王 琪， 邵淑麗,2Δ， 何孟奇， 黃 鑫,2， 張偉偉,2， 張珍珠,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

胃癌是一種高度流行的癌癥類型，通過侵襲和轉(zhuǎn)移具有很高的死亡率，全世界每年有100多萬人新診斷為胃癌[1]。據(jù)報(bào)道，許多天然產(chǎn)物是潛在的抗癌藥，具有高效率，高利用率以及低副作用的優(yōu)點(diǎn)[2]。例如，姜黃素藥理作用十分廣泛，可以通過損傷細(xì)胞線粒體,使之釋放細(xì)胞色素C,活化Caspase 3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。巖藻多糖通過JAK2/STAT1介導(dǎo)的凋亡和自噬作用改善小鼠肝臟再灌注損傷[4]。因此，開發(fā)新型有效的天然抗癌藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。

樺木酸又稱白樺脂酸，是一種萃取自白樺樹的化合物。樺木酸具有抗發(fā)炎，降糖[5]，免疫調(diào)節(jié)[6]等作用，其藥理作用強(qiáng)，副作用低，在癌癥治療中具有顯著的療效[7]。相關(guān)研究顯示，樺木酸通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，將胰腺癌細(xì)胞PANC-1阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制PANC-1細(xì)胞增殖[8]。樺木酸通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路和線粒體途徑誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡[9]。然而，樺木酸在調(diào)控胃癌自噬方面暫無報(bào)道。因此，本研究通過體外加藥，檢測(cè)樺木酸對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞自噬的影響，為樺木酸的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人胃癌MGC-803細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

樺木酸購(gòu)自北京漢博生物有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自Gibico公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Iudustries；總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Power SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自Bioteke Corporation；Beclin-1，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ一抗，兔二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%CO2與飽和濕度環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞分為四組，每組三個(gè)復(fù)孔，用終濃度分別0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L的樺木酸處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)

收集樺木酸處理后的細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA作為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，所得結(jié)果以2-△△Ct方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量(表1)。

Tab. 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis

1.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因的蛋白表達(dá)

將細(xì)胞接種到六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，用不同濃度樺木酸處理48 h，RIPA裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后將蛋白樣電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂奶封閉1.5 h，Beclin-1，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ一抗(均按1∶300進(jìn)行稀釋)孵育過夜，PBST洗膜3次，兔二抗(1∶1 000稀釋)避光孵育1 h，PBST洗膜3次，用Odyssey IR成像儀避光掃描蛋白條帶。

1.6 免疫熒光檢測(cè)人胃癌MGC-803細(xì)胞自噬

將細(xì)胞接種到六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，用不同濃度樺木酸處理48 h，加預(yù)冷的甲醇固定，PBST洗3次。封閉液封閉1 h。一抗4℃過夜，PBST洗3次。二抗避光孵育1 h，PBST洗3次。加50 μl DAPI染細(xì)胞核，PBST洗3次。加10 μl抗熒光淬滅封片液，激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

利用qRT-PCR檢測(cè)不同濃度樺木酸作用人胃癌MGC-803細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1 mRNA表達(dá)。如表2所示，樺木酸處理后，隨著樺木酸濃度升高，LC3和Beclin-1 mRNA表達(dá)均高于未加藥物處理的表達(dá)量，并且差異顯著，當(dāng)樺木酸濃度為30 mg/L時(shí)mRNA表達(dá)量最高。結(jié)果表明，樺木酸可顯著上調(diào)人胃癌MGC-803細(xì)胞LC3、Beclin-1基因mRNA的表達(dá)(P<0.05,P<0.01，表2)。

Tab. 2 Detection of LC3 and Beclin-1 mRNA expressions in MGC-803 n=3)

2.2 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)不同濃度樺木酸作用人胃癌MGC-803細(xì)胞自噬分子標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平。如表3所示，樺木酸處理后，隨著樺木酸濃度升高，LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平以劑量依賴性明顯增加，LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平明顯減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高。結(jié)果表明，樺木酸通過調(diào)控LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞自噬(P<0.05,P<0.01，圖1，表3)。

Tab. 3 The effects of betulinic acid on protein levels of Beclin-1, LC3-Ⅰand n=3)

Fig. 1 Effects of betulinic acid on the protein levels of Beclin-1, LC3-Ⅰand LC3-Ⅱwhen MGC-803 cells were treated for 48 hours (n=3)

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)人胃癌MGC-803細(xì)胞自噬

激光共聚焦顯微鏡觀察LC3蛋白在胃癌MGC-803細(xì)胞的定位及表達(dá)。如圖2所示，樺木酸處理48 h后，隨著樺木酸濃度升高，LC3蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成點(diǎn)狀聚集增多，30 mg/L時(shí)點(diǎn)狀聚集最多。結(jié)果表明，樺木酸的處理誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞發(fā)生自噬。

Fig. 2 Detection of LC3 protein in human gastric cancer treated with betulinic acid for 48 h(bar=100 μm， n=3)

3 討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，通常于晚期發(fā)現(xiàn)，使用傳統(tǒng)手術(shù)和化療很難提高胃癌患者的整體生存率[10]，且術(shù)后易產(chǎn)生化療藥物抗藥性[11]。因此開發(fā)有效，毒副作用小的抗癌藥物刻不容緩。已有研究表明，通過調(diào)控細(xì)胞自噬可起到腫瘤治療的目的[12]，如天然植物提取物10-羥基喜樹堿，可誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞的凋亡和自噬[13]，棉酚通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制自噬來增強(qiáng)抗肝癌作用[14]。細(xì)胞自噬的分子機(jī)制十分復(fù)雜[15]。在自噬過程中LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬發(fā)生的標(biāo)志物。腫瘤細(xì)胞中LC3被處理后可產(chǎn)生胞漿LC3-Ⅰ, 經(jīng)過類泛素化修飾并與自噬體上的磷脂酰乙醇胺進(jìn)行共價(jià)結(jié)合形成LC3-Ⅱ[16]。Beclin-1是一種成熟的核心哺乳動(dòng)物自噬蛋白，是自噬體形成所必需的關(guān)鍵基因[17]。越來越多的證據(jù)揭示自噬在人類疾病的許多病理生理過程中的重要作用，包括神經(jīng)退行性疾病，炎癥[18]，癌癥[19]等。

樺木酸是一種作用廣泛的天然化合物，可通過抑制硬脂酰CoA去飽和酶(SCD-1)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]，具有抗腫瘤藥物潛力。本研究通過qRT-PCR和Western blot 進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測(cè)，證明隨著樺木酸濃度增加，Beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)量也增加，而且樺木酸濃度為30 mg/L時(shí)表達(dá)量最高，Beclin-1和LC3-Ⅱ 蛋白表達(dá)量也增加，樺木酸濃度為30 mg/L時(shí)表達(dá)量最高，但LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量減少，樺木酸濃度為30 mg/L時(shí)表達(dá)量最低。

綜上所述, 樺木酸通過上調(diào)人胃癌MGC-803細(xì)胞LC3、Beclin-1基因mRNA的表達(dá)，上調(diào)人胃癌MGC-803細(xì)胞Beclin-1，LC3-Ⅱ基因蛋白的表達(dá)，下調(diào)LC3-Ⅰ蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞發(fā)生自噬。