張帥源 秦碩 李光輝 易雅群 付昊杰 高雅靖 孫明磊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，鄭州450052

口腔頜面部惡性腫瘤是全球十大惡性腫瘤之一，其中約90%為鱗狀細(xì)胞癌，其次為腺性上皮癌，間葉組織來(lái)源腫瘤少見(jiàn)[1]。過(guò)度飲酒、吸煙、咀嚼檳榔、不良習(xí)慣及長(zhǎng)期物理化學(xué)因素的刺激是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）最主要的發(fā)病因素，近年來(lái)有文獻(xiàn)[2-4]報(bào)道人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）也與OSCC發(fā)病有關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后最主要因素，隨著手術(shù)與放、化療等醫(yī)療手段的進(jìn)步，OSCC患者的預(yù)后雖得到相當(dāng)?shù)母纳?，?年生存率仍低于50%[5]，因此尋找一種更為簡(jiǎn)便且有效的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)尤為重要。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是一種有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向的，短暫的腫瘤轉(zhuǎn)移前體細(xì)胞。在1869年由Thomas Ashworth提出，他發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液里存在與自身瘤體相同的細(xì)胞組織，該發(fā)現(xiàn)后續(xù)在1954年被Watanabe等證實(shí)。CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6]，由于CTCs本身來(lái)源于腫瘤組織，與腫瘤組織具有相同的遺傳物質(zhì)[7]，將其用于腫瘤的識(shí)別和定性，特異性極高[8]。但是外周血中的CTCs含量極少，檢測(cè)難度較高，理想的CTCs檢測(cè)方法必須能夠分離并檢測(cè)所有異質(zhì)CTCs，同時(shí)丟棄正常血細(xì)胞的大背景[9]。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，最新的陰性富集及靶向聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)成功解決了上述問(wèn)題，該方法基于CTCs與正常血細(xì)胞表面抗原CD45＋之間的表達(dá)差異，利用免疫磁珠將兩者分離并最大限度的將CTCs純化，大幅提高了檢測(cè)質(zhì)量[10]，這使CTCs在惡性腫瘤的輔助診斷、判斷療效和預(yù)后等方面受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。但目前CTCs與OSCC相關(guān)性的研究報(bào)道較少見(jiàn)。葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）是一組跨膜蛋白，分為α、β和γ三種亞型，由于FR在人體大部分的腫瘤細(xì)胞中都有特異性高表達(dá)，如卵巢癌、肺癌，而在正常組織中少有表達(dá)，是一種理想的CTCs檢測(cè)靶點(diǎn)[11]。據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，OSCC組織中亦可見(jiàn)FR高表達(dá)，本研究應(yīng)用的陰性富集及靶向PCR（FR+CTC）檢測(cè)技術(shù)即利用該點(diǎn)，以腫瘤表面FR為靶點(diǎn)，檢測(cè)OSCC患者外周血的CTCs，分析其與腫瘤患者病理分期、病理亞型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床分期等臨床病理特征間的關(guān)系，探討CTCs檢測(cè)的價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月—2020年5月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的93例OSCC患者為試驗(yàn)組，同期選取20例健康志愿者為對(duì)照組。試驗(yàn)組中，男64例（68.8%），女29例（31.2%），年齡25～78歲，平均年齡（51.50±12.53）歲；對(duì)照組中，男9例（45%），女11例（55%），年齡22～69歲，平均年齡（44.60±12.66）歲。

本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：1）病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌；2）除OSCC外無(wú)其他部位原發(fā)惡性腫瘤以及嚴(yán)重全身性疾??；3）入院前未接受放化療及手術(shù)等其他相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）入院前曾接受放化療及手術(shù)等其他相關(guān)治療；2）嚴(yán)重感染或肝腎功能?chē)?yán)重異常；3）生活不能自理或不能配合治療者。

1.2 CTCs的富集與檢測(cè)

CTCs的檢測(cè)采用負(fù)向富集及靶向PCR檢測(cè)技術(shù)。嚴(yán)格遵循采血標(biāo)準(zhǔn)，取患者3 mL靜脈血，血樣中加入紅細(xì)胞裂解液孵育，紅細(xì)胞裂解后離心，加入CD45+磁珠結(jié)合白細(xì)胞，用磁場(chǎng)捕獲并去除白細(xì)胞，剩余富含CTCs的細(xì)胞群，加入特異性探針（針對(duì)表達(dá)FRα的細(xì)胞設(shè)計(jì)，由靶向FR的葉酸單元與共價(jià)偶聯(lián)的寡核苷酸單元組成）標(biāo)記CTCs，離心，去除上清液游離探針，加入洗脫劑，洗脫與CTCs特異性結(jié)合的探針，制備待測(cè)樣品，加入PCR擴(kuò)增試劑后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增（PCR擴(kuò)增模板的寡核苷酸單元序列為：5’-CTCAACTG‐GTGTCGTTGGGCAATTCAGTTGATTCTAA-3’），經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出3 mL血樣中CTCs的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R4.0.0（R Foundation for Statistical Com‐puting，澳大利亞）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單組間比較使用了Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多組間使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用受試者工作曲線（re‐ceiver operating characteristic curve，ROC）分析外周血CTCs對(duì)OSCC相關(guān)的診斷價(jià)值，并通過(guò)其敏感度和特異性來(lái)計(jì)算約登指數(shù)。多因素分析采用線性回歸模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血CTCs值的比較

OSCC患者的術(shù)前CTCs值中位數(shù)=10.8，四分位范圍=[9.7，13.6]，對(duì)照組的CTCs值中位數(shù)=8.00，四分位范圍=[7.67，8.10]，試驗(yàn)組顯著大于對(duì)照組（P＜0.000 1）（圖1）。

圖1 OSCC組與對(duì)照組CTCs的比較Fig 1 Comparison of CTCs values between OSCC group and the control group

2.2 外周血CTCs與OSCC臨床病理特征的關(guān)系

外周血CTCs與患者的性別、周?chē)M織浸潤(rùn)、發(fā)病部位等無(wú)關(guān)（P＞0.05）。與患者的年齡（P=0.022）、OSCC的分化程度（P＜0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.006 4）、腫瘤T分期（P=0.02）、N分期（P=0.007 5）及臨床分期（P=0.029）、早晚期相關(guān)（P=0.022）等相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。M1期患者CTCs值較M0期顯著增高，Ⅲ+Ⅳ期患者CTCs值高于Ⅰ+Ⅱ期者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1、圖2）。

圖2 CTCs與OSCC臨床病理特征的關(guān)系圖Fig 2 The relationship between CTCs and clinicopathological features of OSCC patients

表1 OSCC患者外周血CTCs與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 The relationship between CTCs and clinico‐pathological features of OSCC patients

2.3 CTCs診斷價(jià)值分析

2.3.1 外周血CTCs檢測(cè)對(duì)OSCC的診斷價(jià)值 應(yīng)用CTCs診斷OSCC的AUC值為0.925，檢驗(yàn)?zāi)苄杂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.000，95%CI（0.876，0.974）]，當(dāng)CTCs值為8.450 FU/3 mL時(shí)，約登指數(shù)最大為0.853，敏感度90.3%，特異性95.0%（圖3）。

圖3 CTCs用于診斷OSCC的ROC曲線Fig 3 The ROC curve of CTCs in diagnosis of OSCC

2.3.2 外周血CTCs檢測(cè)對(duì)OSCC轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值應(yīng)用CTCs診斷OSCC轉(zhuǎn)移的AUC值為0.691，檢驗(yàn)?zāi)苄杂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.000，95%CI（0.580，0.803）]，當(dāng)CTCs值為12.250 FU/3 mL時(shí)，約登指數(shù)最大為0.367，敏感度63.6%，特異性73.3%（圖4）。

圖4 CTCs用于診斷OSCC轉(zhuǎn)移的ROC曲線Fig 4 The ROC curve of CTCs in diagnosis of OSCC metastasis

2.4 CTCs與OSCC患者臨床病理特征之間的多因素回歸分析

將單因素分析中P＜0.2的變量全都納入到了多因素線性回歸模型中。納入的變量包括性別、年齡、發(fā)病部位、分化程度、周?chē)M織浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、M分期以及臨床分期等。使用逐步回歸法篩選變量，得到以下模型。腫瘤原發(fā)于頰部與OSCC患者CTCs值呈負(fù)相關(guān)（P=0.001 08）；N2分期（P=0.000 74）及M分期（P=0.026 38）與OSCC患者CTCs值呈正相關(guān)；腫瘤分化程度中高分化（P＜0.000 1）和中分化（P=0.001 5）與OSCC患者CTCs值呈負(fù)相關(guān)，分化越高，CTCs值越低。

表2 CTCs與OSCC患者臨床病理特征之間的多元素回歸分析Tab 2 Multielement regression analysis of clinicopathological features between CTCs and OSCC patients

3 討論

在OSCC臨床診治中發(fā)現(xiàn)有部分TNM分期較早的患者，雖無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)，并接受了根治性手術(shù)，但仍在一段時(shí)間后發(fā)生了腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，考慮這部分早期OSCC患者術(shù)前已發(fā)生了微轉(zhuǎn)移，此前常規(guī)的術(shù)前臨床檢查手段并不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的亞臨床病灶[13]，隨著醫(yī)療水平的提高，近年來(lái)應(yīng)用CTCs等“液體活檢”技術(shù)為篩查OS‐CC提供了新的思路[14-16]。

CTCs是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體瘤病灶脫落，進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，并可以在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[17]。腫瘤釋放至外周血中CTCs的多少，可直接的反映出腫瘤發(fā)生、發(fā)展的功能狀態(tài)。在乳腺癌[18]、肺癌[19]等腫瘤中，CTCs已成為了較可靠的腫瘤標(biāo)記物，用于評(píng)估患者的治療效果、無(wú)進(jìn)展生存期和預(yù)后[20]。CTCs在口腔頜面部腫瘤中的研究起步稍晚，Buglione等[21]研究表明CTCs在頭頸部腫瘤患者中表達(dá)水平與腫瘤分期、腫瘤負(fù)荷、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這些高危參數(shù)顯著相關(guān)。

目前CTCs檢測(cè)方法較多，各類方法靈敏度及特異性參差不齊。本研究采用的陰性富集及靶向PCR檢測(cè)技術(shù)較為先進(jìn)，有較高的臨床參考價(jià)值。通過(guò)檢測(cè)，單因素分析中OSCC患者外周血CTCs與健康人群相比明顯升高，表明CTCs值的升高與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，有助于腫瘤的早期診斷，這與其他學(xué)者[22]的研究一致。在CTCs與OSCC臨床特征關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，≥60歲組患者的CTCs值明顯較高，考慮可能與該組患者中Ⅳ期占比較高（48%）有關(guān)，說(shuō)明年齡為OSCC危險(xiǎn)因素之一，老年患者更應(yīng)密切隨訪，這是腫瘤治療過(guò)程中關(guān)鍵步驟。在外周血CTCs與OSCC臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，CTCs與OSCC的分化程度相關(guān)，腫瘤分化程度越低，惡性程度越高，外周血CTCs值越高，反之亦然，筆者認(rèn)為可能是因?yàn)閻盒猿潭雀叩哪[瘤更易侵入小血管壁，從而更易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。OSCC組患者中，外周血CTCs值隨T分期、N分期增高而呈總體上升趨勢(shì)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，M1期組高于M0期組，表明外周血CTCs水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)密切相關(guān)，臨床上遇到CTCs檢測(cè)值較大的患者，醫(yī)生應(yīng)盡可能完善相關(guān)檢查，確定腫瘤負(fù)荷大小，有無(wú)臨床轉(zhuǎn)移跡象，明確手術(shù)適應(yīng)證。另外CTCs與有無(wú)腫瘤周?chē)M織浸潤(rùn)之間雖差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有腫瘤周?chē)M織浸潤(rùn)組CTCs值較無(wú)浸潤(rùn)組增高，考慮可能由于樣本量不足導(dǎo)致偏倚，后續(xù)筆者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步比較。在CTCs與臨床分期的關(guān)系研究中也發(fā)現(xiàn)，CTCs與患者臨床分期相關(guān)，發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期患者的CTCs值較Ⅰ+Ⅱ期者明顯升高，這與周士超等[23]的研究結(jié)果相一致，表明通過(guò)檢測(cè)CTCs值有助于輔助判斷患者臨床分期，對(duì)OSCC臨床診療有一定的指導(dǎo)意義。由于僅依靠單因素分析，各變量的真實(shí)效應(yīng)有可能被其他混雜變量所掩蓋，因此增加了多因素分析控制偏倚，通過(guò)推導(dǎo)CTCs與OSCC之間的線性回歸方程得出頰部，N2分期，M分期，中、高分化程度等因素均為OSCC患者術(shù)前CTCs的獨(dú)立影響因素。以上結(jié)果表明檢測(cè)CTCs有助于判斷腫瘤的惡性程度、進(jìn)展情況、病理分級(jí)，CTCs值可一定程度反映出腫瘤的活躍程度和疾病的進(jìn)展程度，可成為較為可靠的腫瘤監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。本研究通過(guò)對(duì)照組和OSCC組CTCs值繪制ROC曲線，計(jì)算出應(yīng)用CTCs值診斷OSCC的AUC值為0.925，通過(guò)其敏感度及特異性計(jì)算出其約登指數(shù)為0.853，所對(duì)應(yīng)的外周血CTCs值為8.450 FU/3 mL，敏感度與特異性均＞90%，有較高的檢驗(yàn)效能和臨床診斷價(jià)值。將其應(yīng)用于OSCC的篩查和輔助診斷，當(dāng)CTCs檢測(cè)值＜8.450 FU/3 mL時(shí)，有較小患癌可能，若高于此值，則需密切隨訪或行必要的檢查來(lái)排查患癌可能。同樣通過(guò)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組之間CTCs值繪制ROC曲線，評(píng)估CTCs對(duì)OSCC轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值，計(jì)算出AUC值為0.367（P=0.000），約登指數(shù)為0.44，相對(duì)應(yīng)的CTCs值為12.250 FU/3 mL，敏感度為63.6%，特異性為73.3%，當(dāng)OSCC患者CTCs值＞12.250 FU/3 mL時(shí)有較大轉(zhuǎn)移可能，具有一定的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，CTCs的檢測(cè)對(duì)于OSCC的早期篩查、輔助診斷及轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)等均具有重要的臨床意義。本研究也存在一定不足，由于隨訪時(shí)間較短，未能進(jìn)行完整的預(yù)后分析，后續(xù)將加強(qiáng)隨訪，進(jìn)一步探討CTCs對(duì)OSCC預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

綜上所述，外周血CTCs的檢測(cè)，對(duì)OSCC的早期篩查、輔助診斷、評(píng)估轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤的惡性程度，進(jìn)展情況、病理分級(jí)等均有較為重要的臨床價(jià)值，是一個(gè)較為可靠的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。