁后立即進(jìn)行菌液PCR 反應(yīng)；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌液PCR 產(chǎn)物；篩選目的條帶正確的陽性菌液送至（上海）生工生物股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.6 黔北麻羊TGFβ2基因生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果通過DNAStar 軟件比對正確后，使用MegAlign 軟件進(jìn)行同源性分析；在線軟件ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；ProtScal 程序（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)疏水性；SOPMA（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL（www.swissmodel.expasy.org）預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；PSORT II Preadict（https://psort.hgc.jp/form2.html）亞細(xì)胞定位分析；SignalP4.1Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1）進(jìn)行氨基酸信號肽預(yù)測；MEGA6.0 軟件構(gòu)建不同物種中的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增黔北麻羊TGFβ2基因TGFβ2基因熒光定量引物與CDS 區(qū)克隆引物擴增結(jié)果見圖1（A、B），PCR 擴增產(chǎn)物均與預(yù)測片段大小一致，且條帶清晰、單一無二聚體等非特異性片段擴增，可用于下一步實驗。

圖1 凝膠電泳檢測黔北麻羊TGFβ2 基因的PCR 擴增

2.2 黔北麻羊TGFβ2基因T 克隆載體的鑒定 黔北麻羊TGFβ2基因相比于NCBI 中山羊TGFβ2基因的CDS區(qū)序列吻合度高達(dá)99.85%，共發(fā)生2 處突變，均是位于終止密碼子的突變，突變位點位置為第1 327 位堿基由T 突變?yōu)镚，第1 329 位堿基由A 突變?yōu)镚，但均為同義突變，不會引起氨基酸序列的改變，菌液PCR及測序驗證證實TGFβ2基因編碼序列已成功克隆至pMD-19T 載體中，說明pMD-19T-TGFβ2亞克隆載體構(gòu)建成功（圖2、3）。

圖2 黔北麻羊TGFβ2 基因菌液PCR 電泳檢測圖

圖3 黔北麻羊TGFβ2 基因部分克隆與NCBI 上傳序列對比結(jié)果

2.3TGFβ2基因在黔北麻羊不同組織中的表達(dá)分析 由圖4 可知，TGFβ2基因在黔北麻羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢5 個組織中均有表達(dá)，子宮組織表達(dá)量極顯著高于輸卵管和下丘腦組織，顯著高于垂體和下丘腦組織。輸卵管、垂體、下丘腦及卵巢4 個組織間均未達(dá)到差異顯著水平。

圖4 TGFβ2 基因在黔北麻羊不同組織中的表達(dá)

2.4 黔北麻羊TGFβ2基因CDS 區(qū)生物信息學(xué)分析

2.4.1 黔北麻羊TGFβ2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 黔北麻羊TGFβ2基因CDS 區(qū)包含1 329 bp，共編碼442 個氨基酸，分子式C2245H3535N615O662S25，原子總數(shù)7 082，編碼的蛋白分子量50.53 kD，理論等電點8.74；該蛋白中絲氨酸（Ser）含量最多，占氨基酸總量的10.0%，色氨酰胺（Trp）含量最少，占氨基酸總量的1.1%。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為53.17（不穩(wěn)定指數(shù)＞53.0 時為不穩(wěn)定蛋白），為相對不穩(wěn)定蛋白。由圖5 可見，TGFβ2 蛋白第8 位丙氨酸的疏水性最強，為2.856，第326 位精氨酸的親水性最強，為-3.622，負(fù)值氨基酸數(shù)量多于正值氨基酸，證實該蛋白為親水性蛋白，多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性。

2.4.2 黔北麻羊TGFβ2 蛋白高級結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測 結(jié)果顯示，TGFβ2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲所占比例最大，為50.45%，其次是α-螺旋，為32.58%，延伸鏈占比為14.93%，β轉(zhuǎn)角僅占比2.04%。

2.4.3 黔北麻羊TGFβ2 蛋白亞細(xì)胞定位分析 細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，該蛋白可能位于真核生物中，約44.4%位于細(xì)胞壁；33.3%位于核散斑（是一種模式核細(xì)胞）；11.1%位于線粒體；11.1%位于細(xì)胞骨架。推測其在細(xì)胞膜發(fā)揮作用的可能性最大，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核中的可能性最小，猜測其對細(xì)胞的跨膜運輸有一定影響。

2.4.4 黔北麻羊TGFβ2 蛋白信號肽預(yù)測 由圖6 可知，TGFβ2 蛋白具有信號肽，為分泌蛋白，且序列的信號肽剪切位點在第20 號與第22 號氨基酸之間。成熟肽始于第24 位氨基酸。

圖6 黔北麻羊TGFβ2 蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測

2.4.5 黔北麻羊TGFβ2 蛋白氨基酸同源性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 選取綿羊、牛、豬、馬、褐家鼠、雞、狗、黑猩猩及人9 個物種與黔北麻羊TGFβ2基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示黔北麻羊TGFβ2編碼氨基酸序列與綿羊、褐家鼠、黑猩猩、人、牛、豬、雞、狗及馬的同源性分別為99.8%、94.3%、98.2%、98.2%、93.2%、92.1%、83.5%、65.8%、66.1%（圖7）。由此可見，黔北麻羊TGFβ2基因編碼核苷酸序列除在狗和馬中的相似性較低外，其余7 個物種與黔北麻羊的同源相似性均相對較高，綿羊與黔北麻羊的相似性最高，與狗的相似性最低。同時，采用MEGA6.0 軟件構(gòu)建不同物種TGFβ2基因編碼氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，證實黔北麻羊與綿羊的親緣關(guān)系最近，與狗和馬等非反芻動物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；對比的9 個物種親緣關(guān)系依次為黔北麻羊＞綿羊＞牛＞褐家鼠＞豬＞雞＞黑猩猩＞人＞狗＞馬（圖8）。

圖7 黔北麻羊TGFβ2 編碼氨基酸序列同源性分析

圖8 黔北麻羊TGFβ2 編碼氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹

3 討 論

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）超家族在胚胎發(fā)育、器官形成、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，尤其在卵巢形成和卵泡發(fā)育過程中扮演著不可替代的角色，既可通過TGFβ/smad 通路又可通過非smad 通路調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞增殖、分化、凋亡或激素合成[10]。同時以自分泌或旁分泌的方式刺激或抑制細(xì)胞的增殖和分化[11-13]，該家族對動物生殖生理調(diào)控發(fā)揮著重要作用。本實驗成功克隆了黔北麻羊TGFβ2基因編碼序列并與NCBI 中GenBank 數(shù)據(jù)庫中的登錄序列進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)黔北麻羊TGFβ2基因編碼序列與山羊TGFβ2基因編碼序列匹配度達(dá)到99.85%，而終止密碼子的突變并未導(dǎo)致氨基酸的突變。信號肽位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)黔北麻羊TGFβ2 蛋白具有信號肽，信號肽剪切位點在第21～23號氨基酸之間。經(jīng)氨基酸同源性比較、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊與絨山羊[14]TGFβ2基因CDS 區(qū)編碼氨基酸序列與綿羊、牛等哺乳動物的同源性相對較高，在綿羊[15]中TGFβ2基因CDS 區(qū)編碼氨基酸序列與山羊、牛等哺乳動物的同源性相對較高；說明TGFβ2基因CDS 區(qū)編碼氨基酸序列中山羊、綿羊和牛彼此之間的同源性非常接近，均符合物種進(jìn)化規(guī)律。理化性質(zhì)、疏水性分析與亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)黔北麻羊TGFβ2 蛋白可能是一種位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（細(xì)胞質(zhì)55.5%）的不穩(wěn)定親水性蛋白，而在綿羊[15]中TGFβ2 蛋白主要于細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮其生理功能，可能存在種間差異。黔北麻羊TGFβ2 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲與α-螺旋構(gòu)成，這與綿羊[15]和二花臉豬[16]TGFβ2 蛋白均主要由α-螺旋和不規(guī)則卷曲組成的結(jié)果相一致。

本實驗RT-qPCR 結(jié)果得出，TGFβ2基因mRNA 在各組織中均有不同程度的表達(dá)，這與TGFβ2基因在鵝[17]及二花臉豬[16]的卵巢及子宮織織中均有表達(dá)的結(jié)果相一致，但卻與鵝在卵巢的表達(dá)豐度較高、子宮中的表達(dá)豐度較低的結(jié)果相反，或是不同物種之間存在的差異所導(dǎo)致。TGFβ2基因是具有多種功能的細(xì)胞生長因子，能調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生[18]、發(fā)育、分化[19]等生命活動，如在大鼠的卵巢組織中，TGFβ2基因就發(fā)揮著重要功能，它能通過控制卵泡變性或生長（或兩者）來影響卵泡的發(fā)育[20]；在小鼠胚胎移植前，Jovanovic 等[21]使用外源激素過度刺激處理后，極大影響了TGFβ2基因在子宮中的表達(dá)，還可能破壞植入胚胎所建立的妊娠內(nèi)環(huán)境，為防止子宮出現(xiàn)抵制外排胚胎的現(xiàn)象，TGFβ2基因可能在小鼠建立適宜妊娠環(huán)境中扮演著重要角色。Chabot等[22]發(fā)現(xiàn)TGFβ2基因在子宮液中第10～15 天表達(dá)逐漸遞增，且在第15 天的表達(dá)顯著高于第10 天，該基因在后備母豬及妊娠母豬子宮液中高表達(dá)，推測其可能有利于豬的子宮建立妊娠及維持妊娠；而本實驗中TGFβ2基因在子宮組織的表達(dá)最高。綜上所述，TGFβ2基因發(fā)揮的作用可能是維持母畜正常的妊娠環(huán)境而保障能有較高的活產(chǎn)仔數(shù)，通過在子宮中的最高表達(dá)來調(diào)控動物的繁殖性能。Hatzirodos 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ2基因在牛妊娠早期的表達(dá)很低，在妊娠中期增加，并在妊娠晚期保持在較高水平，說明該基因可能對維持牛胎兒的生長發(fā)育有一定影響。此外，在雜交長白種小母豬卵巢組織中發(fā)現(xiàn)TGFβ2基因在卵泡發(fā)育的大、中、小至卵泡成熟階段均有表達(dá)，伴隨著卵泡的階段性生長，各級卵泡中TGFβ2基因表達(dá)均增加且達(dá)到了差異極顯著性水平[24]，說明該基因作用于卵巢并有助于卵泡細(xì)胞的生長和分化。本研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ2基因在黔北麻羊卵巢組織較高表達(dá)，TGFβ2基因可能作用于黔北麻羊卵巢并一定程度上有助于提高其繁殖性能。總之，TGFβ2基因可能作用于黔北麻羊子宮及卵巢組織，通過組織中的較高表達(dá)來影響其繁殖性狀，具體調(diào)控機制仍待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆出黔北麻羊TGFβ2基因的CDS 區(qū)序列，通過RT-qPCR 技術(shù)檢測了TGFβ2基因在黔北麻羊性腺組織中的差異表達(dá)情況，其表達(dá)量依次為子宮＞卵巢＞垂體＞下丘腦＞輸卵管；生物信息學(xué)分析顯示，TGFβ2 蛋白位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，是一種具有信號肽位點的相對不穩(wěn)定的親水性分泌蛋白，其高級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構(gòu)成。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究TGFβ2基因?qū)η甭檠蚍敝承阅艿恼{(diào)控機制提供了基礎(chǔ)。