盧俊城,楊朝鳳,管祖光,陳達如,邵杰*

(1 浙江師范大學(xué)信息光學(xué)研究所,浙江 金華 321004;2 瑞譜醫(yī)療設(shè)備(東莞)有限公司,廣東 東莞 523808;3 浙江師范大學(xué)杭州高等研究院,浙江 杭州 311200)

0 引言

微生物廣泛分布在生物圈各種環(huán)境中,與眾多生物體存在著各式各樣的依存關(guān)系[1,2]。微生物參與了自然界中C、N、S、P 等元素的物質(zhì)循環(huán),與人類生產(chǎn)生活最為密切;在農(nóng)業(yè)[3]、工業(yè)[4]、發(fā)酵工程[5]、生物酶工程[6]上起著重要的作用,在人類生產(chǎn)實踐中扮演著至關(guān)重要的角色。為了了解微生物生長特性,推動農(nóng)業(yè)、工業(yè)的深入發(fā)展,對微生物生長規(guī)律的研究顯得尤為重要。微生物生長曲線主要反映在某一特定環(huán)境條件下的單細胞微生物在液體培養(yǎng)中表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。根據(jù)微生物生長速率的特性,通常將微生物生長曲線劃分為調(diào)整期(Lag phase)、對數(shù)期(Exponential phase)、穩(wěn)定期(Stationary phase)和衰亡期(Decline phase)[7,8],其中調(diào)整期和穩(wěn)定期在實際生產(chǎn)中具有重要作用[9,10]。

目前,微生物生長曲線測量的傳統(tǒng)方法有微生物平板計數(shù)法[11]、生長量測量法[12]等,然而該類方法存在一些不足,如步驟較繁、檢測時間長、需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員、容易因操作人員疲勞而引入誤差等,往往造成檢測結(jié)果不夠精確。近年來,O’Mahony 等[13]通過添加O2傳感探針來測量微生物耗氧量,利用耗氧量分析法間接測量出微生物生長曲線;Mozola 等[14]利用pH 值顯色技術(shù)間接測量出生長曲線,利用微生物代謝產(chǎn)物CO2溶解形成碳酸,溶液pH 值逐漸變化,從而導(dǎo)致化學(xué)指示劑的顏色隨之變化的特性,依據(jù)變化量間接反映微生物生長狀況。然而以上方法均添加了第三方介質(zhì),造成侵入式的操作測量,因此難以將其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中。

由于微生物在生長代謝過程中都會產(chǎn)生CO2,CO2產(chǎn)物釋放法成為該檢測技術(shù)領(lǐng)域中的一種“金標(biāo)準(zhǔn)”。其原理為:微生物在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)過程中,無論是厭氧菌還是需氧菌都在新陳代謝過程中產(chǎn)生CO2,其增量與活體細菌數(shù)量成正比,因此通過測量微生物生長代謝產(chǎn)物CO2的含量能夠?qū)崟r監(jiān)測微生物的生長情況?？烧{(diào)諧半導(dǎo)體激光吸收光譜(TDLAS)技術(shù)是一種具有高靈敏度、高選擇性、高分辨率、結(jié)構(gòu)簡單、以及非侵入式快速在線檢測等優(yōu)勢的痕量氣體分析檢測技術(shù),因其獨特優(yōu)勢,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于呼吸氣體分析、化學(xué)反應(yīng)過程測量、大氣環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)燃燒控制、疾病的早期診斷和篩查、航空發(fā)動機穩(wěn)定性測試等眾多應(yīng)用領(lǐng)域[15,16]。

本文以大腸桿菌作為非典型生物培養(yǎng)樣本,將TDLAS 技術(shù)中的波長調(diào)制吸收光譜(WMAS)技術(shù)應(yīng)用在大腸桿菌生長測量領(lǐng)域,通過監(jiān)測大腸桿菌生長代謝產(chǎn)物CO2氣體實現(xiàn)對大腸桿菌生長過程的監(jiān)測。

1 實驗裝置及理論介紹

1.1 實驗裝置

搭建的實驗裝置如圖1 所示,由函數(shù)發(fā)生器(Agilent,33220A)產(chǎn)生的低頻鋸齒波掃描信號(10 Hz,800 mV)加上鎖相放大器(SR830,SRS)產(chǎn)生的高頻正弦調(diào)制信號(20.06 kHz,0.168 V)后接入激光控制器(ModelLDC-501,SRS),其用于掃描和調(diào)制蝶形半導(dǎo)體激光器(DFB,Nanoplus 2004 nm)的輸出波長,調(diào)節(jié)光衰(VOA50PM-APC)使激光至合適強度,并將其耦合至準(zhǔn)直透鏡(F260APC-1550,Thorlabs)中。準(zhǔn)直透鏡輸出的激光打在培養(yǎng)液的上方,穿過培養(yǎng)液上方的CO2氣體介質(zhì)后被光電探測器(LSIPD-261,Hightsensing)接收,再將信號傳輸至鎖相放大器和數(shù)據(jù)采集卡(USB-6351,Nation Instruments)。鎖相放大器將解調(diào)出的二次諧波信號輸入數(shù)據(jù)采集卡,在計算機上通過Labview 獲取到兩個頻道信號,通過對信號數(shù)據(jù)進行分析處理后,得到大腸桿菌的實時生長曲線。其中準(zhǔn)直透鏡、培養(yǎng)瓶和探測器放置在恒溫培養(yǎng)箱中(上海光地儀器設(shè)備有限公司),通過設(shè)定恒溫培養(yǎng)箱的工作溫度,使大腸桿菌生長處于適宜的恒溫狀態(tài)。

圖1 基于波長調(diào)制技術(shù)測量微生物生長的實驗裝置Fig.1 Experimental device for measuring microbial growth based on wavelength modulation technology

1.2 理論介紹

Beer-Lambert 定律是吸收光譜理論中的核心定律,它描述了入射光I0(ν)、透射光I(ν)與氣體吸收介質(zhì)之間的關(guān)系,可表示為

式中:α(ν)為待測量的吸收系數(shù),P為氣體壓強,X為氣體吸收介質(zhì)濃度,S為吸收譜線的線強,φ(ν)為線型函數(shù),L表示為激光與氣體吸收介質(zhì)的相互作用長度。由(1)式可見,在已知氣體壓強、吸收譜線線強、線型函數(shù)和光程的情況下,通過測量光束與氣體相互作用后強度的衰減可以計算出氣體濃度。為了提高探測極限,實驗中通常采用WMAS 技術(shù)對氣體濃度進行測量[17,18]。當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)的氣體吸收較小時[PXSφ(ν)L≤0.05],從鎖相放大器解調(diào)出來的二次諧波的峰值為

式中:ν0為躍遷中心頻率,m為調(diào)制幅度,θ=ωt,ω=2πf。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 微生物接種

在開始微生物生長測量實驗前需要制備已知濃度的微生物,并接種到裝有液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani,LB)的培養(yǎng)瓶里,此處接種的微生物為大腸桿菌。

1)滅菌和配置培養(yǎng)基:取出試管架、酒精燈、接種針和無菌試管等實驗工具,擺放在無菌超凈臺上,打開紫外燈將實驗工具和超凈臺滅菌30 min,然后配制LB 固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基,將配制好的培養(yǎng)基放入三角瓶,加上封口膜;將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好,一起放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),在1 kg/cm2(121°C)條件下滅菌15 min。固體的培養(yǎng)基倒平板備用。

2)復(fù)蘇:挑取大腸桿菌菌種。利用濃度為99%的酒精棉布擦拭手,點亮酒精燈,在酒精燈火焰下利用接種環(huán)取出一環(huán)大腸桿菌,在培養(yǎng)基上劃線,將培養(yǎng)皿倒置,在37°C 條件下培養(yǎng)24 h 至長出菌落。

3)搖菌:向無菌試管內(nèi)加入3 mL LB 液體培養(yǎng)基,挑取單菌落加入培養(yǎng)基中,將試管放入搖床振蕩活化,其中搖床工作溫度設(shè)定為37°C。

4)擴大培養(yǎng):在無菌超凈臺上放置三管無菌水。重復(fù)上述的滅菌操作后,將振蕩活化了16 h 的大腸桿菌培養(yǎng)液稀釋,并使用移液槍取出5 mL 的大腸桿菌溶液移至裝有45 mL 的LB 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里,搖晃均質(zhì),使培養(yǎng)瓶中微生物的初始濃度為3×104CFU/mL。

2.2 實時監(jiān)測信號

根據(jù)2.1 中的微生物接種步驟,將大腸桿菌接種至培養(yǎng)瓶中,然后將培養(yǎng)瓶放置在恒溫培養(yǎng)箱(設(shè)置為25°C)內(nèi)進行培養(yǎng)和生長測量。在培養(yǎng)測量過程中由數(shù)據(jù)采集卡將探測到的CO2吸收信號傳至計算機,培養(yǎng)瓶接種大腸桿菌后4 個時刻的二次諧波(2f)信號以及對應(yīng)的擬合信號,如圖2 所示。

圖2 接種大腸桿菌后不同時刻(a)0 h,(b)12 h,(c)24 h,(d)32 h的2 f 信號及對應(yīng)的擬合信號Fig.2 The second harmonic signals and fitting signals after Escherichia coli inoculation at(a)0 h,(b)12 h,(c)24 h,(d)32 h

由圖2 可見,實驗測量的CO2的2f信號擬合效果較好。在圖2 中,根據(jù)(2)式和0、12、24、32 h時刻的2f峰值反演出對應(yīng)時刻的CO2濃度分別為0.038%、0.0733%、0.727%、1.022%,對應(yīng)的信噪比分別為72.18、70.97、80.96、80.98 dB。通過連續(xù)36 h 對培養(yǎng)瓶內(nèi)CO2氣體的2f信號進行監(jiān)測,可獲取大腸桿菌在25°C 培養(yǎng)條件下的生長曲線,如圖3 所示。

為了分析并驗證波長調(diào)制吸收光譜技術(shù)對大腸桿菌生長曲線測量的可行性,還需利用微生物生長模型對實驗測量獲取的大腸桿菌生長曲線進行擬合。

2.3 實驗曲線擬合分析

實驗測得的大腸桿菌生長曲線分為4 個時期,如圖3 所示,分別為調(diào)整期、對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期?，F(xiàn)用生物學(xué)常用的Gompertz 模型[19,20]來擬合分析實驗測得的大腸桿菌生長曲線,并討論該模型的擬合情況。圖4 描述了在25°C 培養(yǎng)條件下的大腸桿菌生長曲線在Gompertz 模型下的最小二乘法擬合結(jié)果及殘差圖。

圖3 25 °C 下實驗測量的大腸桿菌生長曲線Fig.3 The growth curve of Escherichia coli measured at 25 °C

圖4 (a)實驗測量獲得的生長曲線;(b)Gompertz 模型擬合的生長曲線Fig.4 (a)Growth curve obtained by experimental measurement;(b)Growth curve fitted by Gompertz model

如圖4 所示,在Gompertz 模型擬合下,由殘差圖可以看出調(diào)整期和衰亡期的實際測量數(shù)據(jù)與擬合數(shù)據(jù)偏差較小,而對數(shù)期和穩(wěn)定期的實際測量數(shù)據(jù)與擬合數(shù)據(jù)偏差相對調(diào)整期和衰亡期的偏差較大,即微生物擬合生長量要大于實際的生長量。偏差介于0.025～0.07,且較大偏差對應(yīng)的時刻分別為14～19、22～24、27～29 h,不過總體擬合效果較好。

2.4 不同溫度下的生長曲線測定

為了探究在不同培養(yǎng)溫度下激光吸收光譜技術(shù)對大腸桿菌的生長測量應(yīng)用,重復(fù)上述大腸桿菌的接種流程,依次取5 mL 大腸桿菌菌液至7 瓶裝有45 mL LB 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,大腸桿菌濃度均為3×104CFU/mL。調(diào)節(jié)恒溫培養(yǎng)箱的工作溫度,依次實現(xiàn)在26、29、32、34、37、39、41、43°C 培養(yǎng)條件下的大腸桿菌生長測量。計算機每隔3 min 采樣并保存一次測量數(shù)據(jù),并對測量數(shù)據(jù)平均100 次。

圖5 是大腸桿菌在不同培養(yǎng)溫度條件下(26、29、32、34、37、39、41、43°C)測得的生長曲線,并用Gompertz 生長模型對所測得大腸桿菌生長曲線進行擬合的結(jié)果。

圖5 實驗在不同溫度(a)26 °C,(b)29 °C,(c)32 °C,(d)34 °C,(e)37 °C,(f)43 °C 下測量的大腸桿菌生長曲線及Gompertz 模型擬合情況Fig.5 The growth curve of Escherichia coli and the Gompertz model measured at(a)26 °C,(b)29 °C,(c)32 °C,(d)34 °C,(e)37 °C,(f)43 °C

由圖5 可見,利用激光吸收光譜技術(shù)檢測微生物生長代謝產(chǎn)物(CO2)法所測得的生長曲線能夠準(zhǔn)確地反映大腸桿菌在不同溫度下生長的調(diào)整期、對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期的時間。這一結(jié)果表明,激光吸收光譜技術(shù)檢測微生物生長代謝產(chǎn)物(CO2)法測定大腸桿菌生長曲線是可行的。傳統(tǒng)的生長測量法測定微生物生長曲線的操作過程復(fù)雜、檢測時間長、工作量大、人工干預(yù)較多、誤差來源多,從而對測量結(jié)果造成較大誤差,而激光吸收光譜技術(shù)檢測微生物生長代謝產(chǎn)物(CO2)法繪制生長曲線操作過程簡單,只需測定CO2含量,檢測時間短,非侵入式操作,測量得到的數(shù)值更加準(zhǔn)確,誤差也更小。

3 結(jié)論

將TDLAS 技術(shù)應(yīng)用于微生物生長測量,實時測量了大腸桿菌的生長曲線,同時利用生物學(xué)常用的Gompertz 模型對實驗測得的微生物生長曲線進行擬合,結(jié)果顯示總體擬合效果較好,能夠準(zhǔn)確反映微生物生長各個時期的狀況。同時實現(xiàn)了在25、26、29、32、34、37、43°C 培養(yǎng)條件下的大腸桿菌生長曲線測量。利用TDLAS 技術(shù)測量微生物的生長誤差較小,相對于現(xiàn)有的耗氧量分析法和pH 值顯色法等,具有非侵入式測量、結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便、檢測時間短等優(yōu)勢。所以,激光吸收光譜技術(shù)檢測微生物生長代謝產(chǎn)物(CO2)法可以很好地應(yīng)用于微生物生長測量領(lǐng)域。