石鋼鵬，闕 鳳，高天麒，汪 蘭，汪 超，石 柳，吳文錦，喬 宇，丁安子，熊光權(quán),

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068）

大口黑鱸（Lateolabrax japonicus），屬于真鱸科。鱸魚原產(chǎn)于美國，在20世紀(jì)80年代，作為替代品種引入中國。我國鱸魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量大且逐年遞增，廣東省是全國養(yǎng)殖淡水鱸魚第一大省，占全國養(yǎng)殖鱸魚總產(chǎn)量的58.6%，浙江省其次，僅占13.6%[1]。鱸魚肉質(zhì)細(xì)嫩、肉為蒜瓣形，滋味鮮美，蛋白質(zhì)含量豐富，富含鈣、鋅等微量元素，營養(yǎng)價值高[2?3]。與海鱸魚相比，淡水鱸魚水分含量高，易變質(zhì)或破膽，且糖原含量較少，僵直時間短，內(nèi)源性蛋白酶在常溫下活性最高，造成魚體死亡后自溶速度快，易產(chǎn)生不愉快的氣味，影響消費者的購買欲，不利于鱸魚的鮮銷。

為了避免魚肉蛋白的浪費，應(yīng)自其捕撈開始就采取低溫保鮮方法延緩腐敗菌的繁殖速率。冷凍保鮮是目前應(yīng)用最廣泛的水產(chǎn)品保鮮方式，將水產(chǎn)品凍結(jié)，并保持低溫狀態(tài)，能夠較長時間的保證水產(chǎn)品新鮮度。在貯藏期內(nèi)，脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解變性、水分流失等一系列化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生[4]，進(jìn)而加快凍品品質(zhì)劣變[5]。魚肉在凍藏過程中對魚肉風(fēng)味品質(zhì)影響最大的是蛋白質(zhì)變性降解，造成蛋白質(zhì)變性是由凍結(jié)方式、貯藏溫度、時間以及貯藏期間的溫度波動等多因素協(xié)同作用導(dǎo)致的[6]。目前，市面上應(yīng)用廣泛且效果顯著的快速凍結(jié)技術(shù)：液氮速凍技術(shù)——液氮速凍能夠迅速凍結(jié)，以最短時間穿過最大結(jié)晶區(qū)，形成細(xì)小且分布均勻的冰晶，最大限度的減少組織被破壞程度，且解凍后原料最大限度的保持食品原有品質(zhì)[7]。Hame等[8]指出在大眼魚凍藏過程中，凍藏時間的長短與肌肉中巰基含量成反比。Sun等[9]比較浸沒冷凍與空氣冷凍鯉魚并貯藏，發(fā)現(xiàn)不同冷凍貯藏方式的細(xì)胞中冰晶的形成可能會因機(jī)械應(yīng)力對肌肉組織結(jié)構(gòu)造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，進(jìn)而影響鯉魚品質(zhì)。Careche[10]等發(fā)現(xiàn)鱈魚、鱸魚魚片的感官品質(zhì)與肌球蛋白的含量有強(qiáng)相關(guān)性。Yuan[11]等通過比較速凍（1 ℃/min）與慢凍（0.01 ℃/min）對魚肉肌原纖維蛋白變性的影響，發(fā)現(xiàn)凍結(jié)速率對肌原纖維蛋白影響不顯著（P>0.05）。液體浸漬冷凍是利用一些無毒，對食品沒有傷害且冰點較低的試劑配置成冷凍液，將樣品浸沒于冷凍液內(nèi)，與樣品直接或間接接觸的新型冷凍技術(shù)。浸漬冷凍技術(shù)在果蔬方面應(yīng)用廣泛，水產(chǎn)品中應(yīng)用較少[12]。Yang[13]等比較不同速凍方式、貯藏在不同溫度的河豚魚片，發(fā)現(xiàn)浸沒冷凍（?30 ℃）的魚片最接近液氮冷凍處理的樣品。近幾年，有關(guān)于淡水鱸魚肉凍藏過程中蛋白質(zhì)品質(zhì)相關(guān)報道較少，因此探究液氮、冷凍液、平板速凍三種速凍方式的達(dá)?18 ℃時間快慢對凍藏過程中鱸魚蛋白品質(zhì)的影響具有重大意義。

本文以鱸魚為研究對象，采用液氮、包裝浸漬、平板速凍，三種速凍方式對真空包裝鱸魚塊進(jìn)行凍結(jié)處理，記錄魚塊中心溫度，待魚塊達(dá)?18 ℃時間，停止記錄，置于?18 ℃下貯藏。通過測定鹽溶性蛋白含量、巰基、Ca2+-ATPase酶活、羰基化合物、表面疏水性、內(nèi)源性熒光光譜等為蛋白類理化指標(biāo)，并結(jié)合貯藏過程中鱸魚肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果，綜合分析不同降溫速率對鱸魚在低溫貯藏期內(nèi)蛋白組成的變化情況，深入分析冷凍鱸魚肌原纖維蛋白品質(zhì)特性變化的內(nèi)在原因，旨在為淡水大口黑鱸冷凍保鮮技術(shù)研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鱸魚（650±50 g）（Lateolabrax japonicus）湖北省武漢市白沙洲水產(chǎn)品批發(fā)市場；無水乙醇、丙二醇、氯化鈉、鹽酸、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼、十二烷基硫酸鈉等 國藥集團(tuán)化學(xué)集團(tuán)有限公司；8-苯胺-1苯磺酸 源葉生物有限公司；牛血清蛋白、DTNB Biosharp；EGTA 飛揚(yáng)生物有限公司；Tris、鹽酸胍 BioFroxx GmbH；以上試劑均為分析純。

KLS-YXD-1柜式液氮速凍機(jī) 成都科萊斯低溫設(shè)備有限公司；BC/BD-200HEF冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司；DZD-600/S2E真空包裝機(jī)燕城神州食品機(jī)械（北京）有限公司；3K15離心機(jī)德國Sigma公司；CF15R高速低溫離心機(jī) 日本日立公司；pH計FE20 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T18 basic均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；F-4600日立熒光光譜儀 日本島津RF5301；722N可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；HHZK2恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RC-4HA/C迷你型溫濕度記錄儀 江蘇精創(chuàng)電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 在4 ℃的冷庫中取鮮活鱸魚用榔頭敲暈，宰殺，統(tǒng)一取自魚體兩側(cè)鰓蓋后至尾鰭前取體背部肌肉作為樣品進(jìn)行測定。取宰殺后清洗干凈的魚背部白肉，將其分割成3 cm×3 cm×3 cm。魚塊樣本隨機(jī)分裝在聚乙烯薄膜真空袋中，真空包裝。將包裝好的鱸魚塊，隨機(jī)分成3組，共498袋，165/組。

1.2.2 凍結(jié)與凍藏 將整理好的真空包裝鱸魚塊隨機(jī)分成三組，分別進(jìn)行如下預(yù)凍處理。其中溫度記錄儀探頭插入魚塊中，使用真空包裝抽真空并封口后分別放入冷凍液與平板中，每隔30 s對溫度進(jìn)行一次記錄。

液氮組：樣品裝盤放入柜式液氮速凍機(jī)，將溫度記錄儀探頭插入魚肉中，每隔30 s記錄一次溫度，待魚肉中心溫度到?18 ℃后，停止記錄，取出。

冷凍液組：現(xiàn)配現(xiàn)用的冷凍液在宰殺鱸魚時放入?4 ℃進(jìn)行預(yù)冷，將真空包裝好的樣品浸沒在冷凍液中，溫度記錄儀探頭插入魚肉中，待魚肉中心溫度到?18 ℃后，取出。

平板組：直接將真空包裝好的鱸魚塊，于托盤中平攤放置，放入?30 ℃的冷庫中，將溫度記錄儀探頭插入魚肉中，待魚肉中心溫度到?18 ℃后，取出。

以上3種預(yù)凍處理的樣品均放置在?18 ℃冰箱中凍藏，分別于0、1、2、4、12、24 周測定相關(guān)指標(biāo)。取樣后于4 ℃解凍8 h，第二天提取肌原纖維蛋白測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 蛋白類指標(biāo)測定

1.2.3.1 肌原纖維蛋白的提取 參考任麗娜等[14]的方法，取3 g鱸魚肉，加入30 mL的20 mmol Tris-馬來酸緩沖液（50 mmol/L KCl-20 mmol Tris-馬來酸，pH7.0），均質(zhì)，以4 ℃、9000 r/min離心10 min后棄去上清液，重復(fù)上述操作2次。將沉淀與Tris-馬來酸緩沖液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH7.0）按一定比例混合，勻漿，于4 ℃冰箱靜置60 min，取出后于4 ℃、9000 r/min離心30 min，所得上清液為肌原纖維蛋白溶液。

1.2.3.2 肌原纖維蛋白濃度測定 采用雙縮脲方法[14]繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以濃度和吸光度值為X和Y軸，建立回歸方程y=0.0.24x?0.002（R2=1.000）。

1.2.3.3 總巰基含量的測定 參照董開成方法[15]，取1 mL蛋白樣品溶液（0.4%），加0.2 mol/L Tris-HCl（其中含8 mol/L尿素，10 mmol/L EDTA，2% SDS，pH7.0）緩沖液至10 mL，混勻后室溫放置30 min，取4 mL，加入0.4 mL 0.1% DTNB（Tris-HCl，pH8.0）；在40 ℃反應(yīng)25 min后，測定412 nm處的吸光值，對照管用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸溶液代替樣品溶液外，其他試劑均一樣。計算公式如下：

式中：X為總巰基摩爾濃度，mol/g；C0為肌原纖維蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；A為412 nm處的吸光值；D為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)，13600 L/（mol·cm）。

1.2.3.4 活性巰基測定 取1 mL肌原纖維蛋白樣品溶液（0.4%），加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl（10 mmol/L EDTA，2% SDS，pH7.0）緩沖液，混勻后在室溫下放置30 min，取4 mL，加入0.4 mL 0.1% DTNB（Tris-HCl，pH8.0）；在40 ℃反應(yīng)25 min后，測定412 nm處的吸光值，空白用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸溶液代替樣品溶液外，其他試劑均一樣。計算公式與式（1）一致。

1.2.3.5 羰基化合物 羰基化合物含量測定參照石鋼鵬[16]等的方法進(jìn)行測定。取0.5 mL肌原纖維蛋白溶液分裝于離心管中，2 mL 2,4-二硝基苯肼（DNPH）溶液（10 mmol/L，用2 mol/L HCl溶解）與2 mL 2 mol/LHCl溶液分別加入離心管中。避光靜置1 h（每10 min渦漩混勻，25 ℃）。隨后加入2.5 mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白，11000 ×g離心3 min，取沉淀用2 mL乙酸乙酯/乙醇（1:1，v/v）洗滌3次，留沉淀。加入6 mL 6 mol·L?1的鹽酸胍溶解沉淀，室溫放置10 min后11000 ×g離心3 min，在370 nm波長下測定上清液的吸光度。蛋白質(zhì)中的羰基含量（nmol/mg蛋白質(zhì)），參照公式（1）計算，其摩爾消光系數(shù)22000 L·（mol·cm）?1。

1.2.3.6 Ca2+-ATPase酶活 采用南京建成生物工程研究所提供的超微量Ca2+-ATPase酶測試盒測定。

1.2.3.7 表面疏水性的測定 參考李清正[17]等方法，略作修改。以1-苯奈氨-8-磺酸（8-anilino-1-naphtha lenesulfonicacid，ANS）作為熒光探針，用0.6 mol/L KCl-10 mmol/L（pH7.0）磷酸鹽緩沖液將肌原纖維蛋白濃度分別調(diào)至0.1、0.2、0.3、0.5 mg/mL。4種質(zhì)量濃度的蛋白溶液各取4 mL，加入20 μL pH7.0含8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻后用熒光分光光度計測定，條件為：激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390和470 nm，寬均為5 nm。用熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度的斜率表示蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.2.3.8 內(nèi)源熒光光譜 參考朱姝冉[18]方法，略作修改。取3 mL肌原纖維蛋白溶液（1 mg/mL），于1 cm四通石英比色皿中，以280 nm為激發(fā)波長，在熒光分光光度計上記錄270~450 nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。發(fā)射光譜的操作條件為：掃描范圍270~450 nm，掃描速度2400 nm/min，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為2.5 nm，響應(yīng)時間為0.5 s，記錄數(shù)據(jù)波長間隔為1 nm。

1.2.3.9 SDS-PAGE凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參 考Laemmli[19]的方法，稍作修改。吸取前處理后的上清液8 μL進(jìn)行點樣，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。樣品在濃縮膠中電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓改為120 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗至少做3次，并計算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差以表示試驗結(jié)果，試驗數(shù)據(jù)采用軟件Graphpad Prism 5.0、OriginPro 2017 SR 2、Image J處理、作圖，用軟件SPSS 20.0進(jìn)行顯著性差異分析與相關(guān)性分析（P<0.05）、用OriginPro 2017 SR 2雙向方差分析（ANOVA）分析了速凍方式和貯藏時間對冷凍鱸魚肉片蛋白類指標(biāo)的相互作用的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱸魚肉中心部位的凍結(jié)曲線

凍結(jié)曲線是反映食品在凍結(jié)過程中，其中心溫度與凍結(jié)所用時間的關(guān)系曲線，一般劃分三個階段：先下降放出顯熱、中間平滑，食品中大部分的水結(jié)晶、最后下降至?18 ℃[13]。如圖1，第一階段（Ⅰ）：從食物的初始溫度到凍結(jié)點，曲線陡峭；第二階段（Ⅱ）：冰晶生成區(qū)，組織中液態(tài)水變成固態(tài)冰，曲線較為平坦，此時食品中大部分水都凍結(jié)成固態(tài)冰，該溫度區(qū)間稱為最大冰晶生成帶；第三階段（Ⅲ）：食品中殘留的水繼續(xù)凍結(jié)成冰，恒溫不變。第三階段斜率大于第二階段。凍結(jié)過程中，凍結(jié)速率對于樣品品質(zhì)有直接的影響。形成最大冰晶帶速率越快，冰晶體積越小，分布更為均勻，對組織的破壞性越小，越有利于食品的保存[20?21]。

圖1 不同凍結(jié)方式對鱸魚肉中心部位的凍結(jié)曲線Fig.1 Freezing curve of the middle part of the Lateolabrax japonicus by different freezing methods

圖1 反映的是三種凍結(jié)方式處理的大口黑鱸鱸魚魚塊的中心溫度從4 ℃降至?18 ℃的溫度變化曲線。從圖中可以看出，冷凍液速凍最大冰晶帶溫度區(qū)間為?0.6~?1.3 ℃，用時13 min，其中心溫度降至?18 ℃用時142 min。平板速凍最大冰晶帶溫度區(qū)間為?0.5~?1 ℃，用時52 min，降至?18 ℃全程耗時156 min，而液氮速凍的最大冰晶生成帶溫度區(qū)間為?2.45~?6.22 ℃，用時5 min，而液氮組中心溫度降至?18 ℃僅用時12 min，整體用時最短，凍結(jié)效率最高，約是冷凍液速凍的11.8倍，平板速凍的13倍。液氮速凍、冷凍液速凍、平板速凍的降溫速率分別是1.81、0.15、0.14 ℃/min。由此可見，液氮速凍生成最大冰晶帶時間最短，降溫速率最快，所形成的冰晶小且分布均勻，對細(xì)胞損傷最小，而平板速凍與冷凍液速凍的降溫速率相差不大，冷凍液組形成最大冰晶帶的時間和所用時間均早于平板組。由此推測經(jīng)液氮速凍凍藏的鱸魚魚塊品質(zhì)最佳，冷凍液組次之，平板速凍最差。

2.2 鹽溶性蛋白濃度

蛋白質(zhì)變性程度可以用鹽溶性蛋白的含量來評價[22]，魚肉在凍藏時蛋白質(zhì)會降解或變性導(dǎo)致其溶解性發(fā)生變化，鹽溶性蛋白總量下降[23]。肌原纖維蛋白對肌肉質(zhì)地和持水力有重要作用。如圖2所示，?18 ℃凍藏下，與新鮮魚塊相比，液氮組、冷凍液組、平板組24周時鹽溶性蛋白含量分別為19.62、19.53、19.33 mg/mL，分別下降到新鮮樣品的87.16%、86.76%、85.87%。三組樣品隨時間推移呈顯著性下降趨勢（P<0.05），其中下降速率：平板組>冷凍液組>液氮組，這與2.1結(jié)果一致。魯珺[7]通過比較三種速速凍方式對銀鯧魚貯藏150 d，發(fā)現(xiàn)液氮速凍對肌原纖維蛋白有較好的維持作用，與圖2結(jié)果相符。平板組在最大結(jié)晶區(qū)停留時間最長，凍結(jié)速率最慢，肌原纖維蛋白含量在貯藏末期最低。液氮組凍藏4周時，鹽溶性蛋白含量開始顯著性下降（P<0.05）；冷凍液組貯藏前4周，鹽溶性蛋白含量呈現(xiàn)一定波動，于4周時顯著下降（P<0.05），而平板組凍藏2周后就開始下降。凍結(jié)過程中介質(zhì)溫度會對肌原纖維蛋白產(chǎn)生影響，介質(zhì)溫度越低，凍結(jié)速率越快，鹽溶性蛋白含量越高，魚肉品質(zhì)越好[24]。

圖2 不同速凍方式對鱸魚鹽溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different quick-freezing methods on the content of salt-soluble protein in Lateolabrax japonicus

2.3 巰基含量

由圖3可知，鱸魚蛋白質(zhì)的巰基值在凍藏第4周呈上升的趨勢，隨后下降。巰基是魚肉蛋白中親水基團(tuán)，巰基的變化可表征蛋白質(zhì)的氧化程度。如圖3a所示，在貯藏4周時，3組均達(dá)到最大值，分別為4.83（液氮組）、5.13（冷凍液組）、5.07（平板組）μmol/g，導(dǎo)致巰基上升可能是速凍處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使原藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基基團(tuán)向外暴露。這與Makri[25]研究的金頭鯛在?22 ℃中巰基含量變化趨勢一致。貯藏末期，液氮組、冷凍液組、平板組分別下降到4周時的81.99%、70.57%、75.74%，由此可見巰基下降速率：冷凍液組>平板組>液氮組?？偟膩碚f，貯藏末期的3組總巰基含量與新鮮值相比相差不大，但與4周時的總巰基值相比顯著下降（P<0.05）。其中液氮組總巰基含量在4周時最大值遠(yuǎn)小于另2組，且貯藏24周時最高，平板速凍次之，冷凍液最低，說明液氮速凍形成的冰晶對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞最小，與2.1結(jié)論一致。?18 ℃凍藏，活性巰基的變化趨勢與總巰基一致，呈現(xiàn)出凍藏前期顯著上升，后期顯著下降的趨勢（P<0.05）。液氮組、冷凍液組、平板組第4周時活性巰基含量分別為4.53、4.28、4.96 μmol/g，其上升原因與總巰基上升原因一致。貯藏末期分別下降到4周時的73.95%、65.65%、66.73%。造成這一現(xiàn)象的可能是液氮速凍在最大冰晶帶停留時間最短，形成的冰晶小且均勻，而平板速凍與冷凍液速凍降溫速率相差不大，活性巰基貯藏末期相差不大，這一結(jié)果與楊艷麗等研究凡納濱對蝦經(jīng)液氮速凍和超低溫速凍后蛋白質(zhì)發(fā)生了輕微的速凍變性，變性程度低于冷庫速凍的結(jié)果類似[26]。隨著?18 ℃凍藏時間的推移，魚肉中微量的水變得“游離”，細(xì)胞中出現(xiàn)冰水混合的現(xiàn)象，使蛋白質(zhì)劣變程度加深，游離的活性巰基易被氧化形成二硫鍵，巰基含量的下降[4,27]。

圖3 不同速凍方式對鱸魚巰基含量的影響Fig.3 Effects of different quick-freezing methods on the content of sulfhydryl group in Lateolabrax japonicus

2.4 羰基含量

蛋白羰基含量是蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)，羰基的形成是蛋白質(zhì)分子被機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基修飾的重要產(chǎn)物[28?29]，故可測定羰基含量判斷蛋白質(zhì)受到氧化損傷程度的指標(biāo)之一[30?32]。由圖4可看出，不同速凍方式凍藏的鱸魚肉，隨凍藏時間的推移，羰基值顯著上升（P<0.05）。新鮮鱸魚肉羰基化合物含量為84.48 nmol/g，經(jīng)4周貯藏后，液氮組、冷凍液組、平板組分別上升到新鮮值的164%、145%、205%，其中冷凍液組、平板組第2周時羰基含量比貯藏4周時高，可能是形成的羰基化合物不穩(wěn)定，與機(jī)體內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致羰基值含量下降[33]，這與Estevez M等[34]研究發(fā)現(xiàn)豬肉羰基變化趨勢相似。凍藏2周，三組之間羰基值差異顯著（P<0.05），其趨勢與2.1最大冰晶帶形成時間長短對應(yīng)，時間越長，羰基值越大。凍藏4周，平板組與另兩組差異顯著，可能原因是凍藏期間冰箱的合開導(dǎo)致溫度波動使得液氮組冰晶出現(xiàn)熔融現(xiàn)象，導(dǎo)致其品質(zhì)下降。凍藏12周后，羰基值：冷凍液組<液氮組<平板組，3組之間差異不大（P>0.05）。凍藏末期，平板組值最高、液氮組次之，冷凍液組最小，冷凍液組與平板組之間差異顯著（P<0.05）。羰基值上升可能原因是肌原纖維蛋白降解，包裹于蛋白內(nèi)部的氨基酸暴露，肽鍵和氨基酸側(cè)鏈被自由基氧化，生成羰基化合物[35]。不同處理組羰基值不同，原因可能是液氮組形成最大冰晶帶時間短，形成冰晶小且均勻，對魚肉組織結(jié)構(gòu)破壞最小。而平板組形成最大冰晶帶時間最長，速凍期間細(xì)胞內(nèi)水分不斷向外滲透到細(xì)胞外并持續(xù)凝固導(dǎo)致形成冰晶較大，細(xì)胞受冰晶擠壓變形或破裂，使魚肉組織結(jié)構(gòu)破壞。

圖4 不同速凍方式對鱸魚羰基含量的影響Fig.4 Effects of different quick-freezing methods on carbonyl content of Lateolabrax japonicus

2.5 Ca2+-ATPase酶活

肌原纖維蛋白是一類蛋白的總稱，其中原肌球蛋白、肌球蛋白、肌動球蛋白等占主要成分，肌肉中存在的肌球蛋白與肌動球蛋白在能量的作用下生成肌動球蛋白，而Ca2+-ATPase酶活性與肌球蛋白的頭部區(qū)域密切相關(guān)，可反映樣品在凍藏過程蛋白質(zhì)變性程度的重要指標(biāo)[36]。如圖5所示，?18 ℃凍藏下，不同速凍方式的Ca2+-ATPase酶活力顯著下降（P<0.05）。貯藏1周Ca2+-ATPase酶活達(dá)最大，分別為11.38（液氮組）、10.76（冷凍液組）、11.15（平板組）μmolPi/mgrot/10 min，Ca2+-ATPase酶活上升可能是在速凍或凍藏過程中酶發(fā)生了部分解聚作用，使得肌動蛋白和肌球蛋白結(jié)合加強(qiáng)。魯珺在銀鯧魚速凍處理貯藏30 d后過程發(fā)現(xiàn)酶活上升[37]，這與本文得出相似的趨勢。1周后3組Ca2+-ATPase酶活值顯著下降（P<0.05），至24周分別降至3.52（液氮組）、2.44（冷凍液組）、3.96（平板組）μmol Pi/m grot/10 min。凍藏引起Ca2+-ATPase酶活下降的原因是多方面的，如pH的下降、巰基氧化、溫度、冰晶大小等[38]貯藏過程這些因素的變化均會導(dǎo)致Ca2+-ATPase酶活性的下降。閆春子等[39]認(rèn)為巰基氧化形成二硫鍵導(dǎo)致的分子聚合是Ca2+-ATPase酶活性下降的主因。Ca2+-ATPase酶活性下降可能的原因是不同速凍方式的降溫速率有差別以及貯藏時溫度的波動引起冰晶增大或溶解產(chǎn)生“游離”的水，魚肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的化學(xué)鍵發(fā)生變化，引起Ca2+-ATPase酶活的下降。

圖5 不同速凍方式對鱸魚Ca2+ATPase酶活含量的影響Fig.5 Effects of different quick-freezing methods on the activity of Ca2+-ATPase in Lateolabrax japonicus

2.6 表面疏水性

蛋白質(zhì)的表面疏水性反映的是蛋白質(zhì)分子表面的疏水性殘基的相對含量，新鮮魚肉蛋白質(zhì)的疏水性基團(tuán)被包裹于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，具有較低的表面疏水性[40]。如圖6，前2周內(nèi)各速凍處理的樣品表面疏水性變化大體上呈上升趨勢，2周后稍微平緩，24周時增長至最大值。其中液氮組2周與另2組差異顯著（P<0.05），4周后變化速率不大，趨于平緩。凍藏24周3組均顯著增大（P<0.05）。凍藏初期，折疊態(tài)的肌原纖維蛋白分子部分開始伸展，原先位于蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)部的疏水性基團(tuán)外露，引起表面疏水性值上升。與新鮮鱸魚肉的表面疏水性值相比，24周時分別上升至新鮮值的5.82（液氮組）、5.89（冷凍液組）、5.69（平板組）倍。這與2.7巰基變化趨勢相對應(yīng)。Zhou等[41]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚糜在?18 ℃凍藏24周后，樣品表面疏水性相對初始值翻倍。凍藏中期，3組均表面疏水性均有先減小，后上升的波動情況發(fā)生，凍藏期間表面疏水性值下降可能是暴露的疏水殘基通過化學(xué)作用力發(fā)生聚合，游離的疏水基團(tuán)減少[42]。Benjakin和SutthiPan[6]也發(fā)現(xiàn)泥蟹蟹肉在貯藏中期，表面疏水性值顯著上升，隨后隨凍藏時間逐漸減少，與本文趨勢類似。

圖6 不同速凍方式對鱸魚表面疏水性的影響Fig.6 Effects of different quick-freezing methods on surface hydrophobicity of Lateolabrax japonicus

2.7 內(nèi)源熒光強(qiáng)度

魚肉蛋白中色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）在230~310 nm間具有吸收紫外入射光而發(fā)射熒光的特性[43]，可根據(jù)該氨基酸殘基的位置和微環(huán)境變化，判斷蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化以及變性程度。

結(jié)合表1與圖7，各速凍處理后的肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度變化趨勢相近，大體上隨著凍藏時間的推移，最大熒光強(qiáng)度明顯上升，其中凍藏前4周，肌原纖維蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度呈先上升，后下降的趨勢，速凍初期內(nèi)源性熒光強(qiáng)度上升可能是不同速凍處理介質(zhì)溫度不同，形成冰晶的速度不一，大小不均勻，導(dǎo)致細(xì)胞破損，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，造成內(nèi)源性熒光強(qiáng)度上升。熒光強(qiáng)度下降可能是暴露的疏水性氨基酸殘基，通過化學(xué)作用力重新發(fā)生聚集，游離的氨基酸減少，與熒光探針結(jié)合表征的量就減少[38,40]。從最大熒光強(qiáng)度對應(yīng)的波長變化，液氮組280 nm處激發(fā)時，最大吸收波長見表1，發(fā)射波長變化范圍為335.2~338.6 nm。貯藏前1周，λmax下降，發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象，2周時λmax從336.4 nm紅移至337 nm，隨后直至凍藏末期λmax下降，持續(xù)發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。與液氮組不同的是，平板組與冷凍液組，4周時λmax均從338.6 nm藍(lán)移至335 nm，凍藏12周時分別紅移至336.6和336.8 nm，貯藏末期發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。熒光最大吸收峰紅移表明色氨酸等熒光發(fā)射基團(tuán)暴露于極性更大的微環(huán)境中，反之藍(lán)移則表明發(fā)射基團(tuán)周圍的微環(huán)境極性減小，疏水性較大[43]。

圖7 不同速凍方式對鱸魚內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effects of different quick-freezing methods on endogenous fluorescence intensity of Lateolabrax japonicus

表1 不同速凍方式在貯藏期間鱸魚最大內(nèi)源性熒光強(qiáng)度Table 1 Maximum endogenous fluorescence intensity of Lateolabrax japonicus during storage in different quick-freezing methods

2.8 凍藏期間不同速凍方式對鱸魚肌原纖維蛋白的降解

SDS-PAGE是用來評價肉類產(chǎn)品在貯藏和加工過程中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響的技術(shù)之一[44]。SDSPAGE法分離蛋白的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)能與陽離子表面活性劑SDS依據(jù)重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)按分子大小分離。本文采用不同速凍方式對鱸魚肉進(jìn)行快速冷凍，于?18 ℃進(jìn)行凍藏，分別于0、1、2、4、12、24周提取肌原纖維蛋白。一些研究者發(fā)現(xiàn)凍藏會引起肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變和蛋白分子間的聚合，在電泳圖上表征為蛋白條帶的消失或增強(qiáng)[45]。圖8參照Shi等[46]和Araki[47]等的相關(guān)研究，對電泳條帶所屬蛋白質(zhì)亞基進(jìn)行標(biāo)注。

通過SDS-PAGE凝膠電泳分析不同速凍方式的鱸魚肉經(jīng)凍藏后肌原纖維蛋白變化情況，如圖8所示。新鮮鱸魚肉肌原纖維蛋白主要條帶有10條，分別如圖8中泳道16所示。經(jīng)冷凍液、平板、液氮速凍后貯藏1周肌原纖維蛋白明顯條帶有9條，從上到下分別是分子量245 kDa Co、220 kDa MHC、180 kDa MHC-2、48 kDa Ac、35 kDa TNT、<35 kDa MLC-1、25 kDa TNI、<20 kDa MLC-2、MLC-3，其中TM條帶消失。泳道16的MHC條帶與泳道13~15相比變淡變淺，說明在冷凍貯藏過程中二硫化物的降解速率隨時間的推移逐漸變快，Lu等[48]也得出類似的結(jié)論。隨著貯藏時間的延長，主要的蛋白質(zhì)條帶信號均有減弱，一定程度上表明肌原纖維蛋白中不同分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)亞基均出現(xiàn)不同程度的降解或聚集，且通過Image J對電泳條帶灰度值的計算，發(fā)現(xiàn)冷凍液組與平板組蛋白質(zhì)降解速度快于液氮組，整個貯藏過程中Ac灰度值液氮組始終大于另兩組，而平板組與冷凍液組相差不大，這一結(jié)果與Ca2+-ATPase酶活變化趨勢相符。通過觀察泳道16，發(fā)現(xiàn)MHC在濃縮膠部分形成一些顏色較暗的條帶，可能原因是速凍方式處理導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，形成了高分子質(zhì)量的聚集，堆積在分離膠的頂部，甚至可能存在于濃縮膠中，無法進(jìn)入到分離膠，形成一些顏色較暗的條帶[49]。貯藏12周時，冷凍液組的肌球蛋白輕鏈變淺變細(xì)，凍藏末期條帶消失，蛋白質(zhì)高度降解。24周時，不同速凍方式的肌原纖維蛋白的Co與MHC-2條帶邊緣逐漸模糊，降解最為嚴(yán)重。電泳結(jié)果表明，液氮速凍能夠維持鱸魚的蛋白質(zhì)品質(zhì)，延長貨架期。并且這種保護(hù)僅持續(xù)12周，24周液氮速凍樣品的條帶與另兩組差別不大，優(yōu)勢不明顯。

圖8 凍藏期間鱸魚肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.8 SDS-PAGE patterns of myofibrillar proteins of Lateolabrax japonicus during frozen storage

2.9 雙因素方差分析與指標(biāo)之間相關(guān)性分析

雙因素方差分析結(jié)果表明：貯藏時間對鱸魚過程中凍藏過程中肌原纖維蛋白、總巰基、表面疏水性含量、最大熒光強(qiáng)度有顯著影響（P<0.05），對其他蛋白類指標(biāo)影響不顯著（P>0.05）。從表2看出，速凍方式對活性巰基含量和色氨酸最大熒光強(qiáng)度有顯著性影響（P<0.05），速凍方式與貯藏時間的交互作用對表面疏水性（P=4.221×10?4<0.01）與色氨酸最大熒光強(qiáng)度（P=5.777×10?12<0.01）有極顯著性影響。冷凍速率的快慢，對肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)有影響，冷凍速率越慢，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞程度越大，導(dǎo)致包埋于蛋白內(nèi)部氨基酸游離，導(dǎo)致活性巰基含量升高以及色氨酸熒光強(qiáng)度上升。綜上所述，貯藏時間是影響鱸魚魚片蛋白品質(zhì)的主要因素，這一點與Shi[50]等得出的結(jié)論一致。三種速凍方式的降溫速率不同，使其對鱸魚魚快蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)有影響，但影響不顯著（P>0.05）。

表2 凍藏大口黑鱸的蛋白類指標(biāo)速凍方式和貯藏時間的雙因素方差分析結(jié)果Table 2 Results of two-factor analysis of variance for the quick-freezing method and storage time of the protein index of frozen Lateolabrax japonicus

相關(guān)性分析結(jié)果表明，如表3所示，鹽溶性蛋白與Ca2+-ATPase酶活性極顯著正相關(guān)，與羰基、表面疏水性、最大熒光強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與Ac、MLC-3呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。肌球蛋白是肌原纖維蛋白的主要成分，隨凍藏時間推移肌球蛋白的頭部是自由基氧化修飾的主要靶標(biāo)?？値€基與活性巰基極顯著正相關(guān)（P<0.01），與Ca2+-ATPase酶活性、MHC顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）；活性巰基與最大熒光強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；Ca2+-ATPase酶活性與羰基、表面疏水性、最大熒光強(qiáng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與TNT呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與MLC-3呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），這可能是因為肌鈣蛋白與肌球蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致Ca2+-ATPase酶活性下降。羰基與表面疏水性、最大熒光強(qiáng)度極顯著正相關(guān)（P<0.01），與MHC呈顯著負(fù)相關(guān)；表面疏水性與最大熒光強(qiáng)度極顯著正相關(guān)，與MHC呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與Co、TNT呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；最大熒光強(qiáng)度與MHC呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與TNT呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；Co與MHC、Ac、TNT、MLC-3之間呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。魚肉在凍藏過程中發(fā)生兩種變性，分別是是蛋白質(zhì)的聚集和蛋白質(zhì)多肽鏈的展開。肌原纖維蛋白隨貯藏時間的推移，氧自由基與非氧自由基氫過氧化物對氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)斷裂或交聯(lián)聚集。原蛋白質(zhì)分子表面氨基酸與周圍水分子相互作用及分子內(nèi)相互作用也會影響蛋白質(zhì)完整性及立體構(gòu)象穩(wěn)定性。綜上所述：降溫速率的不同，對氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾程度有差異，而氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)與蛋白質(zhì)氧化變性密切相關(guān)。

表3 不同速凍處理對凍藏期間鱸魚肌原纖維蛋白質(zhì)生化特性的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of different quick-freezing treatments on the biochemical characteristics of Lateolabrax japonicus myofibril Protein during frozen storage

3 結(jié)論

可依據(jù)鱸魚肉塊中心溫度以及最大冰晶帶形成時間，可推測出鱸魚蛋白特性隨貯藏時間推移劣變順序：平板組>冷凍液組>液氮組；肌原纖維蛋白總量呈下降趨勢：平板組凍結(jié)速率最慢，液氮組最快，分別在凍藏末期最低與最高；巰基值與Ca2+-ATPase酶活均呈先上升后下降的趨勢，巰基值4周時升至最高，Ca2+-ATPase酶活1周時酶活力最強(qiáng)，隨之下降。三組羰基值顯著上升，凍藏末期，平板組值最高、液氮組次之，冷凍液組最小，冷凍液組與平板組之間差異顯著（P<0.05）。貯藏前期具有較低的表面疏水性值，隨貯藏時間的推移，肌原纖維蛋白疏水性基團(tuán)暴露，導(dǎo)致后期表面疏水性顯著上升。內(nèi)源性熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)疏水性基團(tuán)緊密相關(guān)。電泳結(jié)果表明，液氮速凍能夠維持鱸魚的蛋白質(zhì)品質(zhì)，延長貨架期。并且這種保護(hù)僅持續(xù)12周，24周液氮速凍樣品的條帶與另兩組差別不大，優(yōu)勢不明顯。結(jié)果表明：液氮速凍形成冰晶體積與原料中水的分布相似，對細(xì)胞損傷最小，利于貯藏。相比較于液氮速凍，冷凍液速凍形成最大冰晶帶時間長于液氮速凍，短于平板速凍，兩者相差不大。而凍藏期間蛋白特性出現(xiàn)波動，可能原因是冰箱的溫度波動導(dǎo)致液氮組中細(xì)且小的冰晶變得“游離”，細(xì)胞中出現(xiàn)冰水混合的現(xiàn)象，加速蛋白質(zhì)氧化。另兩組形成冰晶大，溶解所需溫度高。通過雙因素方差分析和相關(guān)性分析表明，速凍處理對鱸魚肌原纖維蛋白之間的變化關(guān)聯(lián)不顯著（P>0.05），而貯藏時間是影響鱸魚蛋白質(zhì)品質(zhì)的主因，貯藏時間越長，魚肉蛋白質(zhì)氧化降解，加速其劣變降解。