艾地苯醌對血小板生物學(xué)特性影響的初步研究*

林俊填 麥志周 楊富燕 伍偉健 劉運芝 余玉婷

艾地苯醌是一種輔酶Q10的類似物，能激活線粒體電子鏈系統(tǒng)，促進ATP的生成，改善腦缺血、缺氧時的能量代謝，而且還具有抗氧化作用，可消除腦缺血、缺氧時產(chǎn)生的大量自由基，從而阻止自由基對線粒體膜的脂質(zhì)過氧化，保護線粒體膜維持其正常的生理機能[1-3]。因此，其主要用于治療慢性腦血管病及腦外傷等所引起的腦功能損害。另外，艾地苯醌還具有抗動脈粥樣硬化的作用[4]，是腦能量代謝的一種改善劑[5]。血小板胞漿內(nèi)有豐富的線粒體，其主要功能是進行生物氧化，產(chǎn)生ATP供血小板活動所需。雖然臨床上進行血小板輸注越來越常見，但血小板體外保存時間短一直是臨床輸血領(lǐng)域公認(rèn)的難題。本文主要研究艾地苯醌對血小板生物學(xué)特性的影響，探討其在血小板保存方面是否有潛在的應(yīng)用價值。

材料與方法

1 實驗儀器 血小板聚集儀（北京STEELEX公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司）、血小板保存箱（美國Helmer公司）、高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）、Milli-Q 超純水裝置（美國Millipore公司）、-80 ℃低溫冰箱（日本三洋公司）。

2 主要試劑與藥品 血小板粘附管（江蘇金壇試劑站）、ADP（美國sigma公司），GSH（批號：20200916，南京建成生物工程研究所）、MDA試劑盒（批號：20201018，南京建成生物工程研究所）和JC-1檢測試劑盒（批號：20200824，南京建成生物工程研究所）；CD62p-FITC（批號：348936，美國BD公司）；CD61-PE（批號：346035，美國BD公司）、小鼠IgG1-FITC（批號：719522，美國BD公司）、小鼠IgG1-PE（批號：742633，美國BD公司）。

3 標(biāo)本來源 本站單采的富血小板血漿標(biāo)本6例。

4 方法

4.1 貧/富血小板血漿的制備：取本站單采血小板6例標(biāo)本進行實驗。為避免單采血小板可能殘留的紅細胞（RBC）的干擾，我們先將單采血小板混勻后置于50 mL一次性無菌離心管中，以1 000 r/min離心10 min，小心取上清置于新離心管中，此上清液即為富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）。將上述富血小板血漿吸于中號培養(yǎng)皿中，置于血小板培養(yǎng)箱中恒溫振蕩保存。剩余的血漿繼續(xù)以3 000 r/min離心15 min后用相同的方法取出上清液，即可得貧血小板血漿（platelet poor plasma, PPP），備用。用自動血液計數(shù)儀檢測PRP中含有的血小板數(shù)目，檢測三次取平均值，用血細胞保養(yǎng)液ACD-A（亦可用pH 7.4 PBS緩沖液）調(diào)整血小板計數(shù)濃度為200×109/L。為方便后述實驗，我們根據(jù)實驗需要分別取3 mL PRP置于干凈培養(yǎng)皿中，并加入終濃度為10 μg/mL艾地苯醌濃縮液（DMSO配制）作為實驗組，另一培養(yǎng)皿中取3 mL PRP加入艾地苯醌濃縮液等量的空白DMSO作為實驗對照組[6]。將上述培養(yǎng)皿置于血小板專用保存箱中恒溫振蕩保存6 h。

4.2 血小板粘附率的檢測：采用血小板粘附管（玻珠柱）法進行測定，將粘附管與注射針進行連接，并從培養(yǎng)皿中直接吸取PRP，當(dāng)PRP接觸玻璃珠時，開始計時，掌握好血液通過玻珠柱的速度，使血漿通過四等分的玻珠時，每段時間為5 s，共計20 s。分別采集玻珠柱前后端的PRP，進行手工法血小板計數(shù)，計算血小板粘附率，每例標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

4.3 血小板聚集率的檢測：PPP管采用與PRP管相同稀釋方法進行稀釋，以稀釋后PPP管作為血小板聚集實驗的空白對照。應(yīng)用四通道血小板聚集儀檢測血小板的聚集率，在檢測前打開儀器預(yù)熱至37 ℃，比色皿內(nèi)加入轉(zhuǎn)子、稀釋后的PRP或PPP溶液，將比色皿放到血小板聚集儀通道中預(yù)熱5 min后進行測量，分別加入1.0 mmol/L的ADP，檢測血小板的最大聚集率，每例標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

4.4 艾地苯醌處理前后MDA、GSH的對比：分別吸取相應(yīng)劑量的PRP，嚴(yán)格按相關(guān)試劑的說明書進行操作與檢測（比色法），每例標(biāo)本設(shè)3個平行管，取平均值。

4.5 流式細胞儀的檢測

4.5.1 血小板膜表面CD62p的變化：按照文獻[7]分析血小板CD62p的檢測方法進行血小板陽性率的測定。在對照管和試驗管中各加入血小板懸液5 μL，再分別加入10 μL小鼠免疫球蛋白IgGl-FITC抗體、10 μL小鼠IgGl-PE抗體、10 μL CD62p-FITC抗體和10 μL CD61-PE抗體，使血液標(biāo)本與各種試劑輕輕混勻后，放在實驗室陰暗處、避光保存15～20 min左右。加入磷酸鹽緩沖液0.5 mL,準(zhǔn)備上機檢測。使用光源488 nm的氬激光，流式細胞術(shù)獲取并分析3×104個血小板，通過前向角散射光FSC、側(cè)向角散射光SSC和CD61-PE染色的對數(shù)圖設(shè)門識別血小板群，然后分析門內(nèi)血小板CD62p的陽性率。每例標(biāo)本重復(fù)測定3次，取平均值。

4.5.2 膜電位JC-1的檢測：嚴(yán)格按試劑盒說明進行操作，取 200 μL JC-1工作液，加入5 μL濃縮血小板，混勻后置于暗室中孵育30 min，加入1%多聚甲醛800 μL，于4 ℃避光繼續(xù)孵育30 min，混勻后上流式細胞儀進行檢測。取5 μL濃縮血小板加入50 μL PBS作為空白對照。同樣捕獲3×104個血小板作參數(shù)分析，以陽性百分比（%）表示結(jié)果。每例標(biāo)本重復(fù)測定3次，取平均值。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究應(yīng)用 Graphpad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組組別間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血小板粘附試驗 結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后的實驗組，血小板粘附率有一定的下降，詳見表1。

2 血小板聚集試驗（ADP誘導(dǎo)法） 經(jīng)10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后的實驗組，與對照組相比，血小板聚集能力亦有一定程度的下降，詳見表格1。

3 MDA和GSH檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，經(jīng)10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后，實驗組的MDA和GSH水平與對照組之間均有顯著性的差異，詳見表1。

4 流式細胞檢測結(jié)果 結(jié)果顯示10 μg/mL艾地苯醌作用后，血小板膜上的CD62p表達與對照組間無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；而實驗組JC-1較對照組有一定程度的增加，且兩者間有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表1，圖1。

圖1 流式細胞儀檢查血小板CD62p和JC-1指標(biāo)變化

表1 艾地苯醌作用前后血小板相關(guān)指標(biāo)的變化表

討 論

紅細胞采集后使用不同的保養(yǎng)液保存，可使體外保存時間得到明顯延長，如ACD保存液體可保存紅細胞21天，而使用MAP和SAGM紅細胞添加液可使紅細胞保存時間延長至35天，使用AS-1或AS-3可延長至42天[8]。反觀血小板的體外保存情況，多種因素都可能引起離體血小板失去活性。采用血小板專用保存袋，使用正確的保存溫度與振蕩條件，單采血小板在體外室溫下也最多可保存5天。因此，如何延長血小板的體外室溫保存時間也一直是困擾臨床輸血領(lǐng)域的難題。

CD62p又稱GMP140、P-選擇素，是選擇素超家庭的成員之一，是一種血小板膜蛋白，選擇性分布于靜止血小板或巨核細胞內(nèi)的α顆粒中，血小板活化時，α顆粒迅速與血小板膜整合并釋放CD62p，使之出現(xiàn)于血小板表面，因此，CD62p的表達是血小板活化的一個特征指標(biāo)[9]。

線粒體膜電位是指線粒體內(nèi)膜兩側(cè)離子濃度不同所產(chǎn)生的跨膜電位差，是ATP合成和釋放的動力，是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)[10]。JC-1是一種碳氰化合物類陽離子熒光染料，可跨膜進入活細胞內(nèi)定位于線粒體膜上，其聚集程度隨線粒體膜電位升高而增加。單體在激發(fā)光為527 nm時，呈綠色熒光；聚集體在激發(fā)光為590 nm時，呈紅色熒光。JC-1特異性地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，只在線粒體膜電位崩解時才釋放出來[11]。

脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛MDA在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷，因而測試MDA的量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反應(yīng)出細胞損傷的程度。谷胱甘肽GSH作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，能夠清除人體內(nèi)的自由基[12]；由于GSH本身易受某些物質(zhì)氧化，所以它在體內(nèi)能夠保護許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被有害物質(zhì)氧化，從而保證蛋白質(zhì)和酶等分子生理功能的正常發(fā)揮[13]。因此，測定體液或細胞內(nèi)GSH和MDA水平是常用的反映氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。

文獻報道[6]艾地苯醌可以明顯的保護骨髓間質(zhì)干細胞，促進細胞增殖并減少細胞凋亡。受此啟發(fā)，本研究主要是通過艾地苯醌減少血小板胞內(nèi)的氧化應(yīng)激從而達到延長血小板壽命的目的。研究結(jié)果顯示，應(yīng)用10 μg/mL艾地苯醌作用后，實驗組較對照組GSH水平有一定的增加，而MDA水平有一定程度的下降，此結(jié)果說明細胞胞內(nèi)的抗氧化水平提高。另外，結(jié)果還顯示胞內(nèi)的JC-1水平提高，說明血小板的線粒體活性得到增強。以上結(jié)果說明艾地苯醌應(yīng)該對血小板的壽命有一定保護作用。結(jié)果還顯示，艾地苯醌實驗組與對照組相比，血小板的粘附率和最大聚集率均有一定程度的下降，說明艾地苯醌可能會影響到血小板的粘附與聚集功能。流式細胞檢測CD62p結(jié)果顯示實驗組較對照組無顯著性差異，則說明血小板沒有脫顆粒與活化，這幾個結(jié)果說明艾地苯醌可能對血小板的粘附、聚集和脫顆粒功能產(chǎn)生抑制作用。有文獻報道[14]艾地苯醌可以抑制血小板聚集，其機制是可能影響TXB2的生成，與本文的結(jié)果基本一致。以上結(jié)果亦可間接說明，目前艾地苯醌主要用于缺血性腦損傷的治療，一方面有利于幫助腦部神經(jīng)細胞功能的恢復(fù)，另一方面則對防止腦血栓的形成有一定幫助。

綜上所述，本研究結(jié)果提示10 μg/mL艾地苯醌可影響血小板內(nèi)的線粒體功能，改善血小板內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而有利于血小板的保存。但是，本研究結(jié)果也初步證實艾地苯醌對血小板的粘附、聚集和顆粒釋放等生物學(xué)功能有一定的影響，這對于血小板保存和臨床應(yīng)用方面又是一種不利的影響。因此，艾地苯醌在血小板的保存中能否應(yīng)用，還需要進一步的實驗研究與探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突