李 莎，董洲君，韋 潔，陳星儀，王新智，王文豹(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

皮膚感染，是細(xì)菌和真菌感染性皮膚病.目前，在臨床應(yīng)用中，西醫(yī)治療皮膚病主要采用抗過敏法，在初期控制病情的效果較好，但具有不良反應(yīng)大、停藥后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[1].在我國藥典中，復(fù)方中將白鮮皮與苦參配伍作為治療藥物的就有20多處，其中大多數(shù)是治療皮膚病，且白鮮皮既可內(nèi)服，也可外用.內(nèi)服煎湯，外用煎水洗或研末敷[2]，使用方法多樣.現(xiàn)代研究結(jié)果表明，白鮮皮具有抗菌、抗炎及抗過敏等藥理作用[3-4]，可用于濕熱瘡毒和濕疹等癥[5-6].

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，在研究其治療疾病的分子機(jī)制存在一定困難.如今，一些市售藥膏如：狼毒抑菌乳膏，克癢舒洗液等具有抗菌作用的藥物中也都含有白鮮皮，但白鮮皮中具體是哪一種成分或哪些多成分協(xié)同發(fā)揮了抗菌作用，尚且不詳.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，是發(fā)現(xiàn)中藥生物活性成分和作用機(jī)理的一個有效工具，它從整體角度闡釋了中藥的藥理機(jī)制[7-8].本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析白鮮皮抑菌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，希望為之后的深入研究及應(yīng)用提供幫助.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 對中藥白鮮皮化學(xué)成分的收集

白鮮皮化學(xué)成分的收集來源于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)[9]、中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫.

1.2 通過PubChem檢索化學(xué)成分的Canonical SMILES

利用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)得到各化學(xué)成分的SMILES[10].

1.3 利用Molinspiration Property Calculator查看白鮮皮化學(xué)成分的分子性質(zhì)

由有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫得到的SMILE，輸入至Molinspiration Property Calculator網(wǎng)站中(https://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties)，預(yù)測各化學(xué)成分的相對分子質(zhì)量(Mr)、氫鍵供體數(shù)(HBA)、氫鍵受體數(shù)(HBD)、油水分配系數(shù)值(logP)和可旋轉(zhuǎn)鍵個數(shù)(NROTB)等性質(zhì).

1.4 對比類藥五規(guī)則篩選出有效化學(xué)成分

Lipinski類藥五規(guī)則是由Christopher A·Lipinski提出的篩選類藥分子的五條基本規(guī)則，符合類藥五規(guī)則的化合物會有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過程中會有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物.類藥五原則：1)Mr小于500；2)HBD小于5；3)HBA小于10；4)logP小于5；5)NROTB不超過10個.

1.5 通過SwissTargetPrediction預(yù)測白鮮皮有效成分的潛在靶點(diǎn)

Swisstargetpredict(http://old.swisstargetprediction.ch/)是用于生物活性小分子目標(biāo)預(yù)測的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器.本研究采用SwissTargetPrediction在線分析工具，預(yù)測白鮮皮中活性成分的作用靶點(diǎn).將各成分的SMILES文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction在線靶點(diǎn)篩選平臺，預(yù)測各成分作用靶點(diǎn).在篩選過程中，限定篩選潛在靶點(diǎn)的對應(yīng)物種為“人”，獲得潛在靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表，取前五個相關(guān)性強(qiáng)的靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究.

1.6 通過Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫篩選白鮮皮有效成分對應(yīng)的有效靶點(diǎn)

UniProt(Universal Protein，https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NYW0)是信息最豐富、資源最廣的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，由Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD三大數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)組成.其數(shù)據(jù)主要來自于基因組測序完成之后獲得的蛋白質(zhì)序列，還包含了大量來自于文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白質(zhì)的生物功能的信息.

1.7 白鮮皮活性成分與作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，對選取的特定信號與多靶點(diǎn)進(jìn)行分析，預(yù)測它們之間的潛在聯(lián)系，并形成網(wǎng)狀視圖.我們基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)使用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建白鮮皮活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白鮮皮化學(xué)成分的收集

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)、中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫，共收集到110個化學(xué)成分.

2.2 對比類藥五規(guī)則篩選出有效化學(xué)成分

根據(jù)類藥五規(guī)則，對白鮮皮中的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，最終有58個分子符合類藥五規(guī)則，見表1.

表1 經(jīng)類藥五規(guī)則篩選后的白鮮皮有效化學(xué)成分

續(xù)表1

2.3 通過SwissTargetPrediction預(yù)測白鮮皮有效成分的潛在靶點(diǎn)

采用SwissTargetPrediction在線分析工具，預(yù)測白鮮皮中58個活性成分的作用靶點(diǎn)，取前五個相關(guān)性強(qiáng)的靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究.

2.4 通過Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫篩選白鮮皮有效成分對應(yīng)的有效靶點(diǎn)

將上一步得到的靶點(diǎn)依次輸入，得到其生物功能，并根據(jù)顯示的信息和查閱文獻(xiàn)來篩選與抗菌活性有關(guān)的靶點(diǎn)，由此篩選得到白鮮皮有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，見表2.

表2 白鮮皮活性成分抑菌的直接作用靶點(diǎn)

2.5 白鮮皮活性成分與作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

白鮮皮的活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖1，菱形表示化學(xué)成分，圓形表示靶點(diǎn)，每條邊代表成分和靶點(diǎn)的相互作用，節(jié)點(diǎn)大小與度值成正比例關(guān)系，共包括27個成分，20個靶點(diǎn)，41條邊，47個節(jié)點(diǎn)，平均degree為4.3，其中degree排名前4的成分是Calodendrolide，葉含狹葉香茶菜素(Angustifolin)，檸檬苦素(Limonin)，吳茱萸苦素(Rutaevin).蛋白靶點(diǎn)的相關(guān)信息及度值，見表3.由Cytoscape3.7.0的network analyzer分析得可，度值大于平均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)有9個，分別為：①磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞單位δ異構(gòu)體(PIK3CA)；②組織蛋白酶L1輕鏈(CTSL1)；③酪氨酸蛋白磷酸酶非受體2型(PTPN2)；④m期誘導(dǎo)劑磷酸酶1(CDC25A)；⑤麝香貓樣蛋白1(MBNL1)；⑥前列腺素G/H合酶2(PTGS2)；⑦巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)；⑧花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)；⑨m期誘導(dǎo)劑磷酸酶2(CDC25B)，推測白鮮皮的有效成分是通過上述靶點(diǎn)來發(fā)揮抑菌作用的.

圖1 白鮮皮活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 相關(guān)靶點(diǎn)的信息及度值

續(xù)表3

3 討 論

中藥具有多成分、多靶標(biāo)和多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，因此，很難闡釋清楚其治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥的現(xiàn)代研究提供了全新的思路[11-12].

本研究構(gòu)建了白鮮皮中與抑菌相關(guān)的化合物-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，共包含27個化合物和20個作用靶點(diǎn)，可見白鮮皮發(fā)揮抑菌作用具有多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn).研究結(jié)果顯示白鮮皮中具有抑制細(xì)菌作用的化學(xué)成分可能是Calodendrolide，葉含狹葉香茶菜素(Angustifolin)，檸檬苦素(Limonin)和吳茱萸苦素(Rutaevin)等，這些成分可能通過PIK3CA，ALOX5，ALOX15，PTGS2等靶標(biāo)起治療作用.

磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞單位δ異構(gòu)體(PIK3CA)在肥大細(xì)胞發(fā)育和肥大細(xì)胞介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中起重要作用.有研究結(jié)果表明，組胺過敏引起的肥大細(xì)胞激活脫顆粒釋放出的炎癥介質(zhì)之一，能夠引起皮膚瘙癢[2].結(jié)果顯示Skimmianine，Haplopine，Dictamdiol A，Dictamdiol B，Isodictamdiol和Dasycarpol同時作用于PIK3CA，推測白鮮皮的抑菌作用與這6個活性成分同時調(diào)控PIK3CA的表達(dá)有關(guān).前列腺素類生物合成途徑中的雙重環(huán)氧合酶和過氧化物酶是一類主要來源于花生四烯酸的C20氧化脂類，在炎癥反應(yīng)中具有特殊作用.前列腺素G/H合酶2(PTGS2)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，將二十二碳五烯酸酯轉(zhuǎn)化為13R-HDPA，13R-HDPA是在細(xì)菌感染期間激活巨噬細(xì)胞吞噬作用的13系列消退素的前體.巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)是促炎細(xì)胞因子，參與細(xì)菌病原體的先天免疫反應(yīng)，MIF在炎癥部位的表達(dá)表明其在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在宿主防御中的功能中起介體作用，抵消糖皮質(zhì)激素的抗炎活性.因此，推測白鮮皮的抑菌作用與檸檬苦素同時調(diào)控PTGS2和MIF的表達(dá)有關(guān)，該推測與多篇研究報(bào)道之間形成可很好的相互驗(yàn)證.檸檬苦素是白鮮皮中主要特征性物質(zhì)[5]，Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素具有抗菌活性.Govindachari等[14]研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素對花生柄銹菌具有一定的抑制效果.酪氨酸蛋白磷酸酶非受體2型(PTPN2)通過細(xì)胞質(zhì)激酶JAK1，JAK3及其底物STAT1的去磷酸化來負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(IL2/白介素2和干擾素)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，該信號在細(xì)胞因子受體的下游傳播，還分別通過STAT3和STAT6的去磷酸化來調(diào)節(jié)IL6/白介素6和IL4/白介素4細(xì)胞因子信號傳導(dǎo).研究表明，IL6是一種細(xì)胞因子，由多種類型的具有多效性的細(xì)胞產(chǎn)生，抗IL6治療可減少炎癥并具有抗血管生成作用[15].因此，推測白鮮皮的抑菌作用與Calodendrolide和Dictamnusine同時調(diào)控PTPN2的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)IL6的表達(dá)有關(guān).

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，分析白鮮皮在抑制細(xì)菌方面的有效化學(xué)成分和分子機(jī)制，通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建可直觀地顯示出白鮮皮抑制細(xì)菌具有多成分、多途徑等共同作用的特點(diǎn)，符合中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)，相比西藥靶點(diǎn)單一的作用機(jī)制，副作用小，優(yōu)勢明顯.