PCR微流控芯片產(chǎn)業(yè)化技術(shù)分析

蔡樹衡

摘要：微流控PCR芯片以其卓越的技術(shù)革新和進(jìn)步，逐步進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化和市場(chǎng)化的階段，但是當(dāng)前仍然面臨成本高昂、產(chǎn)業(yè)化程度低等困難，制約著微流控芯片的發(fā)展。本文從微流控芯片的發(fā)展現(xiàn)狀出發(fā)，提出產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的技術(shù)分析和思考。

一、PCR微流控芯片的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

微流控芯片（Microfluidic Chip）是將分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，以自動(dòng)完成分析全過程。微流控技術(shù)是體外診斷領(lǐng)域具有前景的底層技術(shù)平臺(tái)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。PCR是核酸檢測(cè)檢測(cè)的核心技術(shù)。

以微流控芯片實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)過程，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1）分析更高效：在PCR檢驗(yàn)領(lǐng)域，微流控芯片的微通道具有非常高的傳質(zhì)和傳熱效率，能夠?qū)⒃\斷檢測(cè)過程縮短至最低 10-15 分鐘;

2）精確度/重現(xiàn)度高：商業(yè)化微流控PCR精確度和可重現(xiàn)性理論上媲美業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)（RT-PCR）;

3）核酸絕對(duì)定量檢測(cè)：微流體數(shù)字PCR產(chǎn)品基于微流控和泊松分布原理，可實(shí)現(xiàn)核酸的高通量、絕對(duì)定量檢測(cè);

4）自動(dòng)集成化：采用微加工機(jī)技術(shù)，將所需要的微通道集成到一塊基板上面，全部檢測(cè)過程可在芯片內(nèi)部完成，實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)全自動(dòng)化。

二、微流控芯片專利技術(shù)情況

祁恒、王立東、劉瑞東、辛海明、等發(fā)表的《PCR微流控芯片技術(shù)專利分析》，通過對(duì)PCR微流控芯片技術(shù)的相關(guān)專利申請(qǐng)進(jìn)行檢索與分析，對(duì)PCR微流控芯片技術(shù)的現(xiàn)狀、特點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行研究。該文檢索截止時(shí)間為2020年4月3日，得到所要分析的國(guó)內(nèi)外專利申請(qǐng)樣本，共計(jì)353件專利（合并同族后為299項(xiàng)專利）。該文的主要結(jié)論是：排名前十位的申請(qǐng)人中，除美國(guó)佳能生命科學(xué)公司以外，其他主要申請(qǐng)人均為國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人，包括排名第一的北京工業(yè)大學(xué)，排名第二的清華大學(xué)等等。主要研發(fā)方向集中在包含酶、核酸或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法;其所用的組合物或試紙;這種組合物的制備方法;在微生物學(xué)方法或酶學(xué)方法中的條件反應(yīng)控制等。

該文的結(jié)論是：由于 PCR 微流控芯片技術(shù)具有較高的前沿性，全球?qū)＠暾?qǐng)總量并不大，但是近些年專利申請(qǐng)量有增加的趨勢(shì)。由于我國(guó)出臺(tái)了多項(xiàng)與生物芯片技術(shù)密切相關(guān)的政策，所以近些年關(guān)于PCR 微流控芯片技術(shù)的專利申請(qǐng)?jiān)谥袊?guó)公開的專利數(shù)量最多，我國(guó)已經(jīng)成為PCR 微流控芯片技術(shù)研究最活躍的國(guó)家，而主要?jiǎng)?chuàng)新主體為高校與科研院所。

由此可見，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)PCR微流控芯片的技術(shù)攻關(guān)，開發(fā)適用于工業(yè)化生產(chǎn)的芯片產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)微流控芯片技術(shù)的推廣應(yīng)用，培育高價(jià)值產(chǎn)業(yè)，應(yīng)該具備很好的技術(shù)基礎(chǔ)。

三、PCR微流控芯片產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的制約因素

3.1生產(chǎn)成本比較高。傳統(tǒng)PCR技術(shù)成熟，成本較底。PCR微流控芯片生產(chǎn)過程復(fù)雜，需要精密的加工，復(fù)雜的生產(chǎn)工藝，而且良品率不高。

3.2專利技術(shù)壁壘。微流控芯片研發(fā)周期長(zhǎng)、研發(fā)進(jìn)度慢、研發(fā)成本高等因素，產(chǎn)品線也不夠豐富，目前應(yīng)用較為廣泛的是熒光免疫類分析儀，核酸檢測(cè)領(lǐng)域比較少。一些微流控前沿公司設(shè)置的一系列專利布局和壁壘的完善，后來的研發(fā)企業(yè)如果不對(duì)細(xì)分專利領(lǐng)域進(jìn)行嚴(yán)加勘察，便很容易被起訴侵權(quán)。

3.3應(yīng)用場(chǎng)景不清晰。PCR微流控芯片主要應(yīng)用場(chǎng)景的POCT目前技術(shù)還不成熟，而高通量PCR實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品，則與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，具有效果差，耗材費(fèi)用高等缺點(diǎn)。

四、PCR微流控芯片的關(guān)鍵技術(shù)

PCR微流控芯片的關(guān)鍵技術(shù)，在于研制可供量產(chǎn)的微流控芯片，設(shè)計(jì)和優(yōu)化微流控芯片的結(jié)構(gòu)、布局以及功能，實(shí)現(xiàn)前處理和擴(kuò)增兩個(gè)主要的技術(shù)需求。芯片加樣后全密封，保障使用環(huán)境無(wú) PCR 實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求。從樣品加入到結(jié)果檢出小于30分鐘。最終芯片可達(dá)到移液誤差<5%，溫度偏差<0.2℃，溫度波動(dòng)<0.1℃。

4.1區(qū)域流道設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)前處理結(jié)構(gòu)件，包含可封閉的開口用加樣、混勻的結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)磁珠富集方案，防止內(nèi)部物質(zhì)流出污染環(huán)境。芯片包含試劑釋放區(qū)、核酸提取區(qū)、液體混合區(qū)、預(yù)擴(kuò)增區(qū)、檢測(cè)區(qū)及液滴流道，做到控制各種試劑間互不干擾，按程序進(jìn)入各區(qū)域工作。優(yōu)化芯片運(yùn)行過程中各步驟的移液準(zhǔn)確度、速度等相關(guān)參數(shù)。

4.2溫控系統(tǒng)設(shè)計(jì)

根據(jù)各區(qū)域的工作溫度需求獨(dú)立設(shè)計(jì)芯片的溫控模塊，計(jì)算各部分需要的熱容量、導(dǎo)熱系數(shù)并推導(dǎo)出維持設(shè)定溫度所需輸入的功率，以確保溫控的準(zhǔn)確度，且不同溫區(qū)獨(dú)立控制互不影響。

4.3試劑預(yù)存方法

設(shè)計(jì)各組分試劑的尺寸結(jié)構(gòu)，及相應(yīng)的條件通透密封結(jié)構(gòu)，使內(nèi)部試劑可按程序釋放至指定區(qū)域，建立可在微小結(jié)構(gòu)中預(yù)存、凍干、固定化試劑的方法及工藝。

4.4雙溫區(qū)快速PCR反應(yīng)

在芯片中通過雙溫區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)快速PCR反應(yīng)。具體是，設(shè)置2～3個(gè)溫區(qū)，獨(dú)立自主控溫，恒溫期間功率低，無(wú)需額外散熱，并且可以自主控制液滴移動(dòng)，讓反應(yīng)液在指定溫區(qū)中來回運(yùn)動(dòng)以實(shí)現(xiàn)1～2秒內(nèi)完成高低溫轉(zhuǎn)變，從而大幅縮短反應(yīng)升降溫時(shí)間，實(shí)現(xiàn)超快速PCR反應(yīng)。同時(shí)減輕了設(shè)備重量和功率，各芯片可獨(dú)立運(yùn)行，提高了靈活性。

五、PCR微流控芯片的設(shè)計(jì)和加工

設(shè)計(jì)和加工微流控芯片是研究的基礎(chǔ)所在。根據(jù)具體的研究以及實(shí)驗(yàn)所需要分析的目的，微流控芯片的結(jié)構(gòu)迥異。主體結(jié)構(gòu)分為上下兩層片基，由 PMMA、PDMS、玻璃等材料所制成，其中包括了微通道，微結(jié)構(gòu)、進(jìn)樣口，檢測(cè)窗等結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成。外圍設(shè)備有蠕動(dòng)泵、微量注射泵、溫控系統(tǒng)、以及紫外、熒光、電化學(xué)、色譜等檢測(cè)部件。

PCR微流控芯片固定擴(kuò)增式、連續(xù)流動(dòng)式、熱對(duì)流驅(qū)動(dòng)式等方式。液滴在芯片中形成不同的溫度梯度，從而達(dá)到擴(kuò)增的目的。解決傳統(tǒng)PCR加熱體積大，熱循環(huán)速度慢的缺點(diǎn)，具有更快的溫度傳導(dǎo)速度、易于集成。

總結(jié)：PCR和微流控芯片相結(jié)合，相比于傳統(tǒng)的PCR定量擴(kuò)增方法，靈敏度更高，定量更準(zhǔn)確，是最有發(fā)展前景的PCR技術(shù)。隨著微流控制作工藝的提升，并且在微閥、微泵、微反應(yīng)器等功能元器件的組合下，功能將越來越豐富，應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻(xiàn)：

[1]祁恒、王立東、劉瑞東、辛海明、等。PCR微流控芯片技術(shù)專利分析。中國(guó)發(fā)明與專利.2020，17（11）