王 輝，劉 麗，黃宇飛，鄒春蕾，趙 穎，王 琦，劉長遠*

（1.遼寧省農業(yè)科學院植物保護研究所，沈陽 110161；2.沈陽農業(yè)大學植物保護學院，沈陽 100866；3.遼寧省農業(yè)科學院蔬菜研究所，沈陽 110161；4.遼寧省農業(yè)科學院植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，沈陽 100161；5.中國農業(yè)大學植物保護學院，北京 100193）

辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian主要是以有性的卵孢子在土壤中越冬，翌年溫濕度適宜時可快速生長繁殖，引起辣椒大面積死亡，破壞作物根際微生態(tài)環(huán)境，造成土壤連作障礙[1,2]。目前，生產上辣椒疫病的防治仍以化學農藥為主[3]，導致了病原菌抗藥性增強與遺傳分化[4,5]，使防治難度加大，危害環(huán)境與人類健康。因此，生產上急需安全有效的替代技術。生防微生物對環(huán)境、動植物友好，可以通過抑制、重寄生或競爭等作用改變土壤原有的微生物群落組成與結構，從而達到防治土傳病害、提高植物抗逆性、修復病土的目的[6-8]，成為植物病害綠色防控的重要手段。研究發(fā)現，叢枝菌根菌 AMF（Arbuscular mycorrhizal fungi）、木霉菌Trichoderma spp.、芽胞桿菌Bacillus spp.、假單胞菌Pseudomonas spp.與鏈霉菌Streptomyces spp.等對辣椒疫病均具有較好的防治效果[9,10]。曲霉屬微生物分泌產生的次生代謝產物對植物病原菌具有明顯抑制作用[11,12]，其中黃柄曲霉Aspergillus flavipes已被證實可產生對辣椒疫霉菌具有拮抗作用的活性成分，且具有穩(wěn)定的遺傳特性及環(huán)境適應性[13,14]，應用前景廣闊。

真菌作為植物根際土壤微生物的重要組成部分，構成了大部分微生物生物量，其物種的組成與豐度變化直接影響土壤養(yǎng)分的轉化[15]、土傳病害的發(fā)生[16]與植物的健康[17]。因此，了解土壤真菌的多樣性和群落結構特點，分析與土壤環(huán)境功能因子的相關性，對有效改良土壤微環(huán)境，維持生態(tài)系統(tǒng)物種的多樣性、保持生態(tài)平衡具有重要意義。黃柄曲霉 ASD來源于遼寧設施辣椒連作土壤，其次生代謝產物中含有辣椒疫病活性抑菌物質已經被證實[13]，本文擬探討 ASD菌株是否同時具有調節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境的功能，結果可為ASD菌株應用于農業(yè)生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤采集與采集地情況

試驗用土采集于鞍山市溫香鎮(zhèn)東高村，該地區(qū)連續(xù)種植辣椒達10 a以上，是遼寧省辣椒種植主產區(qū)，種植品種為牛角椒。東高村位于遼寧南部，北緯 41°04′93"，東經 122°60′07"，年平均氣溫 10.4 ℃，年降水量721.3 mm，日照時數為1551.25 h。2018年7月于東高村選取3棟未發(fā)病的溫室，利用5點取樣法[18]，每點取3株成株的根際土壤，用抖落法獲得根際土壤[19]。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗菌株與菌液的制備 黃柄曲霉Aspergillus flavipes ASD與辣椒疫病菌Phytophthora capsica BZ均由本研究室分離、鑒定并保存。菌株BZ為遼寧省優(yōu)勢3號生理小種、A1交配型，致病力中等。

ASD菌液的制備：將生長于PDA平板[20]的ASD菌株接種于裝有100 mL PDA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，25 ℃ 140 r/min培養(yǎng)7 d后，將發(fā)酵液5000 r/min離心1 min，沉淀大塊的菌絲球，將上清液配制成濃度為1×107孢子/mL的菌液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BZ孢子囊懸浮液的制備：將BZ菌株接種于PDA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)5 d，制成菌碟后接種于市場購買的辣椒果實上（接種前用75%乙醇消毒3次），25 ℃培養(yǎng)7 d，待果實長滿白色霉狀物，用無菌水洗下孢子囊，配制成濃度為1×105個/mL的孢子囊懸浮液，現配現用。

1.2.2 辣椒品種 選用遼寧主栽品種牛角椒37-74為試材，由遼寧省農業(yè)科學院蔬菜所辣椒課題組提供。

1.3 試驗設計與土壤樣本采集

試驗于遼寧省農科院試驗基地進行，將采集到的土壤充分混勻后分裝到直徑20 cm、深30 cm花盆中，每盆播種2粒種子，待長至8片真葉期時采用灌根法接種[7]。生防菌ASD處理：在距辣椒植株根莖約2 cm處注入ASD菌液10 mL，翌日在距辣椒根莖5 cm處注入辣椒疫病BZ孢子囊懸浮液10 mL，即為經ASD處理的罹病土壤；辣椒疫霉菌BZ處理：于辣椒根莖5 cm處注入BZ孢子囊懸浮液10 mL，即為罹病土壤；清水對照處理（CK）：于辣椒根莖5 cm處注入清水10 mL。正常管理，每處理3次重復，每次重復20株苗。

于接入疫病菌孢子囊懸浮液第20 d連根拔起全部辣椒苗，抖落法獲得辣椒根際土壤[19]，分別將各處理土壤充分混勻后過篩2 mm，以去除根系和雜質：5.0 g鮮土液氮速凍后?80 ℃保存用于土壤真菌菌群結構分析；150.0 g鮮土儲存于?20 ℃用于測定土壤酶活，并在7 d內完成；風干后土樣200.0 g用于測定土壤理化因子。

1.4 土壤營養(yǎng)測定

土壤有機質（SOM）測定采用重鉻酸鉀容量法[21]、銨態(tài)氮（NH4+-N）采用聯合浸提－紫外光度法[22]、硝態(tài)氮（NO3--N）采用氯化鉀溶液提?。贤夥止夤舛确╗23]、有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提－紫外光度法[24]、有效鉀（AK）采用乙酸銨浸提－原子吸收分光光度法[25]。

1.5 土壤酶活性測定

蛋白酶（PRO）采用 Folin比色法[26,27]，酚氧化酶（PHO）采用二羥基苯丙氨酸比色法測定[28]，酸性磷酸單酯酶（APA）采用對硝基苯磷酸鈉比色法測定[29]，β-葡萄糖苷酶（BG）采用對-硝基苯基β-D-葡萄糖苷比色法[30]，N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶（NAG）采用對硝基酚比色法[31]。

1.6 真菌多樣性分析

利用“Mobio土壤強力提取試劑盒”提取土壤樣品基因組DNA（美國），真菌多樣性分析基于Illumina HiSeq平臺，對ITS1區(qū)域進行雙末端測序，測序結果利用Usearch對相似度97%以上的Tags進行聚類，獲得分類單元 OTU；利用 Unite數據庫對 OTU進行分類學注釋、Heatmap進行聚類分析；利用 Mothur（Versionv.1.30）開展α多樣性分析、Bray-Curtis進行β多樣性分析；利用R Vegan對物種豐度數據進行計算后，選擇RDA（Redundancy Analysis）開展與環(huán)境因子的相關性分析。

1.7 發(fā)病率與優(yōu)勢物種相關分析

接入BZ孢子囊懸浮液第2 d開始觀察并記錄辣椒發(fā)病情況，于第7 d、第20 d統(tǒng)計辣椒發(fā)病株數，按照下列公式計算發(fā)病率，病株率（%）＝（病株數/調查總株數）×100。每處理3次重復。結合1.6試驗結果，利用SPSS 22.4 Bivariate開展優(yōu)勢物種與發(fā)病率相關性分析。

1.8 數據統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22.4軟件進行One-Way ANOVA 0.05水平的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ASD對土壤養(yǎng)分與酶活性的影響

生防菌ASD的施用明顯提高了罹病土壤NO3--N與AK含量，降低了NH4+-N含量；與清水對照相比，NO3--N與NH4+-N含量明顯下降，其余因子變化不顯著（F＝0.05，表1）；ASD施用后NAG酶活性明顯低于罹病土壤與清水對照土壤，PRO、APA、PHO與BG酶活性變化不顯著（F＝0.05，表2）。

表2 生防菌ASD對土壤酶活性的影響Table 2 Effects of biocontrol strain ASD on soil enzyme activities

2.2 真菌菌群多樣性與結構分析

2.2.1 α多樣性 稀釋性曲線表明（圖1），3個土壤樣品在抽取序列數量10000時出現拐點，此時的OTU數量為200～300，之后各條曲線趨勢逐漸平緩，增加測序數據只能產生少量新的OTU，數據量達到飽和，測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種（覆蓋率＞99.9%）。菌株ASD處理后與罹病土壤相比Shannon、Ace指數與Chao1指數明顯升高，Simpson變化不明顯。與對照土壤相比，Shannon與Simpson明顯升高，Ace指數與Chao1 指數變化不明顯（F＝0.05，表3），說明生防菌ASD處理后罹病土壤真菌多樣性與豐度均提高。

2.2.2 β多樣性分析 利用主坐標分析法進行PCoA（Principal coordinates analysis）分析，主坐標PC1、PC2對土壤真菌群落多樣性總解釋率達67%。在PC1（47.51%）影響下，生防菌ASD處理的3次生物學重復點位于橫坐標負軸，罹病土壤與清水對照處理的3次生物學重復點位于正軸。樣品點位置與點間距離表明，3個處理組內重復性均較好；罹病土壤與對照土壤真菌群落構成差異較小，兩者與ASD處理的土壤真菌群落構成差異較大（圖2）。

圖2 真菌PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of fungi

2.2.3 真菌菌群組成與結構 將Euclidean距離算法與Complete聚類方法合并，對Genus水平豐度＞1%的真菌物種進行聚類分析。圖3顯示3個處理優(yōu)勢物種豐度有明顯差異：罹病土壤中斜蓋傘屬Clitopilus與近地傘屬Parasola豐度較高，ASD菌液處理后相對豐度降低；嗜熱鏈球菌屬Mycothermus、嗜熱毀絲霉屬Myceliophthora、瑞默氏屬Remersonia、青霉菌屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、鐮孢菌屬Fusarium、枝孢屬Cladosporium、鏈格孢屬Alternaria、錐蓋傘屬Conocybe與被孢霉屬Mortierella在罹病土壤與對照土壤中豐度中等或低，ASD菌液處理后豐度升高；小脆柄菇屬Psathyrella只在清水對照土壤中豐度高，在罹病土壤與ASD處理土壤中相對豐度下降。結果說明，ASD處理后豐度升高的優(yōu)勢物種數量明顯高于罹病與對照土壤，聚類結果同樣顯示了罹病土壤與對照土壤真菌豐度接近，二者與生防菌ASD處理距離較遠。

圖3 屬水平真菌相對豐度聚類熱圖Fig.3 Clustering heat map of relative abundance of fungi on genus level

2.2.4 與環(huán)境因子RDA分析 選取含量顯著變化的NH4+-N、NO3--N、AK與NAG開展相關分析。DCA（Discriminant Component Analysis）計算結果中Lengths of gradient第一軸中的Axis lengths最大值為3.31，介于3.0～4.0，在Genus水平開展RDA線型相關分析。RDA1和RDA2占總解釋變量的42.82%，罹病土壤和對照土壤處理位于橫坐標正軸內，二者群落結構相似，與位于負軸的ASD處理差異較大；NO3--N和AK含量與ASD處理呈正相關，并正向影響錐蓋傘屬、毀絲霉屬、瑞默氏屬、嗜熱鏈球菌屬、被孢霉屬、青霉屬、鏈格孢屬及曲霉屬的相對豐度；NH4+-N含量、NAG活性與罹病土壤及對照土壤處理呈正相關，正向影響小脆柄菇屬與斜蓋傘屬相對豐度（圖4，5）。

2.3 優(yōu)勢物種與發(fā)病率相關分析

辣椒植株從接入BZ孢子囊懸浮液第7 d后開始陸續(xù)發(fā)病，第7 d發(fā)病率達98.33%，第20 d時發(fā)展病率達100%；施入生防菌ASD菌液后第7 d和第20 d發(fā)病率均為11.67%（表4）。Genus水平豐度＞1%的優(yōu)勢真菌與發(fā)病率的相關分析表明，斜蓋傘屬與辣椒疫病發(fā)病率呈顯著正相關（R＞0，P＜0.05），錐蓋傘屬和近地傘屬豐度與發(fā)病率呈正相關不顯著（R＞0，P＞0.05）；鏈格孢屬、曲霉屬與被孢霉屬等10個物種豐度與發(fā)病率呈不顯著負相關（R＜0，P＞0.05），結果與聚類熱圖優(yōu)勢物種變化基本一致（表5）。

表4 生防菌ASD對辣椒發(fā)病率的影響Table 4 Effects of biocontrol strain ASD on the incidence in pepper

3 討論

真菌作為真核生物，是土壤中植物殘體的主要分解者[32]，對改變土壤營養(yǎng)狀況與維持植物正常生長發(fā)揮重大作用[33]。本研究通過對土壤營養(yǎng)與酶活性測定發(fā)現，ASD可以明顯提高罹病土壤硝態(tài)氮、有效鉀含量，降低銨態(tài)氮含量與 N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶（NAG）活性。銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的變化趨勢不同，一方面可能是由于土壤中2種形態(tài)氮素的轉化速度不同[34]，快速的硝化作用消耗了土壤中的銨態(tài)氮導致[35]；另一方面可能與取樣時間有關，郭媛等[36]研究結果證明，不同施肥處理下土壤中的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮在1～28 d內是一個復雜的動態(tài)變化曲線：銨態(tài)氮在1～4 d內快速達到峰值，7～14 d又快速下降，28 d后趨勢于穩(wěn)定；硝態(tài)氮則反之，在1～28 d內硝態(tài)氮含量呈上升趨勢，之后含量穩(wěn)定。本研究的取樣時間點為接入ASD菌液第20 d，2種形態(tài)的氮素含量水平是否也存在動態(tài)變化曲線這需進一步研究證明。NAG作為降解幾丁質和肽聚糖的微生物胞外酶，其活性會受到土壤氮素有效性的抑制[37,38]。此外，本研究在20 d取樣時發(fā)現，土壤有機質、有效磷含量及蛋白酶、酸性磷酸單酯酶、β-葡萄糖苷酶活性影響不顯著，這是因為土壤有機質與土壤酶是一個復雜長期變化、互相影響的復雜綜合體，受多種因素協(xié)同作用，對土壤微生態(tài)環(huán)境具有緩沖作用，在短時間內可以保持相對穩(wěn)定性，因此導致多個環(huán)境因子在短時間內變化不顯著。

生防真菌作為外源功能微生物可以通過改變土壤原有微生物群落結構，從而抑制病害的發(fā)生也已經被許多研究證實：劉國坤等[39]利用生防真菌淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus處理柑橘慢衰病根際土壤，扈進冬等[40]利用木霉拌種劑LTR-2處理小麥土壤后，土壤真菌多樣性與豐度均有所升高，土壤真菌群落結構發(fā)生改變，降低病害的發(fā)生。均與本研究結果一致：黃柄曲霉 ASD處理后土壤真菌多樣性與豐度均有所提高。ASD的施入提高了嗜熱鏈球菌屬與嗜熱毀絲霉屬等物種豐度、降低了斜蓋傘屬與近地傘屬豐度，使土壤優(yōu)勢種群結構發(fā)生改變；豐度上升的優(yōu)勢物種與發(fā)病率負相關（錐蓋傘屬除外），豐度下降的物種與發(fā)病率正相關，這也證明了菌株 ASD可以通過改變土壤優(yōu)勢真菌結構與豐度，從而降低了辣椒疫病的發(fā)病率。此外，本研究豐度升高的物種中有8個屬為子囊菌門Ascomycota，該類真菌多為土壤腐生真菌，廣泛存在于土壤中，可以降解木質纖維素[41-43]，為土壤有機質的提供起到積極作用[44,45]。值得注意的是，同為擔子菌門傘菌目的斜蓋傘屬與錐蓋傘屬在 ASD施用后豐度變化方向不同，但均與發(fā)病率正相關，這是否與ASD代謝產物中存在抑制或促進其生長的物質有關，需進一步驗證。

由致病菌引起的土壤連作障礙是一個長期的化學演變過程，生防菌作為具有活性抑菌物質的天然產物對土壤的改善也需要長期施用才可以實現，而不是短期施用可以實現的。生防真菌 ASD具有改變土壤營養(yǎng)狀況、調節(jié)土壤微生物數量和種群結構、抑制病原菌生長的作用。研究結果可為黃柄曲霉 ASD作為新的生防資源應用于農業(yè)生產實踐提供理論依據。