對草地貪夜蛾高毒力的蘇云金芽胞桿菌菌株篩選與殺蟲活性研究

王 建，楊小雪，王丹丹，張 杰，束長龍，高繼國，耿麗麗*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.華僑大學(xué)化工學(xué)院，廈門 361021）

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda (J.E.Smith)，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾屬Spodoptera，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種重大遷飛性害蟲[1]。草地貪夜蛾具有繁殖強(qiáng)、遷飛快、寄主廣等特點(diǎn)[2]，其寄主植物包括禾本科、豆科、菊科等76科350種植物[3]。草地貪夜蛾幼蟲嗜食玉米葉片和果穗，一只雌成蟲最高可產(chǎn)2000粒卵，可直接為害一畝地的玉米[4]。2016年以來，草地貪夜蛾先后入侵非洲、印度、東南亞等國家和地區(qū)，并對玉米等主要糧食作物造成嚴(yán)重危害[5,6]。2019年1月草地貪夜蛾入侵我國并迅速蔓延，目前除新疆、青海和東北地區(qū)外均有報(bào)道，為害1300萬公頃的玉米[7]，已完成入侵和定殖過程，截至2020年8月，草地貪夜蛾在我國呈持續(xù)暴發(fā)狀態(tài)[8]。

為了應(yīng)對草地貪夜蛾對全球糧食安全的威脅，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年6月21日組織制定了《全國草地貪夜蛾防控方案》，要求堅(jiān)決遏制草地貪夜蛾暴發(fā)危害，保障糧食及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。化學(xué)農(nóng)藥是防治草地貪夜蛾的主要手段[9]，為了實(shí)現(xiàn)綠色防控，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳發(fā)布的《草地貪夜蛾應(yīng)急防治用藥推薦名單》中也將蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）等產(chǎn)品作為推薦用藥[10]，但當(dāng)時(shí)并無防治草地貪夜蛾的Bt產(chǎn)品登記。

蘇云金芽胞桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于蠟樣芽胞桿菌族芽胞桿菌科[11]。Bt形成芽胞的同時(shí)，在菌體內(nèi)一端或兩端產(chǎn)生晶體蛋白，基于這類殺蟲蛋白對鱗翅目、鞘翅目等多種害蟲具有較好的殺蟲活性且對環(huán)境友好的特點(diǎn)，使其被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲防治，減少了化學(xué)殺蟲劑用量[12-14]。美洲地區(qū)防控草地貪夜蛾在經(jīng)歷了早期的化學(xué)防治后，20世紀(jì)末進(jìn)入主要依靠Bt等微生物農(nóng)藥以及轉(zhuǎn)Bt作物的綠色防控時(shí)期[15,16]。美國EPA已登記有DiPel?DF[17]等Bt產(chǎn)品用于防治玉米草地貪夜蛾。研究發(fā)現(xiàn)對草地貪夜蛾有活性的Bt殺蟲基因主要有vip3Aa、cry1Ab、cry1Ea[18]、cry1F[19]、cry1I[20]等，其中Vip3Aa類蛋白盡管氨基酸序列之間相差很小，但對草地貪夜蛾的活性相差較大[21]，且Vip3Aa與Cry1Ab、Cry1Ia蛋白對草地貪夜蛾有協(xié)同增效作用[18,22]。轉(zhuǎn)Bt基因玉米防控草地貪夜蛾主要采取疊加/聚合多個(gè)殺蟲基因的策略[23]，如疊加多基因抗蟲玉米“MON89034”（表達(dá)Cry1A.105＋Cry2Ab2）和國內(nèi)研發(fā)的Bt-（Cry1Ab＋Vip3Aa）玉米對草地貪夜蛾具有良好的控制效果[24,25]；而表達(dá)Vip3Aa20殺蟲蛋白的Bt玉米是目前唯一沒有在田間產(chǎn)生對草地貪夜蛾抗性的產(chǎn)品[26]。

在對菌株資源庫中的活性菌株進(jìn)行篩選前，對于可能存在的冗余菌株，首先進(jìn)行多樣性分析：利用核酸片段分析系統(tǒng)得到菌株P(guān)CR-RFLP圖譜，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)化、相似性計(jì)算以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，以此分析比較菌株殺蟲基因之間的差異，從而去除冗余菌株，獲得可用于進(jìn)一步資源挖掘的菌株。Wang等[27]利用此方法從42株對大黑鰓金龜Holotrichia oblita幼蟲有活性的Bt菌株中去除了28個(gè)重復(fù)菌株，活性菌株分屬于14個(gè)不同的類型。

本研究從實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的對小地老虎高效的菌株資源中，通過室內(nèi)毒力測定，篩選對草地貪夜蛾幼蟲高毒力的Bt菌株，為開發(fā)對草地貪夜蛾高效的Bt殺蟲劑新產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期分離、篩選的對斜紋夜蛾、小地老虎具有高毒力的 Bt野生菌株363株；對照菌株KN11由武漢科諾生物科技有限公司提供，其可濕性粉劑商品名稱為“無敵小子”；Bt菌株HD73-為無晶體突變株。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：Trytone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入終濃度為1.3%的瓊脂粉；1/2 LB固體培養(yǎng)基：Trytone 0.5%，Yeast extract 0.25%，NaCl 0.5%，pH 7.0，1.3%瓊脂粉。上述培養(yǎng)基均由純水配置，121 ℃/20 min滅菌。

1.1.3 生化試劑 引物由北京六合華大基因科技有限公司合成；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker購自Takara公司；T4DNA Ligase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、酶切純化回收試劑盒購自美國Axygen公司；其它試劑均購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 供試蟲源及飼養(yǎng)條件 供試草地貪夜蛾由河北省滄州市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，人工飼料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲組提供，飼養(yǎng)溫度為（27±1）℃，RH（65±5）%，光周期16L:8D，選取初孵幼蟲作為供試?yán)ハx。

1.2 Bt菌株分離鑒定

將菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基過夜活化。取活化的Bt菌液接種于1/2 LB固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取適量菌體涂布于滴有超純水的載玻片上，烘干后用堿性石炭酸復(fù)紅染液染色約3 min，油鏡下觀察Bt芽胞及晶體形態(tài)[28]。

1.3 Bt菌株多樣性分析

菌株資源庫中可能存在重復(fù)菌株，因此，在進(jìn)行菌株殺蟲活性篩選前有必要對菌株進(jìn)行多樣性分析。

1.3.1 PCR-RFLP Bt菌株按照Song等[29]的方法進(jìn)行基因組DNA制備。將下表中的4對引物（表1）等體積混勻后作為PCR擴(kuò)增引物。

表1 菌株多樣性分析引物序列[30]Table 1 Primers sequences used for diversity analysis

PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：基因組 DNA 2.0 μL、2×Taq mix 15 μL、引物 1.0 μL、超純水補(bǔ)至 20 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，10次循環(huán)；94 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

酶切體系（40 μL）：PCR產(chǎn)物15 μL，10×H Buffer 4.0 μL，Hinf I限制性內(nèi)切酶1.0 μL，超純水補(bǔ)至40 μL，37 ℃恒溫孵育 2 h。

1.3.2 PCR-RFLP圖譜分析 PCR-RFLP圖譜分析、圖譜數(shù)字化、相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參照單月明[30]的方法進(jìn)行：利用Fragment AnalyzerTM全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對酶切產(chǎn)物的片段多態(tài)性進(jìn)行分析，將系統(tǒng)分析得到的圖譜信息采用PERL腳本轉(zhuǎn)換成用于可直觀顯示菌株間相似關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹文件，使用MEGA 5軟件構(gòu)建反映菌株進(jìn)化關(guān)系的UPGMA tree，利用系統(tǒng)發(fā)育樹定位具有相似PCR-RFLP圖譜的菌株從而去除重復(fù)菌株。

1.4 Bt胞晶混合物制備及SDS-PAGE分析

取400 μL活化的Bt菌液均勻地涂布于1/2 LB固體培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)至光學(xué)顯微鏡觀察有50%以上的晶體釋放時(shí)停止培養(yǎng)，將全部菌體刮到50 mL離心管中，加適量預(yù)冷的超純水充分洗滌兩次，每次8000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀加入4 mL預(yù)冷的50 mmol/L Na2CO3（pH 10.0）溶解，反復(fù)吹打混勻胞晶混合物。

取上述胞晶混合物，加入1/5體積預(yù)冷的0.5 mol/L NaOH溶液，室溫反應(yīng)5 min，隨后加入5×上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，12000 r/min離心3 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，電泳方法參照薩姆布魯克和拉塞爾[31]的方法進(jìn)行。電泳結(jié)束后取出凝膠，進(jìn)行脫色、染色及掃描圖譜。使用Image J 2x軟件進(jìn)行蛋白定量：首先，打開要分析的蛋白圖譜，用矩形選框工具逐一為泳道編號，完成之后，通過analyze/gels/plot lanes繪制條帶的峰圖。然后，在灰度曲線上將目的波峰與基線圍成封閉區(qū)域，隨后用魔棒工具（Wand tool）點(diǎn)擊每個(gè)峰的中間區(qū)域即可完成對每個(gè)峰面積的計(jì)算，計(jì)算的結(jié)果在Result窗口顯示，可通過File導(dǎo)出為xls文件，最后，通過對待測樣品和已知濃度的BSA灰度值比較計(jì)算蛋白濃度。

1.5 草地貪夜蛾幼蟲室內(nèi)生物活性測定

稱取15 g草地貪夜蛾人工飼料置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入3 mL待測樣品溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，于室溫放置；待飼料中多余的水分蒸發(fā)后，將全部飼料均勻的分裝于一個(gè) 24孔板中；隨后用毛筆挑取拉絲、個(gè)體活躍且大小一致的初孵幼蟲接于 24孔板內(nèi)，每孔一頭，接好幼蟲后用內(nèi)置吹塑紙板的頂蓋蓋好，再用橡皮筋固定扎緊，防止幼蟲逃逸；以添加Na2CO3溶液和蒸餾水的飼料為空白對照。將24孔板置于溫度（27±1）℃，RH（65±5）%，光周期16L:8D的養(yǎng)蟲室中。每處理3次重復(fù)。每天檢查光照、濕度、溫度以及飼料是否霉變，是否有水蒸氣的凝結(jié)。7 d后分別調(diào)查死、活蟲數(shù)，計(jì)算平均死亡率、校正死亡率，使用Polo-Plus軟件計(jì)算致死中濃度。

1.6 cry1Ea基因克隆及其表達(dá)產(chǎn)物的活性分析

1.6.1 cry1Ea重組表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)B14-D2菌株已有的基因組草圖聚類分析后，得到cry1Ea基因序列，利用https://web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站預(yù)測Cry1Ea蛋白等電點(diǎn)及分子量。根據(jù)B14-D2菌株cry1Ea基因序列和 Bt-E.coli 穿梭表達(dá)載體pSTK[32]酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（表2）：

表2 cry1Ea基因克隆所用引物序列Table 2 Primers sequences used for cry1Ea gene clone

cry1Ea 基因 PCR 反應(yīng)體系：基因組 DNA 1.0 μL、2×PrimeSTARTMHS（Premix）25 μL、引物各 1.0 μL、超純水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

回收擴(kuò)增得到的3.5 kb左右的DNA片段，將得到的cry1Ea基因及pSTK載體分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ與Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含有卡那霉素的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定、酶切分析和基因測序之后篩選正確的重組質(zhì)粒 pSTK-1E。大腸桿菌質(zhì)粒提取、DNA酶切、片段回收以及大腸桿菌連接轉(zhuǎn)化過程詳見Sambrook等[33]，重組質(zhì)粒使用引物pSTK-F/ pSTK-R進(jìn)行鑒定，基因測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.6.2 Cry1Ea蛋白表達(dá)與活性測定 將含有cry1Ea基因的重組質(zhì)粒pSTK-1E轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET中，并提取質(zhì)粒，然后通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Bt無晶體突變株HD73-中，最終獲得重組菌株HD73_1E，提取Cry1Ea蛋白進(jìn)行草地貪夜蛾幼蟲室內(nèi)毒力測定。Bt轉(zhuǎn)化過程詳見Lereclus等[34]的方法，Cry1Ea蛋白在Bt中的表達(dá)與提取參見Zhou等[35]的方法，草地貪夜蛾室內(nèi)生物活性測定方法見1.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株晶體形態(tài)觀察

光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果顯示有305株Bt菌株可觀察到晶體，但晶體種類有所不同，大部分菌株含有菱形晶體，小部分菌株含有方形晶體，圖1展示了部分Bt菌株的顯微鏡檢結(jié)果。

2.2 Bt菌株P(guān)CR-RFLP圖譜分析

以本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的通用Bt菌株鑒定引物擴(kuò)增供試菌株，圖譜呈現(xiàn)多樣性（圖2A）。PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinf I限制性內(nèi)切酶消化，結(jié)果同樣呈現(xiàn)多樣性，不同菌株P(guān)CR產(chǎn)物酶切后產(chǎn)生不同大小、不同濃度的條帶，部分菌株具有相似條帶（圖 2B），說明這些 Bt菌株中含有不同的殺蟲基因及組合，同時(shí)也存在重復(fù)菌株。

圖2 不同Bt菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果及RFLP鑒定分析結(jié)果（部分樣品）Fig.2 PCR amplificationand RFLP identification analysis of different Bt strains (partial samples)

對酶切產(chǎn)物的片段多態(tài)性進(jìn)行分析（圖 3A），與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳相比，全自動毛細(xì)管電泳儀分辨率更高，有效的分離35～1500 bp的片段，大部分樣品具有不同的酶切圖譜，顯示出菌株的多樣性，同時(shí)觀察到部分菌株具有相似的圖譜。利用系統(tǒng)發(fā)育樹定位具有相似PCR-RFLP圖譜的菌株（圖3B），去除重復(fù)菌株133株，占總數(shù)的43.61%，得到172株不同類型的Bt菌株作為代表菌株進(jìn)行后續(xù)生物活性測定。

2.3 室內(nèi)生物活性測定結(jié)果

2.3.1 初篩 172株候選Bt菌株飼毒7 d后，47株菌株校正死亡率＞80%，占總菌株數(shù)的27.33%；27株菌株校正死亡率＞90%，占總菌株數(shù)的15.70%。其中PS3-C3-2等6株菌株校正死亡率達(dá)100%（表3）。

2.3.2 復(fù)篩 對PS3-C3-2等6株高毒力菌株進(jìn)一步復(fù)篩，結(jié)果顯示菌株B14-D2殺蟲活性最高，LC50為0.155 μg/g，與對照菌株KN11毒力相當(dāng)，而菌株P(guān)S3-C3-2、C3-E11也表現(xiàn)出很高的毒力（表4）。

2.4 高毒力Bt菌株殺蟲蛋白分析

對草地貪夜蛾有活性的172株Bt菌株胞晶混合物SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，共有82株菌表達(dá)分子量約為130 kDa的蛋白，具有典型Bt殺蟲晶體蛋白的特征，少部分表達(dá)分子量約為60 kDa的蛋白。高毒力菌株B14-D2表達(dá)約130 kDa和80 kDa大小蛋白條帶（圖4）。質(zhì)譜鑒定表明，菌株B14-D2主要含有Cry1E-like、Vip3Aa蛋白（表5）。

圖4 對草地貪夜蛾高毒力Bt菌株殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of insecticidal crystal protein for Bt strains with high toxicity against S.frugiperda

2.5 cry1Ea基因表達(dá)及活性分析

測序結(jié)果表明，本研究發(fā)現(xiàn)的cry1Ea-like與cry1Ea3基因（GenBank號：AAA22345）堿基相似性為100%，其編碼的蛋白等電點(diǎn)為5.01，蛋白的分子量為133.3 kDa。隨后構(gòu)建了含有cry1Ea3基因的重組質(zhì)粒pSTK-1E，并導(dǎo)入無晶體突變株HD73-中。對重組菌株HD73_1E進(jìn)行顯微鏡觀察（圖5A），觀察到均為菱形晶體，這說明Cry1Ea3蛋白形成的蛋白晶體為菱形。重組菌株HD73_1E胞晶混合物SDS-PAGE分析結(jié)果顯示：Cry1Ea3在Bt_HD73-突變株中可以表達(dá)約133 kDa的蛋白（圖5B），符合預(yù)期大小，這說明Cry1Ea3蛋白在HD73-無晶體突變株中成功表達(dá)。同時(shí)測得Cry1Ea3蛋白對草地貪夜蛾初孵幼蟲LC50為 1.789 μg/g（95%置信區(qū)間：1.438～2.206 μg/g）。

圖5 HD73_1E菌株顯微形態(tài)觀察及胞晶混合物SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.5 HD73_1E strain morphology observation and SDS-PAGE analysis of cell crystal mixture

3 討論

自 2016年以來，由于草地貪夜蛾在全球大部分熱帶和亞熱帶地區(qū)的傳播及其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的嚴(yán)重危害，引起國際社會的廣泛關(guān)注。草地貪夜蛾入侵我國后，曾一度面臨無生物農(nóng)藥可用的窘境，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所的大力支持下，今年 10月武漢科諾生物科技股份有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所共同研發(fā)的Bt-KN11可濕性粉劑（登記證號為PD20084969）獲批擴(kuò)作登記，新增玉米草地貪夜蛾等作為防治對象[36]。此外，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所研發(fā)登記的基因工程菌G033A可濕性粉劑（商品名稱“禁衛(wèi)軍”）現(xiàn)已完成一年八地田間試驗(yàn)，提交了擴(kuò)作申請。同時(shí)，為實(shí)現(xiàn)草地貪夜蛾可持續(xù)、綠色防控，亟需挖掘更多具有不同基因型的Bt菌株資源，開發(fā)高效穩(wěn)定的Bt新產(chǎn)品。

本研究建立了基于菌株去冗余和大規(guī)模生測系統(tǒng)相結(jié)合的高效菌株篩選體系，從實(shí)驗(yàn)室保藏的363株野生菌株庫中，篩選獲得27株對草地貪夜蛾初孵幼蟲具有較好活性的菌株。傳統(tǒng)的活性菌株篩選一般采用對分離的大量 Bt菌株進(jìn)行生測的方法，如 Monnerat等[37]通過飼料表面涂藥法（Diet overlay method）從1400株Bt菌株中篩選得到對草地貪夜蛾具有高毒力的Bt菌株S1905（2齡幼蟲，LC50為18 ng/cm2）。本研究在對菌株進(jìn)行大規(guī)?；钚院Y選前，利用單月明[30]建立的基于核酸片段分析系統(tǒng)獲得的PCR-RFLP圖譜構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，分析了菌株多樣性，去除了冗余菌株，提高了篩選效率，這種高效技術(shù)的引入，有效剔除重復(fù)的菌株，從而極大地減少了前期生測工作量，提高了準(zhǔn)確率。劉華梅等[38]從對夜蛾科害蟲高毒力的6株Bt菌株中篩選出KN50、KN11、KNR8這三株高毒力Bt菌株，且在田間試驗(yàn)中取得很好的防治效果，分析發(fā)現(xiàn)其均含有cry1Ac、cry1Ia、cry2Ab、vip3Aa基因。本研究中高毒力菌株B14-D2室內(nèi)生測活性與KN11相當(dāng)，但含有的殺蟲基因不一樣，因而具有良好的應(yīng)用前景。菌株B14-D2中含有cry1Ea3基因，目前已發(fā)現(xiàn)Cry1Ea類蛋白對家蠶Bombyx mori、甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)、?；页嵋苟闟podoptera littoralis、煙草天蛾Manduca sexta (Linnaeus)等多種鱗翅目害蟲具有殺蟲活性[39,40]。Figueiredo等[18]采用飼料表面涂藥法測定的Cry1Ea1蛋白的LC50為3.07 ng/cm2，由于草地貪夜蛾幼蟲取食存在鉆蛀現(xiàn)象，本研究采用飼料混毒法（Diet incorporation method）[41]測得Cry1Ea3蛋白的 LC50為1.789 μg/g更為準(zhǔn)確。而該蛋白活性顯著低于其來源菌株B14-D2的活性（LC50為0.155 μg/g），基因組草圖的結(jié)果顯示該菌株除cry1Ea3基因，還含有cry2Ab、vip3Aa和vip4基因（數(shù)據(jù)未發(fā)表），菌株的高毒力可能來自某個(gè)蛋白的殺蟲活性或者是多個(gè)蛋白的協(xié)同增效作用，下一步我們將完成該菌株的全基因組測序，并明確其高毒力原因。李國平等[42]測定了入侵我國云南的瑞麗草地貪夜蛾種群對不同Bt蛋白的敏感性，結(jié)果顯示Bt蛋白對草地貪夜蛾致死順序?yàn)閂ip3A＞Cry1Ab＞Cry1F＞Cry2Ab＞Cry1Ac，表明該入侵種群對此5種Bt蛋白尚未產(chǎn)生抗性，而Vip蛋白與其他Cry類蛋白無交互抗性[43]。目前尚無 Cry1Ea蛋白與已經(jīng)商業(yè)化的Cry1、Cry2類蛋白交互抗性的報(bào)道，我們將在今后的研究中明確菌株B14-D2中Cry1Ea、Vip3Aa等蛋白與已商業(yè)化應(yīng)用的Bt蛋白有無交互抗性，為轉(zhuǎn)基因作物的開發(fā)提供基因儲備。此外，為了加速B14-D2菌株其及含有殺蟲基因的應(yīng)用，應(yīng)對環(huán)境和食用安全性進(jìn)行評價(jià)：明確其對家蠶等非靶標(biāo)經(jīng)濟(jì)昆蟲的影響，并分析殺蟲蛋白的穩(wěn)定性和過敏原位點(diǎn)等。

本研究在去除冗余菌株的基礎(chǔ)上，通過室內(nèi)毒力測定，篩選獲得對草地貪夜蛾幼蟲高毒力的Bt菌株，并初步分析了Cry1Ea3蛋白的殺蟲活性，為新的Bt產(chǎn)品的開發(fā)提供了豐富的菌株資源儲備。下一步工作將優(yōu)化發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)對高毒力菌株的生產(chǎn)，并進(jìn)入農(nóng)藥產(chǎn)品登記流程；明確 Cry1Ea蛋白殺蟲譜，測定對非靶標(biāo)有益生物的活性；分析Cry1Ea蛋白與目前商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物中應(yīng)用的Cry1Ab蛋白等的交互抗性，同時(shí)通過全基因組測序進(jìn)一步挖掘高毒力菌株中的新基因。