紅花煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

董行健,余宗波

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2. 武漢益錦祥生物環(huán)保有限公司，武漢 430070)

1 背景介紹

煙草是一種一年生或有限制性的多年生的草本植物，全株被細(xì)毛，基生稍木質(zhì)化，在夏天和秋天開(kāi)花。煙草原產(chǎn)于南美洲，在我國(guó)南方各省和地區(qū)種植廣泛，主要用途是作為煙草工業(yè)的原料，以及用于農(nóng)藥，藥用麻醉，催汗，鎮(zhèn)定，催吐等。[1]煙草是研究細(xì)胞工程中細(xì)胞脫分化和再分化的理想材料，也是獲得遺傳變異和改善農(nóng)藝性狀的重要材料。與此同時(shí)，煙草愈傷組織也是細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究的重要實(shí)驗(yàn)材料。[2]細(xì)胞工程是生物工程的一個(gè)重要分支學(xué)科，是細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)的交叉領(lǐng)域，主要利用細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段預(yù)先設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳性的特性。目前細(xì)胞工程主要的技術(shù)包括細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞融合，對(duì)染色體的操作，基因的轉(zhuǎn)移等。[3]胼胝質(zhì)又稱愈傷組織，是植物中一種由實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成的一種不形成特定結(jié)構(gòu)的組織，通常出現(xiàn)在植物的傷口部位。18世紀(jì)，法國(guó)植物學(xué)家亨利 路易斯觀察了植物傷口的愈合過(guò)程，首次描述了愈傷組織的形成過(guò)程。來(lái)自未成熟胚胎誘導(dǎo)的愈傷組織可以多次再生，[4]而來(lái)源于成熟胚胎誘導(dǎo)的愈傷組織不可再生?；?、激素、光照均可以影響愈傷組織的再生。[5]在本實(shí)驗(yàn)中，建立了煙草愈傷組織的組織培養(yǎng)再生體系。

2 材料和方法

2.1 植物材料

紅花煙草(Nicotianaxsanderae)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供的種子。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

MS 19.45 g/L

BA 0.20 mg/L

NAA 0.20 mg/L,

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L

分化培養(yǎng)基：

MS 19.45 g/L

BA 0.80 mg/L

NAA 0.20 mg/L

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L

1% NaOH或者1% HCL調(diào)節(jié)pH值至5.8-6.0

2.2 方法

2.2.1 配置煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

MS 19.45 g/L

BA 0.20 mg/L

NAA 0.20 mg/L,

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L,

加入2/3至3/4體積的雙蒸水，用NaOH和HCI攪拌溶解調(diào)節(jié)pH至5.8-6.0。將燒杯放置于電爐上，加入瓊脂然后攪拌并加熱5分鐘使之完全溶解，然后用蒸餾水固定到500 ml的體積，繼續(xù)加熱幾分鐘并混勻，分裝到12個(gè)三角瓶。然后用標(biāo)記筆依次標(biāo)記。在高壓蒸汽滅菌鍋滅菌已包裝的培養(yǎng)基(滅菌條件為121攝氏度，1.1kg/cm2的壓力)經(jīng)過(guò)20分鐘滅菌，將誘導(dǎo)培養(yǎng)基放置入滅菌室。

2.2.2 煙草愈傷組織分化培養(yǎng)基的配置：

MS 19.45 g/L

BA 0.80 mg/L

NAA 0.20 mg/L

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L

加入2/3-3/4體積的蒸餾水，攪拌后溶解，加入NaOH和HCL 調(diào)整 pH至 5.8-6.0.將燒杯放置在電爐上, 然后攪拌加熱約五分鐘并加入瓊脂至完全溶解再用蒸餾水定容至500 ml. 繼續(xù)加熱幾分鐘并攪拌均勻并均勻分裝到12個(gè)三角瓶.然后用記號(hào)筆分別標(biāo)記，在高壓蒸汽滅菌鍋滅菌已分裝好的培養(yǎng)基。

(滅菌溫度為121攝氏度，壓強(qiáng)為1.1kg/cm2)經(jīng)過(guò)20分鐘滅菌，將分化培養(yǎng)基放置入滅菌室)

2.2.3 煙草葉片接種和培養(yǎng)條件

用75%乙醇擦洗超凈臺(tái)，將材料，工具，12瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基等放入臺(tái)面。紫外燈滅菌15分鐘后，打開(kāi)風(fēng)扇開(kāi)始接種操作。關(guān)閉紫外燈，點(diǎn)燃酒精燈，通過(guò)酒精燈干熱滅菌鑷子和手術(shù)刀。取一無(wú)菌皿和一兩片無(wú)菌的幼葉，在無(wú)菌皿中用滅菌的解剖刀將幼葉切割成5mm2左右的小片，然后將其接種于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上，每瓶接種5小片?？焖俜馓?hào)瓶口，用記號(hào)筆寫上姓名和接種日期。接種后的煙草6瓶放于黑暗培養(yǎng)，6瓶放于光照培養(yǎng)。光周期為12小時(shí)/每天，培養(yǎng)溫度為24攝氏度?？梢杂^察到愈傷組織的誘導(dǎo)過(guò)程。在外植體切割過(guò)程中，動(dòng)作要快,以免失水而影響生長(zhǎng)。每完成一次操作后，及時(shí)將鑷子，解剖刀插入酒精瓶中,下次使用前需將酒精烤干消毒后再使用。

2.2.4 煙草葉片誘導(dǎo)情況的觀察

仔細(xì)觀察接種的煙草葉片的愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)情況，比較了光照和黑暗條件下愈傷組織誘導(dǎo)情況的差異，記錄并分析原因。

2.2.5 將煙草葉片從誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種入分化培養(yǎng)基

14天后，將愈傷組織從誘導(dǎo)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基。用75%乙醇擦洗超凈臺(tái)，將材料，鑷子，解剖刀，培養(yǎng)基等放入超凈臺(tái)。紫外線滅菌15分鐘后開(kāi)始操作。雙手消毒，進(jìn)入超凈臺(tái)開(kāi)始接種。關(guān)閉紫外燈，點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈下烘烤鑷子和解剖刀。將煙草愈傷組織從誘導(dǎo)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基。每瓶接種5片煙草愈傷組織，共接種12瓶。迅速密封瓶口，用記號(hào)筆寫好姓名和接種日期。

接種后，所有愈傷組織每天以10小時(shí)/天的光周期培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24°C，培養(yǎng)63天，觀察不同光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的是否生成不定芽以及不定芽的數(shù)量和愈傷組織再分化的狀態(tài)，并作出記錄。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

經(jīng)過(guò)63天的再分化誘導(dǎo)，觀察12瓶分化培養(yǎng)基中愈傷組織的狀態(tài)先觀察整體情況:是否出現(xiàn)污染，是否每一瓶分化培養(yǎng)基都有再生植株。最后，將再生外植體從分化培養(yǎng)基中取出并做如下工作：

(1)對(duì)再生植株數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，收集在光照和黑暗誘導(dǎo)下的愈傷組織并做統(tǒng)計(jì)計(jì)算;

(2)統(tǒng)計(jì)每一瓶分化培養(yǎng)基中的再生植株數(shù)量并計(jì)算平均每一團(tuán)愈傷組織的再生不定芽;

(3)比較在光照和黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

先研究原始外植體誘導(dǎo)成愈傷組織的狀態(tài),原始外植體(幼葉)分別在光照和黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表1(Table 1)顯示。我們首先觀察了愈傷組織的形態(tài)，光照和黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的顏色和大小有顯著不同。在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織普遍黃化(Fig.1 a),然而在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織普遍是亮綠的 (Fig.1 b). 在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織體積也比黑暗條件要大。

Table1 Results of callus induction from tobacco leaves

Fig.1 在不同條件下愈傷組織的誘導(dǎo)情況:a 一瓶典 型的煙草外植體在黑暗條件下誘導(dǎo)形成的愈傷組織;b 一瓶典型的煙草外植體在光照條件下誘導(dǎo)形成的愈傷組織。相比于光照條件，黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織普遍發(fā)黃并矮小，光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織普遍亮綠并體積更大，生長(zhǎng)更加健壯

3.2 愈傷組織再分化及植株再生

把誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的愈傷組織切除下來(lái)并在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，愈傷組織進(jìn)行增殖和植株再生。所有處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)在表2(Table 2)中展示。6周后將再分化的愈傷組織從分化培養(yǎng)基中收集并展示在圖二(Fig.2) 。從外觀上看，在光照和黑暗條件下再分化的愈傷組織略有不同，再生植株也在顏色和形狀上略有差別(Fig.3)。

Table 2 煙草愈傷組織再生的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Table 3 Variance analysis

Fig.2 在第六周收集的再分化的愈傷組織:a一瓶典型的在黑暗中誘導(dǎo)的愈傷組織的再分化狀況;b一瓶典型的在光照中誘導(dǎo)的愈傷組織的再分化狀況。所以在早期就可以預(yù)測(cè)，在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)比在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織更好，因?yàn)樵诠庹諚l件下誘導(dǎo)的愈傷組織更有活力

Fig.3 煙草愈傷組織的再分化情況：a 5團(tuán)典型的在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的再分化情況；b 5團(tuán)典型的在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的再分化情況。我們可以得出結(jié)論：在同樣的光照再分化條件下，在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織再分化后會(huì)泛黃，再分化的芽的體積較小，然而光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織再分化后體積更大，再分化的芽的數(shù)量更多。

為顯示不同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下愈傷組織的差異，并鑒定最好的培養(yǎng)條件，利用方差分析ANOVA (Analysis of Variance)且借助SAS軟件的幫助算出F值 (Fig.4)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的再生芽的平均數(shù)量是20.9，在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的的再生芽的平均數(shù)量為15.3，由此可見(jiàn)在光照條件下的愈傷組織的誘導(dǎo)毫無(wú)疑問(wèn)比在黑暗條件下更成功。

Fig.4 數(shù)據(jù)的描述使用SAS來(lái)幫助處理原始數(shù)據(jù)。單因素ANOVA方差分析是實(shí)驗(yàn)的最好模型a SAS 單因素方差分析對(duì)原始數(shù)據(jù)分析的源代碼b SAS程序方差分析的結(jié)果輸出可視化c y的分布y: 每一團(tuán)愈傷組織再生的不定芽數(shù)量 1:在光照條件下誘導(dǎo)2: 在黑暗條件下誘導(dǎo)，在光照條件下平均每一團(tuán)愈傷組織的再生不定芽的數(shù)量為20.9, 標(biāo)準(zhǔn)差為4.326，在黑暗條件下平均每一團(tuán)愈傷組織的再生不定芽的數(shù)量為 15.33 標(biāo)準(zhǔn)差為2.796. 在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的平均再生不定芽數(shù)量顯著多余黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織。圖片通過(guò)SAS語(yǔ)言代碼實(shí)現(xiàn)可視化。

每一瓶培養(yǎng)基接種5團(tuán)愈傷組織，共有12瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基 ，培養(yǎng)基上標(biāo)注L和D,“L” or “D”. L: light condition, D: dark condition.

收集了12瓶愈傷組織，并描述了再生芽的數(shù)量，體積，顏色和堅(jiān)硬度。在表中顯示了原始數(shù)據(jù). 培養(yǎng)基上被標(biāo)記 “L” or “D”. L: light condition, D: dark condition.

F=464.817/13.265=35.04, P(>F) <0.0001, 得出結(jié)論在光照和黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織在不定芽再生過(guò)程中分化不定芽的數(shù)量有顯著差別。

4 討論

4.1 光照和黑暗對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

實(shí)驗(yàn)分析了光照，黑暗條件對(duì)煙草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和植物再生的影響。首先，在光照和黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織在外觀，顏色，形態(tài)，和體積方面都有顯著差異。黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織一般呈黃色，體積小，光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織呈亮綠色，體積大。由此可見(jiàn)，光照條件更有利于植物愈傷組織的誘導(dǎo)和再生。先前的研究證明過(guò)光照可以促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)[6]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的研究一致。

4.2 連續(xù)光照有利于愈傷組織再分化的原因

另外，連續(xù)光照的條件有利于愈傷組織細(xì)胞再分化與維管組織的形成, 這可以解釋在光照條件下的愈傷組織可以在沒(méi)有外源激素刺激的情況下獨(dú)立分化為芽與根的現(xiàn)象。[7]值得注意的是，高輻射強(qiáng)度的光也可能可以破壞維管組織，[8]并影響愈傷組織的生長(zhǎng)。因此光培養(yǎng)室的光強(qiáng)度應(yīng)該符合自然環(huán)境，以保護(hù)愈傷組織。在分化時(shí)，將所有的愈傷組合接種到分化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入10h/天的光照條件。盡管在再分化階段，所有的愈傷組織都是在相同的條件下培養(yǎng)的，但在黑暗和光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織生成的植株有顯著差異: 在光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織在體積上更大，再分化的芽面積更大，更健壯，有的再生芽甚至長(zhǎng)成了完整植株。[9]相比而言，在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織再生的芽更矮小，絕大部分再生芽高度未超過(guò)2mm，再生芽的顏色也更偏黃。在數(shù)量上，光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織的再生芽也顯著高于在黑暗條件下誘導(dǎo)的。早期研究曾經(jīng)提出，光照會(huì)抑制不含葉綠素的愈傷組織的細(xì)胞的再分化，[10]在黑暗中誘導(dǎo)的愈傷組織積累了很少或沒(méi)有積累葉綠素, 所以在被轉(zhuǎn)移到光照環(huán)境下之后，它的生長(zhǎng)可能收到限制，導(dǎo)致再分化的不定芽的數(shù)量顯著少于在光照條件下誘導(dǎo)的積累了葉綠素的愈傷組織。另外, 光周期也是一個(gè)另外的影響愈傷組織再分化的重要因素，對(duì)于煙草愈傷組織的再分化而言，最適合的光周期是最接近自然情況的每天12-16小時(shí)。[11]晝夜節(jié)律和光周期長(zhǎng)短不僅有利于愈傷組織再生的極性建立和模式形成，也與器官的分化相關(guān)。研究顯示，在長(zhǎng)的光周期和低濃度蔗糖的培養(yǎng)條件下，紅花煙草傾向于發(fā)育成不定芽而不是生根，相比而言，短的光照周期和高濃度蔗糖的培養(yǎng)條件有利于愈傷組織生根和生成塊莖。[12]

4.3 在煙草外植體組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的問(wèn)題及預(yù)防和解決方案

另外一方面，雖然大部分植株再生狀況都很好，一小部分愈傷組織褐化和玻璃化是正?，F(xiàn)象。一開(kāi)始筆者認(rèn)為外植體褐化是因?yàn)榭拷凭珶舯蛔茻脑?，但?shí)際上褐化過(guò)程主要發(fā)生在外植體培養(yǎng)，愈傷組織繼代培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的過(guò)程。外植體褐化不僅影響愈傷組織的誘導(dǎo)，而且還會(huì)影響愈傷組織的正常的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而影響愈傷組織的再分化生長(zhǎng)。眾所周知，多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)是導(dǎo)致外植體和愈傷組織褐化的兩種關(guān)鍵酶。[13]在正常條件下，細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)和醌類物質(zhì)的濃度之間保持著動(dòng)態(tài)的平衡。通常醌類物質(zhì)的濃度很低，但酚氧化酶和酚類物質(zhì)分布在正常組織的各個(gè)部位。酚類物質(zhì)分布在各個(gè)細(xì)胞的液泡中，酚氧化酶則分布在各種質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)膜隔離了酚類物質(zhì)和酚類氧化酶造成了這種區(qū)域性的分布。但是，當(dāng)外植體或愈傷組織遭遇類似于高滲透壓，機(jī)械損傷，細(xì)胞損傷，老化，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)的損傷，均會(huì)導(dǎo)致酚氧化酶的合成和釋放。 此時(shí)，在適宜的PH和溫度條件下，酚類氧化酶，酚類，氧氣會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，生成有毒害的醌類物質(zhì)，導(dǎo)致組織褐化。導(dǎo)致愈傷組織褐化的原因有多種，其中一個(gè)重要原因可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致細(xì)胞壁，細(xì)胞膜，液泡的損害，導(dǎo)致酚類物質(zhì)和多酚氧化酶的接觸。在植物中有活性的多酚氧化酶，在有氧環(huán)境下，催化酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)和水。同時(shí)，過(guò)氧化物酶也會(huì)催化生成氣態(tài)的過(guò)氧化氫，加快酚類物質(zhì)氧化成醌。醌類化合物與蛋白質(zhì)或其他氨基/巰基化合物自發(fā)聚集，形成棕色的產(chǎn)物，導(dǎo)致其他酶促反應(yīng)系統(tǒng)失活，生理代謝紊亂，從而導(dǎo)致外植體和愈傷組織的褐化。最終培養(yǎng)基中的溫度過(guò)高或者光強(qiáng)過(guò)強(qiáng)，會(huì)促進(jìn)褐化反應(yīng)的發(fā)生。[14]同時(shí)，植物的物種，基因型，外植體的年齡，外植體在原有植株上的位置，外植體的大小，外植體培養(yǎng)方法都與外植體的褐化有關(guān)。為了抑制外植體的褐化并根除褐化對(duì)植物造成的傷害，可以采取一下措施；1.選擇具有較強(qiáng)再分化能力的外植體； 2.選擇適合的培養(yǎng)環(huán)境；3.縮短轉(zhuǎn)瓶繼代的時(shí)間周期;4.在培養(yǎng)基中加入活性炭來(lái)吸附酚類物質(zhì);5.在培養(yǎng)基中加入氰化鉀作為抗氧化劑，來(lái)根除醌類和半醌類物質(zhì)。[15]當(dāng)然必須注意評(píng)估加入的化學(xué)物質(zhì)是否對(duì)外植體的生長(zhǎng)和愈傷組織再分化有害。對(duì)于玻璃化的問(wèn)題，它會(huì)導(dǎo)致不正常的植物形態(tài)和大小:植株會(huì)變矮小，葉片會(huì)呈透明或半透明水浸狀。解剖學(xué)特征包括:植株會(huì)矮小并腫脹, 沒(méi)有結(jié)間或結(jié)間非常短，呈玫瑰花環(huán)狀, 桿狀或其他形狀。該組織的主要表現(xiàn)是疏導(dǎo)組織發(fā)育不良，莖間分生能力較弱，芽發(fā)育狀況較差，所以難以分化和生根。玻璃化的葉片往往呈半透明的亮綠色，皺縮。薄壁組織往往過(guò)度生長(zhǎng)，葉肉被充滿葉綠體的實(shí)質(zhì)細(xì)胞充滿，柵欄組織細(xì)胞層的數(shù)量減少，海綿狀葉肉細(xì)胞之間的間隙變小，角質(zhì)層缺失或僅存在薄薄的角質(zhì)層，沒(méi)有典型的表皮細(xì)胞和主葉脈?？偠灾?，如果植株發(fā)生玻璃化，植物的生長(zhǎng)會(huì)遭受顯著的影響，甚至?xí)?dǎo)致植物的最終死亡。[16]外植體的生理年齡，器官的類型，大小，培養(yǎng)條件，外植體的基因型都會(huì)對(duì)外植體的玻璃化產(chǎn)生影響。對(duì)于愈傷組織來(lái)說(shuō)，可能是因?yàn)椴患训耐鈼l件[17]和缺乏能顯著降低玻璃化機(jī)率的紫外線造成的。[18]為了防止外植體的玻璃化，筆者提出以下解決方案：(1)控制光節(jié)律的每天光照時(shí)間為12-16小時(shí)/每天，如果每天光照時(shí)間超過(guò)18小時(shí)，玻璃化反應(yīng)會(huì)自動(dòng)發(fā)生；(2)適當(dāng)提高培養(yǎng)基中的蔗糖和瓊脂濃度；(3)適當(dāng)?shù)亟档团囵B(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度4.提高外植體培養(yǎng)基中硝態(tài)氮比銨態(tài)氮的比例。[19]有些解決方案背后的機(jī)理仍需要我們?nèi)パ芯俊?/p>

4.4 外植體再分化的其他影響因素

當(dāng)外植體經(jīng)歷再分化的過(guò)程，也必須考慮一些其他的環(huán)境條件如水分。水分的影響包括培養(yǎng)基中的水分和外界環(huán)境中的水分。培養(yǎng)基中的水分受培養(yǎng)條件和密封薄膜的影響。經(jīng)證實(shí)，如果密封膜過(guò)緊，外植體的生長(zhǎng)會(huì)受抑制。在培養(yǎng)室中的水分含量跟在培養(yǎng)基中的水分含量一樣重要，可以利用濕度調(diào)節(jié)器將培養(yǎng)室的相對(duì)濕度控制在70%-80%。[20]

特別鳴謝：這項(xiàng)研究是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)隸屬于生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心所支持的(Biology Experiment Teaching Center of College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University)。感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院的齊迎春教授，杜鵑副教授，陳浩副教授，謝婷婷副教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)；也感謝研究生助教為實(shí)驗(yàn)材料的提前準(zhǔn)備的辛勤付出。