張婧楷， 劉瀟璇， 李莉莉

（1. 中國藥科大學(xué)，天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥物科學(xué)研究院高端藥物制劑與材料研究中心，南京 210009；2. 國家納米科學(xué)中心，中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，北京 100190）

多肽是由各種氨基酸通過肽鍵按照一定順序共價(jià)連接而成的，其分子量介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間。由于多肽源自于生物體內(nèi)，因此多肽材料具有良好的生物相容性和可降解性[1,2]。通過調(diào)控多肽分子中氨基酸的種類、數(shù)量和順序，或在氨基酸上修飾各種不同的官能團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)多肽的自組裝。多肽自組裝材料比多肽本身具有更高的穩(wěn)定性和更好的治療、靶向等性能，廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3-5]。本課題組發(fā)展了一系列具有自組裝性能的多肽材料，在癌癥診斷及治療、細(xì)菌感染診斷及治療等方面具有廣泛的應(yīng)用[6-8]。

糖類是存在于自然界的一類主要生物分子，結(jié)構(gòu)極為多樣和復(fù)雜，具有從能源到生物結(jié)構(gòu)多方面的功能[9,10]。糖對蛋白質(zhì)的修飾是蛋白質(zhì)翻譯后的主要修飾之一，對多種關(guān)鍵生物過程（包括蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸、細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長和細(xì)胞分化等）至關(guān)重要[11-13]。蛋白質(zhì)的異常糖基化會擾亂細(xì)胞內(nèi)識別，與包括癌癥和自身免疫性疾病在內(nèi)的許多嚴(yán)重疾病有關(guān)。免疫系統(tǒng)主要依靠細(xì)胞免疫來消除病毒和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)感染，但是此類細(xì)胞可能利用異常糖基化結(jié)構(gòu)逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和識別[14,15]。病毒也利用宿主的糖基化機(jī)制組裝其自身的包膜糖蛋白，從而有助于避免免疫檢測[16]。在自身免疫性疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，免疫球蛋白G（IgG）糖型發(fā)生顯著變化。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，IgG聚集的半乳糖基糖型被甘露糖結(jié)合凝集素特異性識別，從而可能不適當(dāng)激活先天免疫系統(tǒng)[17]。此外，在腫瘤的發(fā)展過程中，細(xì)胞表面糖類的分布有顯著變化，似乎與轉(zhuǎn)移的狀態(tài)有關(guān)。糖類豐富的生物學(xué)特性在其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和治療發(fā)展方面引起了越來越多的關(guān)注[18-21]。然而，天然糖類的復(fù)雜性和異質(zhì)性給其生產(chǎn)和表征帶來了巨大困難，對進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾、機(jī)理研究和藥物應(yīng)用造成了極大限制。為了充分利用糖類的優(yōu)勢，同時(shí)規(guī)避天然材料的缺點(diǎn)，人們在制備均質(zhì)低聚糖和多糖方面進(jìn)行了諸多努力[22-24]。

糖肽高分子材料是糖基基團(tuán)通過共價(jià)鍵與多肽相連所形成的一類分子。糖肽樹形分子是一種典型的支狀糖肽高分子材料，一般為納米尺度，通常由3個(gè)部分組成：樹形分子的核、分支單元和末端基團(tuán)。糖肽樹形分子的核心位于分子最里層；有著精確設(shè)計(jì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的分支單元在核和分子表面之間；一般由氨基酸組成的末端基團(tuán)位于分子表面，可以修飾不同糖基基團(tuán)而產(chǎn)生不同生物學(xué)應(yīng)用。末端具有的大量基團(tuán)可以進(jìn)行多位點(diǎn)糖基化修飾，在糖基與受體相互作用中發(fā)揮多價(jià)效應(yīng)。肽類骨架因具有易獲得性、高化學(xué)多樣性和良好的生物相容性等優(yōu)勢而受到了廣泛的關(guān)注。更重要的是，通過自組裝的方式將糖類以聚集方式呈現(xiàn)給相關(guān)受體，可實(shí)現(xiàn)多價(jià)相互作用[25-28]。因此，自組裝糖肽高分子材料也是一個(gè)重要的研究方向。多肽分子間可以通過氫鍵、靜電相互作用、π-π 堆積、疏水作用等分子間作用力自組裝形成不同的超分子結(jié)構(gòu)[29-31]。糖對多肽的修飾不僅賦予了多肽許多生物功能，也會改變多肽的結(jié)構(gòu)。自組裝糖肽高分子材料中各種糖基基團(tuán)的加入拓寬了糖肽分子在自組裝時(shí)的氫鍵作用，增加了自組裝糖肽高分子材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，拓寬了多肽自組裝的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

本文綜述了糖肽材料的化學(xué)合成、設(shè)計(jì)策略及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用（圖1），重點(diǎn)介紹了糖肽納米材料的構(gòu)建策略，并對糖肽領(lǐng)域的發(fā)展前景和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論。

圖1 糖肽高分子材料及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用Fig. 1 Schematic illustration of development of glycopeptide-based polymers and its applications

1 糖肽材料的化學(xué)合成

1.1 糖基化氨基酸的合成

幾乎所有天然形成的糖苷鍵都可分為2大類：N-糖苷類（與天冬酰胺側(cè)鏈相連）與O-糖苷類（與絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）的側(cè)鏈相連，也有少見的與羥賴氨酸（Hyl）和羥脯氨的酸側(cè)鏈相連）。目前，最常觀察到的多肽/蛋白糖基化位點(diǎn)是天冬酰胺（Asn）側(cè)鏈的酰胺氮。這是在特定的序列Asn-X-Thr/Ser上完成的，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。下一個(gè)位置的Ser或Thr殘基對糖基化是絕對必要的。在自然產(chǎn)生的O-糖蛋白中，最豐富的碳水化合物是N-乙酰-D-半乳糖胺（N-Acetyl-D-galactosamine，GalNAc）殘基與絲氨酸或蘇氨酸結(jié)合的α-O-糖苷，因此，大量的工作致力于建立適當(dāng)保護(hù)的α-GalNAc-Thr/Ser構(gòu)建塊。由于人們普遍認(rèn)為β-O-N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetyl-D-Glucosamine，GlcNAc）-Ser/Thr部分在蛋白質(zhì)的瞬時(shí)修飾中具有調(diào)控作用，因此人們也對β-O-GlcNAc-Ser/Thr部分的合成給予了很多關(guān)注。此外，α-甘露糖（Mannose，Man）-Thr/Ser、α-半乳糖（galactose，Gal）-Hyl以及其他O-糖苷化氨基酸也逐漸引起人們的關(guān)注。

1.2 糖肽的合成

糖肽化學(xué)合成的一個(gè)關(guān)鍵步驟是將糖基與多肽共價(jià)偶聯(lián)。為了達(dá)到這一目的，可以考慮兩種方法：一個(gè)是對適當(dāng)保護(hù)的全長多肽進(jìn)行直接糖基化；另一個(gè)是使用預(yù)先形成的糖基化氨基酸構(gòu)建塊逐步合成多肽主鏈。直接糖基化的優(yōu)點(diǎn)是可以快速獲得不同糖肽結(jié)構(gòu)。然而，在化學(xué)糖基化常用的條件下，側(cè)鏈羥基的反應(yīng)活性低且肽的溶解度低，直接O-糖基化常常受到產(chǎn)率低的困擾。用糖胺和含有天冬氨酸的肽直接縮合獲得N-糖基化肽的方法又有嚴(yán)重的副反應(yīng)[32]。

目前，最常用的糖肽類合成方法是采用預(yù)先形成的糖基化氨基酸模塊進(jìn)行逐步多肽固相合成（Solid Phase Peptide Synthesis，SPPS）。然而，糖基給固相糖肽合成帶來了復(fù)雜性和不確定性，許多在SPPS中常用的反應(yīng)方法和條件并不適用于糖肽的制備[33,34]。因此，在選擇保護(hù)基團(tuán)時(shí)必須特別小心。如O-糖苷鍵是酸不穩(wěn)定的，但在強(qiáng)堿條件下又會發(fā)生β-消除，強(qiáng)堿也會使肽外消旋。目前，使用乙酰酯作為寡糖羥基的保護(hù)，9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）作為氨基酸α-氨基的保護(hù)，N,N'-二異丙基碳二亞胺（DIC）/ 1-羥基苯并三唑（HOBt）、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽（PyBOP）/HOBt、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）/HOBt、O-（7-氮雜苯并三唑-1-基）-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）/N-羥基-7-氮雜苯并三氮（HOAt）下等作為偶聯(lián)劑已成為固相糖肽合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[35-38]。在Fmoc合成方法中，在溫和的堿性條件（如哌啶和嗎啉）下可以脫去α-氨基的保護(hù)基，而不影響糖肽中的O-糖苷鍵[39,40]。然而，在叔丁氧羰基（Boc）/芐基（benzyl）方案中，α-氨基保護(hù)基的脫去是在強(qiáng)酸三氟乙酸（TFA）條件下完成的，這種強(qiáng)酸性條件容易導(dǎo)致糖苷鍵的不穩(wěn)定。O-乙酰基和O-苯甲?；俏娮踊鶊F(tuán)，在TFA裂解多肽的過程中可以穩(wěn)定糖苷鍵。甲醇鈉的甲醇或水合肼溶液可以去除乙?；鵞41]。鄰苯甲酸鹽法所需要的苛刻條件使得它們不太適合用于糖肽的合成[42]。

1.3 高分子糖肽的合成

常規(guī)的SPPS合成僅限于50個(gè)氨基酸以內(nèi)，因此天然化學(xué)連接（Native Chemical Ligation，NCL）是合成更長肽鏈的有效方法[43]。NCL是一種化學(xué)選擇性反應(yīng)，在生理pH下，1個(gè)N端半胱氨酸殘基和1個(gè)C端硫酯可以選擇性反應(yīng)（圖2）。該方法是Kent課題組[44]在20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的，此后不斷改進(jìn)以提高其實(shí)用性。在NCL的第一步，C端硫酯與N端半胱氨酸殘基的巰基之間發(fā)生可逆反式硫代酯化反應(yīng)。結(jié)合后的單肽硫酯會自發(fā)地發(fā)生快速且不可逆的分子內(nèi)S→N移動(dòng)，從而在連接處產(chǎn)生熱力學(xué)穩(wěn)定的天然酰胺鍵。NCL特定地發(fā)生在N端半胱氨酸殘基上，而與其他的內(nèi)部半胱氨酸殘基無關(guān)。由于這種連接方法與糖和多肽兼容，因此可以連接糖蛋白結(jié)構(gòu)。由于硫酯固有的堿敏感性，多肽硫酯的制備最初依賴于Boc策略[45,46]。Fmoc策略在肽合成中的廣泛應(yīng)用以及糖肽的酸敏感性促進(jìn)了多肽硫酯制備新方法的發(fā)展[47]。

圖2 NCL機(jī)理的示意圖Fig. 2 Mechanism diagram of NCL

2 糖肽高分子材料

2.1 糖肽樹形分子

單個(gè)糖和蛋白質(zhì)之間的相互作用通常很弱，多個(gè)糖配體與受體結(jié)合能夠增強(qiáng)這種相互作用，這種現(xiàn)象稱為“簇效應(yīng)”或“多價(jià)效應(yīng)”。包括肽類樹形分子在內(nèi)的支狀多肽通過偶聯(lián)糖形成的支狀糖肽可以利用多價(jià)態(tài)簇效應(yīng)增強(qiáng)糖與蛋白的相互作用。樹形分子是一種高分支聚合物，具有明確且多分散性的核-殼納米結(jié)構(gòu)，分支單元圍繞核心單元逐代合成，廣泛應(yīng)用于多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[48-52]。由于樹形分子的高度分支、多價(jià)性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，糖肽類樹形分子是用作針對傳染病和癌癥的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑疫苗以及基于樹形分子的抗感染和抗炎藥的理想材料。

糖肽樹形分子可以根據(jù)具體要求進(jìn)行多種設(shè)計(jì)，其結(jié)構(gòu)分類示于圖3。糖肽樹形分子的核心部分可以是氨基酸序列，也可以連接常見的疏水烷基鏈，形成兩親性樹形分子。此外，核心支架也可以使用其他樹形分子，如經(jīng)典的聚酰胺-胺型（Polyamindoamine，PAMAM）樹形分子。重復(fù)的分支單元通常是一些優(yōu)化的氨基酸序列，一般用賴氨酸進(jìn)行分支，隨著分支的增加，代數(shù)不斷增加。末端基團(tuán)的數(shù)目隨著代數(shù)的增加而指數(shù)增加，并且樹形分子的總密度也增加，但是樹形分子的柔性和所有官能團(tuán)的可及性降低。豐富的末端基團(tuán)可以修飾大量的糖基團(tuán)，這些糖基團(tuán)可以是相同的糖，也可以是不同的糖。在一定程度上，代數(shù)的增加使糖基團(tuán)的數(shù)目增加，增強(qiáng)了糖簇與蛋白的相互作用，但是由于官能團(tuán)可及性隨代數(shù)的增加而降低，樹形分子的代數(shù)不能無限增加。根據(jù)糖肽樹形分子具體的結(jié)構(gòu)，又可以分為兩親性、啞鈴形和球形等。

圖3 糖肽樹形分子的結(jié)構(gòu)分類Fig. 3 Structural classification of glycopeptide dendrimers

Reymond課題組[53-55]設(shè)計(jì)了具有4個(gè)末端的G2糖肽樹形分子，末端連接半乳糖或巖藻糖，分別用于靶向銅綠假單胞菌的LecA和LecB凝集素。具有4個(gè)末端的糖肽樹形分子FD2、D-FD2、GalAG2和GalBG2能有效阻斷銅綠假單胞菌生物膜的形成并誘導(dǎo)生物膜在體外的分散，2個(gè)末端的糖肽樹形分子或單個(gè)末端的糖肽分子對凝集素的結(jié)合力要弱得多，而8個(gè)末端的糖肽樹形分子與凝集素的結(jié)合力增加，但再增加至16個(gè)末端時(shí)，平均到每個(gè)半乳糖基的結(jié)合效力反而降低?？赡苁怯捎谀豅ecA或LecB為四聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)LecA或LecB有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，大致排列在1個(gè)矩形的4個(gè)頂點(diǎn)，當(dāng)設(shè)計(jì)的糖肽樹形分子糖基之間的間距與四聚體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)的距離一致或能夠橋接不同的四聚體時(shí)，理論上可以最大限度地發(fā)揮多價(jià)作用對識別和結(jié)合過程的影響，并確保與宿主聚糖結(jié)合的最佳競爭，提高化合物的治療效率。當(dāng)進(jìn)一步增加糖肽樹形分子端基數(shù)目時(shí)，可能出現(xiàn)由于空間位阻等因素?zé)o法與凝集素結(jié)合位點(diǎn)相互作用的糖基，使糖肽樹形分子與凝集素的結(jié)合力不隨代數(shù)線性增加。當(dāng)將分支處的賴氨酸用更緊湊的2，3-二氨基丙酸替代時(shí)，結(jié)合力明顯減弱，可能是由于2，3-二氨基丙酸的2個(gè)氨基之間比賴氨酸少了3個(gè)碳原子的距離。一般認(rèn)為，較長的碳鏈會使分子柔性增加且更加靈活；較短的碳鏈會使分子柔性降低。當(dāng)將末端換成同時(shí)含有半乳糖和巖藻糖的雜糖簇時(shí)，結(jié)合力比同樣的單糖簇稍弱。Bouvier課題組[56]進(jìn)一步應(yīng)用MARTINI粗粒度模型和長時(shí)間的分子動(dòng)力學(xué)模擬系統(tǒng)探索氨基酸序列對半乳糖官能化八價(jià)肽樹形大分子動(dòng)力學(xué)以及它們與半乳糖特異性凝集素的結(jié)合能力的影響，圖4為多價(jià)糖肽樹形分子的二維示意圖。

圖4 多價(jià)糖肽樹形分子的二維示意圖[56]Fig. 4 Two-dimensional sketch of the multivalent glycoconjugated peptide dendrimers[56]

除了使用肽作為糖基樹形分子的骨架，也可以使用其他樹形分子作為支架，形成扇形、啞鈴形、球形以及其他形態(tài)的糖肽樹形分子，如PAMAM樹形分子、具有環(huán)狀核心區(qū)域選擇性可尋址功能化模板（Regioselectively Addressable Functionalized Templates，RAFTs）以及類似環(huán)狀結(jié)構(gòu)的樹形分子[57-59]。

2.2 自組裝糖肽材料

由于多價(jià)親合力效應(yīng)，固定在多價(jià)骨架中的糖基通常表現(xiàn)出比可溶性單價(jià)糖基高得多的蛋白質(zhì)結(jié)合親和力。當(dāng)多價(jià)糖基化合物在單個(gè)蛋白質(zhì)上占據(jù)多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，會出現(xiàn)螯合效應(yīng)。受簇狀糖苷效應(yīng)的啟發(fā)，已開發(fā)出不同的支架來設(shè)計(jì)具有多價(jià)糖基配體的結(jié)構(gòu)，然而，由于較為復(fù)雜的多價(jià)結(jié)構(gòu)和合成程序，仍需要設(shè)計(jì)一種簡便的方法來制備多價(jià)糖基簇。近年來，隨著超分子化學(xué)和自組裝多肽的發(fā)展，自組裝糖肽為多價(jià)糖基配體設(shè)計(jì)提供了一種簡便且可替代的方法。自組裝糖肽不僅具有容易合成、分子結(jié)構(gòu)明確以及固有的生物相容性和生物降解性等諸多優(yōu)勢，還可以模擬自然界中的自組裝過程，以形成具有納米級精度的復(fù)雜結(jié)構(gòu)或功能材料。在多肽分子的氨基酸上修飾糖基基團(tuán)，能夠構(gòu)建具有不同性能的糖肽類超分子自組裝材料（圖5）。

圖5 自組裝糖肽材料的設(shè)計(jì)Fig. 5 Design of self-assembled glycopeptide materials

對于自組裝糖肽，一種簡單有效的方法是在自組裝多肽序列的末端共價(jià)修飾糖基團(tuán)，該修飾一般不會影響多肽原有的自組裝功能，修飾方法主要為點(diǎn)擊反應(yīng)。本課題組[8]設(shè)計(jì)了甘露糖通過點(diǎn)擊反應(yīng)共價(jià)修飾五肽序列酪氨酸（Tyr）-纈氨酸（Val）-組氨酸（His）-天冬氨酸（Asp）-半胱氨酸（Cys）的糖肽，甘露糖基共價(jià)修飾在五肽的N末端。Stupp課題組[26]設(shè)計(jì)了單糖基通過點(diǎn)擊反應(yīng)與肽兩親體末端進(jìn)行共價(jià)修飾的糖肽材料，可以自組裝形成超分子硫酸化糖肽納米結(jié)構(gòu)，糖基與相應(yīng)蛋白的結(jié)合不會破壞納米結(jié)構(gòu)或其內(nèi)部βsheet骨架。這種在末端或側(cè)鏈修飾糖基的方法一般不會影響多肽原有的自組裝功能。Hudalla課題組[60,61]通過在Q11（QQKFQFQFEQQ）的N端修飾N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetyl-D-Glucosamine，GlcNAc）得到糖肽GQ11，通過將Q11和GQ11以不同物質(zhì)的量之比自組裝形成β-sheet納米纖維，成功改變了自組裝體表面的糖基密度。糖基在自組裝體表面暴露，不僅使糖基密度的調(diào)節(jié)變得簡單，而且很容易受到外部環(huán)境中各種因素的調(diào)節(jié)而改變糖基結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)控糖肽自組裝體結(jié)構(gòu)的目的。陳國頌課題組[62]設(shè)計(jì)的糖肽分子在水中自組裝形成納米纖維后，糖基暴露在表面，在糖基轉(zhuǎn)移酶KfoC或PmHS2的作用下，可以原位高效地形成糖苷鍵，生成新的糖肽類兩親分子GalNAcGlcA-YF和GlcNAcGlcA-YF，組裝形態(tài)從納米纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米顆粒（圖6）。

圖6 糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)含蛋白多糖殘基的糖肽自組裝形態(tài)轉(zhuǎn)變[62]Fig. 6 Glycosyltransferase-induced morphology transition of glycopeptide self-assemblies with proteoglycan residues[62]

此外，在多肽序列中引入含有側(cè)鏈官能團(tuán)的氨基酸作為糖基修飾位點(diǎn)，將糖基通過側(cè)鏈與多肽共價(jià)連接。李新明課題組[63,64]設(shè)計(jì)了在萘基-苯丙氨酸（Phe）-Phe-Asp-Tyr序列和萘基-Phe-Phe-Ser-Tyr序列側(cè)鏈修飾單糖基的自組裝糖肽分子（圖7）。董甦偉課題組[65]設(shè)計(jì)合成了通過絲氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)甘露糖的自組裝糖肽分子，可以自組裝形成納米顆粒模擬復(fù)雜多糖的功能。在多肽側(cè)鏈上可以修飾單個(gè)糖基，也可以引入多個(gè)含側(cè)鏈的氨基酸，從而在一條肽鏈上同時(shí)修飾多個(gè)糖基。李艷梅課題組[66]設(shè)計(jì)的腫瘤相關(guān)抗原黏蛋白1（Tumorassociated Antigen Mucin 1，MUC1）糖肽分子通過引入2個(gè)含有側(cè)鏈的氨基酸在一條多肽上，同時(shí)連有2個(gè)Tn抗原，與其他T輔助細(xì)胞表位肽和γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamic acid，γ-PGA）在水中發(fā)生多層自組裝，形成納米偶聯(lián)物抗腫瘤疫苗。在多肽上不僅可以修飾單糖，還可以修飾較長的寡糖鏈。如Huang課題組[67]在硫酸軟骨素糖肽Syndecan-1的絲氨酸側(cè)鏈共價(jià)連有1個(gè)八糖鏈。

圖7 （a）糖肽類凝膠的分子結(jié)構(gòu)；（b）超分子水凝膠的自組裝過程[64]Fig. 7 （a） Molecular structures of glycopeptide gelators; （b） Illustration of the self-assembling process of glycopeptides for the generation of supramolecular hydrogel[64]

除了以自組裝肽為主體在其上修飾寡糖外，還可以將聚糖長鏈作為主體，在長鏈上修飾較短的自組裝肽。但是其組裝驅(qū)動(dòng)力仍主要來源于自組裝短肽。王偉偉課題組[68]設(shè)計(jì)了以葡甘露聚糖長鏈為母體，在其上修飾多條Q11自組裝肽序列的糖肽分子。多條Q11肽作為組裝驅(qū)動(dòng)力，形成高度有序的β-折疊納米纖維。

自組裝多肽與糖偶聯(lián)形成的自組裝糖肽在基本保留多肽自組裝行為的基礎(chǔ)上，又具有易合成的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這樣形成的糖肽自組裝體在易于合成的同時(shí)具有自組裝形成的多價(jià)效應(yīng)。糖肽形成的超分子組裝系統(tǒng)在構(gòu)建具有新型分子結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)可調(diào)自組裝行為和應(yīng)用的材料方面具有巨大潛力。

2.3 糖肽聚合物材料

糖基化除了賦予肽基超分子生物材料功能外，還可以影響其結(jié)構(gòu)。為了更好地理解糖基化對自組裝肽的影響以及天然糖肽綴合物的自組裝機(jī)制，更好地開發(fā)基于糖肽共聚物在藥物傳遞功能生物材料、生物成像、組織工程等方面的應(yīng)用，更多新型的聚合物糖肽被開發(fā)出來。圖8示出了2種糖肽聚合物。

圖8 糖肽聚合物示例Fig. 8 Examples of glycopeptide polymer

糖基化通過建立分子間作用力來改變蛋白質(zhì)的形態(tài)和功能，這種作用力可以介導(dǎo)特異性的相互作用，同時(shí)防止非特異性的聚集。Hudalla等[69]研究表明致密的糖表層可以促進(jìn)肽納米纖維分層組裝成各向異性網(wǎng)絡(luò)。低濃度的糖肽納米纖維在水中仍然分散，而非糖基化的納米纖維傾向于聚集。在擁擠的條件下，一些糖基化的納米纖維橫向結(jié)合并排列。這種行為取決于糖基的化學(xué)性質(zhì)，尤其是羥基，表明存在短程引力。

隨著聚合物表面糖基密度的增加，糖基與糖基之間的相互作用顯露出來，對分子之間的相互作用以及聚合物的自組裝行為產(chǎn)生影響。江明課題組[70]設(shè)計(jì)的交替兩親糖多肽刷（Alternating Amphiphilic Glycopolypeptide Brushes，AAGB）帶有高密度的糖基側(cè)鏈（圖9）。分子初始形成納米顆粒，但分子之間高密度的糖基側(cè)鏈具有的糖基-糖基相互作用會使初始形成的納米顆粒逐漸吸引、融合、生長，最后形成納米線，實(shí)現(xiàn)分級自組裝。

此外，糖基部分也可以作為親水部分參與共聚物的組裝。Gupta課題組[71,72]設(shè)計(jì)的基于糖肽的兩親性共聚物，以連有糖基的聚甘氨酸鏈作為親水段，聚（ε-己內(nèi)酯）鏈或聚環(huán)氧丙烷（Polypropylene Oxide，PPO）作為疏水段，形成納米纖維、囊泡、膠束等不同組裝體（圖10）。許多使用糖多肽片段作為調(diào)節(jié)共聚物結(jié)構(gòu)以及親水性工具的共聚物或聚合物也被開發(fā)出來[73-76]。

圖10 nGP-（PCLm）2共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)親水和疏水嵌段長度獲得的納米結(jié)構(gòu)[71]Fig. 10 General chemical structures of nGP-（PCLm）2 copolymers and nanostructures obtained by tuning the hydrophilic and hydrophobic block length[71]

3 糖肽高分子材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

3.1 抗菌

一些細(xì)菌（如金黃色葡萄球菌）能夠侵入哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞，并在其中生存，從而阻止抗菌劑對它們的清除。巨噬細(xì)胞表面含有甘露糖受體，在抵抗病原體感染中起著重要作用，因此設(shè)計(jì)一些連有甘露糖的糖肽用于靶向巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌感染。糖肽進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，可以在細(xì)胞內(nèi)特有的生理?xiàng)l件調(diào)控下實(shí)現(xiàn)自組裝，在被感染巨噬細(xì)胞內(nèi)長期滯留，從而達(dá)到長效殺菌的目的。糖肽自組裝后，分子性能也可以得到放大。本課題組[77]設(shè)計(jì)了連有甘露糖糖肽的光聲造影劑，命名為MPC，MPC同時(shí)含有caspase-1酶切位點(diǎn)，主動(dòng)靶向巨噬細(xì)胞后，酶切形成J型聚集體并積聚在巨噬細(xì)胞內(nèi)使光聲信號增強(qiáng)，檢測到巨噬細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染[8]。我們也開發(fā)出具有“三明治”二聚體結(jié)構(gòu)的甘露糖糖肽-葉綠素光動(dòng)力治療（Photodynamic Therapy，PDT）藥物，可以增強(qiáng)PDT的效應(yīng)和活性靶向性，消除巨噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)感染（圖11）。

圖11 MPepP18（Cu2+）與萬古霉素在金黃色葡萄球菌感染小鼠模型中的體內(nèi)抗菌活性比較[77]Fig. 11 In vivo antibacterial activity of MPepP18（Cu2+） compared to vancomycin in a S. aureus infected mice model[77]

細(xì)菌感染可以用抗生素進(jìn)行治療，然而耐藥性的產(chǎn)生促使科研工作者嘗試更多抗菌方法，其中針對細(xì)菌凝集素的治療方法被認(rèn)為在降低細(xì)菌感染致病能力的同時(shí)不會直接影響細(xì)菌的生存能力，從而降低耐藥性出現(xiàn)的可能，因此受到了廣泛關(guān)注。凝集素是一種蛋白質(zhì)，可以與糖基特異性識別并結(jié)合，在細(xì)菌感染宿主的過程中發(fā)揮重要作用。然而這種凝集素-糖相互作用具有多價(jià)性，因此自組裝糖肽被廣泛用于靶向凝集素的抗菌治療。糖肽的糖基部分選用靶向特定細(xì)菌凝集素的糖，多肽部分提供自組裝驅(qū)動(dòng)力。阿爾茲海默癥患者腦內(nèi)淀粉樣纖維的形成是蛋白質(zhì)自組裝的結(jié)果。糖肽分子中的多肽部分可以模擬自組裝過程形成納米尺度的自組裝體。在有些糖肽設(shè)計(jì)中，糖基位于多肽末端，自組裝形成聚集體后，糖基暴露在聚集體表面。聚集體由多個(gè)糖肽組裝而成，因此聚集體表面有多個(gè)糖基基團(tuán)，可以提供多價(jià)相互作用，增強(qiáng)了與細(xì)菌凝集素的結(jié)合能力，極大抑制了細(xì)菌的感染致病能力。李新明課題組[78]設(shè)計(jì)并合成的甘露糖修飾的糖肽（萘基-Phe-Phe-Ser-Tyr，NMY），其多價(jià)甘露糖配體靶向甘露糖結(jié)合蛋白Fim H黏附素，多肽部分能夠在催化酶的幫助下驅(qū)動(dòng)超分子自組裝，以高特異性結(jié)合大腸桿菌，并導(dǎo)致細(xì)菌黏附、膜被破壞和隨后的細(xì)胞死亡。

除了多肽自組裝提供多價(jià)性外，糖肽樹形分子具有的大量末端基團(tuán)同樣可以提供多價(jià)性，增強(qiáng)糖基與凝集素的相互作用。Reymond課題組[55]設(shè)計(jì)了帶有大量半乳糖和/或巖藻糖末端的糖肽樹形分子，靶向銅綠假單胞菌的凝集素LecA和LecB，可以有效抑制銅綠假單胞菌的生物膜。隨著樹形分子末端基團(tuán)數(shù)量的增加，末端糖基的柔性和可及性逐漸減小，有效性不會明顯提升，反而增加了合成難度，因此大部分應(yīng)用的糖肽樹形分子末端數(shù)量一般在2～16個(gè)。在糖肽聚合物方面，Chan-Park課題組[79]設(shè)計(jì)了含有聚甘露糖和抗菌多肽的四臂星型聚合物，抗菌多肽臂對細(xì)菌具有殺傷作用，而聚甘露糖臂對大腸桿菌FimH凝集素表達(dá)出高親和力，增強(qiáng)了聚合物對細(xì)菌表面的親和力，并且在游離甘露糖苷存在的情況下，聚合物也能抵抗競爭。

3.2 腫瘤疫苗

正常細(xì)胞上的糖蛋白（特別是黏蛋白）帶有長糖鏈，而上皮腫瘤細(xì)胞上的黏蛋白由于關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶的變化導(dǎo)致黏蛋白糖鏈被嚴(yán)重截短，稱為腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原（tumor-associated carbohydrate antigens，TACA），包括T抗原、Tn抗原及其唾液酸化衍生物等[80]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種黏蛋白在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，被用于腫瘤疫苗的研究，其中腫瘤相關(guān)抗原黏蛋白1（MUC1）是一個(gè)非常有前景的研究靶點(diǎn)。MUC1是一種膜蛋白，許多免疫治療研究表明，在大約80%的上皮癌細(xì)胞表面MUC1過表達(dá)。由于糖蛋白中糖的生物微觀異質(zhì)性，從腫瘤細(xì)胞中分離出來的MUC1通常在1個(gè)蛋白鏈上攜帶腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞2種抗原，不僅免疫原性弱，還能誘導(dǎo)針對健康組織的免疫反應(yīng)。因此，通過化學(xué)方法人工合成MUC1類似物是一種有效生產(chǎn)腫瘤疫苗的方法。目前主要有3種設(shè)計(jì)MUC1抗腫瘤疫苗的策略，分別是將MUC1糖肽與T細(xì)胞表位偶聯(lián)、將MUC1糖肽與載體蛋白偶聯(lián)、設(shè)計(jì)含有佐劑的MUC1糖肽。最近，已經(jīng)制備了許多以MUC1腫瘤相關(guān)糖肽表位為靶標(biāo)的合成糖肽疫苗，使用多肽單一載體共價(jià)偶聯(lián)多種抗原，然后利用自組裝肽驅(qū)動(dòng)糖肽自組裝或利用樹形分子大量末端基團(tuán)形成糖苷簇效應(yīng)激活免疫。Dumy課題組[59]利用區(qū)域選擇的功能化模板（RAFTs）作為多價(jià)支架設(shè)計(jì)抗癌疫苗，這些偶聯(lián)物顯示成簇的Tn抗原類似物如腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原（Tumorassociated Carbohydrate Antigens，TACA），并對候選疫苗的B和T抗原和免疫原性進(jìn)行了體外和體內(nèi)研究。Kunz課題組[81]設(shè)計(jì)合成了MUC1串聯(lián)重復(fù)序列偶聯(lián)Tn和唾液酸Tn抗原以及破傷風(fēng)類毒素（TTox），在野生型和人MUC1轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng)烈地免疫應(yīng)答。李艷梅課題組[82]將恒定自然殺傷T細(xì)胞（invariant natural killer T cell，iNKT細(xì)胞）的強(qiáng)效激動(dòng)劑α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-Galactosylceramide，α-GalCer）與MUC1糖肽抗原綴合在一起，產(chǎn)生的組裝體作為新型的自佐劑癌癥疫苗，在沒有外部佐劑的疫苗結(jié)合物引起了高水平的腫瘤特異性IgG抗體。Bay課題組[83]設(shè)計(jì)合成了一種糖肽樹形分子，可在表達(dá)HLA-DR1的轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)Tn特異性抗體介導(dǎo)的人Tn陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷（圖12）。

圖12 （a）MAG-Tn3的結(jié)構(gòu)；MAG-Tn3在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠（b）DR1 * A2和（c）DR1中誘導(dǎo)抗Tn抗體；（d）收集這些小鼠的血清，通過ELISA（b和c）和FACS對Tn陽性Jurkat細(xì)胞的Tn識別進(jìn)行了分析；（e）用圖（c）中的血清對Jurkat細(xì)胞的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評估[83]Fig. 12 （a） Structure of MAG-Tn3; MAG-Tn3 induced anti-Tn antibodies in HLA-transgenic mice （b） DR1 * A2 and （c） DR1; （d） Sera from these mice were collected and they were analyzed for Tn recognition by ELISA （b and c） and by FACS on Tn-positive Jurkat cells; （e） Antibody-mediated cytotoxicity was assessed on Jurkat cells with sera from Figure （c）[83]

3.3 仿生支架

糖肽由來源于生物體的糖和肽組成，具有生物相容性和易降解性。當(dāng)選用特定的糖基和可以自組裝形成凝膠的多肽后，糖肽自組裝形成的組裝體還可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）糖基化微環(huán)境，因此作為優(yōu)秀的仿生材料逐漸引起人們的注意。李新明課題組[63]設(shè)計(jì)的基于糖肽的自組裝水凝膠表面部分葡萄糖通過糖-受體相互作用改善細(xì)胞附著和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長（圖13）。王偉偉課題組[68]設(shè)計(jì)的β-sheet Q11肽接枝的葡甘露聚糖自組裝水凝膠（GPgel）無需任何其他治療劑即可自我加速傷口愈合，也可以促進(jìn)修復(fù)的皮膚組織中生成血管。

圖13 （a）在Gp凝膠表面培養(yǎng)后的HUVECs活/死檢測熒光圖像；（b）熒光素（FITC）-鬼筆環(huán)肽對培養(yǎng)于Gp凝膠表面的HUVECs細(xì)胞骨架F-肌動(dòng)蛋白染色；（c）圖（b）所示方框區(qū)域的高倍圖像；（d）在Gp凝膠上培養(yǎng)5 d，用血細(xì)胞計(jì)測定HUVECs細(xì)胞密度[63]Fig. 13 （a） Fluorescence images of the live/dead assays of HUVECs cultured on the surface of Gp gel over the course; （b） Cytoskeletal F-actin staining of HUVECs cultured on the surface of Gp gel by fluorescein （FITC）-phalloidin; （c） A high-magnification image of the boxed area shown in image（b）; （d） Cell densities of HUVECs determined by cell counting with a hemocytometer over the course of 5 d culture on Gp gel[63]

3.4 組織及軟骨修復(fù)

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG，包括硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate，HS）、硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CSs）、透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，HA）等）是在哺乳動(dòng)物組織中普遍存在的異質(zhì)多糖，在生物體中有廣泛應(yīng)用。天然糖胺聚糖具有復(fù)雜性和異質(zhì)性，大大限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。自組裝糖肽單體合成較為簡單且結(jié)構(gòu)明確可控，自組裝后形成的納米纖維可以模擬天然糖胺聚糖形態(tài)，因此許多基于自組裝糖肽的均質(zhì)低聚糖骨架被開發(fā)出來。Stupp課題組設(shè)計(jì)的硫酸化納米結(jié)構(gòu)超分子糖肽自組裝形成納米結(jié)構(gòu)絲狀糖肽比天然硫酸化多糖肝素顯著增強(qiáng)了骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的信號傳導(dǎo)，并以極低劑量促進(jìn)了脊柱中骨骼的再生（圖14）。Guler課題組[84]設(shè)計(jì)的模仿天然透明質(zhì)酸分子的糖肽納米纖維與間充質(zhì)干細(xì)胞相互作用，并以類似于天然血凝素的方式誘導(dǎo)軟骨分化。

圖14 (a)微計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)的代表性體積渲染(黃色箭頭表示融合); (b)融合塊的數(shù)字矢狀切面，該融合物來自用 100 ng BMP-2和PA 1納米結(jié)構(gòu)處理過的動(dòng)物(體積渲染是從高分辨率同步加速器X射線μCT獲得的); (c)L4-L5后外側(cè)脊柱標(biāo) 本矢狀橫斷面的H&E染色Fig. 14 (a) Representative volume renderings from μCT (yellow arrows indicate fusion); (b)Digital sagittal section through the fusion mass from an animal treated with 100 ng BMP-2 and PA 1 nanostructures (the volume rendering was obtained from high-resolution synchrotron X-ray μCT); (c)Representative sagittal cross-sectional images of L4-L5 posterolateral spine specimens with H&E staining

4 總結(jié)與前景展望

近年來糖肽的合成得到了廣泛發(fā)展，其中將糖基提前連接到氨基酸上構(gòu)建糖基化氨基酸，再利用固相合成與其他氨基酸進(jìn)行模塊化拼裝成為一種受歡迎的合成方式。然而，糖基化氨基酸的合成耗時(shí)較長，因?yàn)樗ǔＰ枰嗖饺芤合喑绦?，而且大多?shù)構(gòu)建塊不是可商購的，即使少數(shù)構(gòu)建塊可以商購，但是價(jià)格通常極其昂貴，限制了這些結(jié)構(gòu)單元在固相糖肽合成中的應(yīng)用，此外，在糖基氨基酸插入和隨后的肽合成期間，肽偶聯(lián)反應(yīng)的效率大大降低，可能是由于帶有高聚糖的氨基酸的位阻所致。在糖肽材料的設(shè)計(jì)方面，仍然需要更精準(zhǔn)地、動(dòng)態(tài)地調(diào)控糖肽的結(jié)構(gòu)和組裝，以進(jìn)一步探索糖基與蛋白之間的相互作用及相互作用過程中的動(dòng)態(tài)變化。如何更高效地合成模塊化的糖基化氨基酸，提高其在固相合成中的偶聯(lián)效率，更簡便地合成結(jié)構(gòu)多樣化的糖肽材料，仍然有待進(jìn)一步探索。如何理解糖肽分子之間、糖肽與蛋白之間的相互作用及其給自組裝性能帶來的影響；理解體內(nèi)各種環(huán)境因素對糖肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響以及分子在此過程中的動(dòng)態(tài)變化，仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。此外，人為調(diào)控糖肽的結(jié)構(gòu)與功能，設(shè)計(jì)和合成更能模擬自然糖肽/糖蛋白的分子，有助于探索糖基在人體內(nèi)復(fù)雜的生理、生化作用，綜合評價(jià)糖肽/糖蛋白糖基化的作用也是一個(gè)非常有吸引力的方向。