郭文琴 楊丹

摘要：目的：比較鹽酸氯丙嗓注射液的無菌檢查方法，采用直接接種法和薄膜過濾法，進(jìn)行無菌檢查。結(jié)果：直接接枝法更易受污染，控制周期更長(zhǎng)，薄膜過濾法更短，效率更高。結(jié)論：薄膜過濾法更容易操作，污染更小，壽命短。

關(guān)鍵詞：鹽酸氯丙嗓注射液;薄膜過濾法;無菌檢查

1 引言

根據(jù)2020版中國藥典規(guī)定，氯化物鹽酸鹽的滅菌監(jiān)測(cè)表明，鹽酸氯丙嗓注射液通過直接注射產(chǎn)生的一段時(shí)間，3天后會(huì)出現(xiàn)渾濁。3 天如果按照藥劑師的規(guī)則，它是需要更換種子或染色劑和顯微鏡后確認(rèn)結(jié)果。觀察明確的培養(yǎng)基，便于判斷測(cè)試結(jié)果，監(jiān)測(cè)周期短。作者比較了監(jiān)測(cè)兩種方法的效果，報(bào)告如下。《中國藥》2000年版規(guī)定注射劑的無菌檢查有直接接種法與薄膜過濾法。一般小容量注射劑采用直接接種法，大容量注射劑采用薄膜過濾法。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，抑菌劑的發(fā)展和一次性加熱系統(tǒng)（抑菌劑）的改進(jìn)，使得膜過濾器的操作更加容易，應(yīng)用也更加廣泛。本文以1%的地卡因注射劑和10%的普魯卡因注射劑為例，討論小劑量膜過濾的可能性，并與直接注射進(jìn)行比較。

2 儀器與試藥、菌株

HTY-2000智能細(xì)菌收集器和全放電細(xì)菌收集器（杭州醫(yī)療器械廠）。鹽酸氯丙嗓注射液無錫制藥廠，規(guī)格為2m。劑量為50mg，批號(hào)為0501020。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色梭狀芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉 LCMCC。液體容器硫乙醇酸鹽改變培養(yǎng)基軍事培養(yǎng)基，營養(yǎng)培養(yǎng)基增加培養(yǎng)基，鈉不透明培養(yǎng)基，營養(yǎng)培養(yǎng)基改良。沖洗液為氯化鈉蛋白陳緩沖液培養(yǎng)基，pH=7.0，按參考方法配制，高壓蒸汽滅菌。細(xì)菌收集器HTY-2000型Py 220型全封閉細(xì)菌提取器（杭州古鼎醫(yī)療設(shè)備有限公司）標(biāo)準(zhǔn)SW-Cy-IB衛(wèi)生座（100級(jí)蘇州周加工設(shè)備廠）MJ 160。MJ-160L型霉菌培養(yǎng)箱（上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司），PYX- DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市醫(yī)療器械批發(fā)部）。

注射用鹽酸100種（10米1/瓶）（我院生產(chǎn)批號(hào)：030103.030429.031029）氯化氫注射裝置100支（10毫升/瓶）（批號(hào)：30 30307.03 0513.國產(chǎn)）03103液體液液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。薄膜過濾法：取10瓶10%的過氧化氫，每批號(hào)注入10%，收集培養(yǎng)基。通過放置在防霉、防水培養(yǎng)箱中并在特定溫度下生長(zhǎng)的殺菌收集器，將每個(gè)100m1鹽酸普魯卡因注射液泵入各自的細(xì)菌收集器。每天，是否有細(xì)菌滋生。另取一管空容器，直接配制金黃色葡萄球菌 lmb 溶液作為陽性試驗(yàn)。直接注射法：按規(guī)定，取上述批號(hào)的10a鹽酸地卡因注射液、1000鹽酸普魯卡因注射液，用無菌注射器直接取樣，分別接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基管（需氧培養(yǎng)基管、厭氧培養(yǎng)基管）和霉菌培養(yǎng)基管中，并作陽性對(duì)照管（同“薄膜過濾法”）進(jìn)行培養(yǎng)、觀察和記錄。

3 方法與結(jié)果

3.1 試驗(yàn)菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物引入培養(yǎng)液中，30-35℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，用0.9%氯化鈉溶液溶解，得到兩位數(shù)的溶液，少計(jì)數(shù)的營養(yǎng)素，超過 100 攝氏度。將新鮮培養(yǎng)的氯化氯化藻放入液體巰基乙酸鹽中，30-35℃培養(yǎng)16-18h，使用0.9%醋酸氯溶液，氯化鈉溶液小于100cc/mL并在容器中計(jì)數(shù)。將新鮮培養(yǎng)的白色念珠菌加入改良馬提尼酒中，20-25℃放置48小時(shí)，使用0.將 9% 氯化鈉溶液稀釋至 100 cfu/ml 以下并用玫瑰珠計(jì)數(shù)。雙阿迪克鈉法）取新鮮培養(yǎng)的阿司匹林甘油加入改良的Martin Adaga梯度中，20-25℃培養(yǎng)7天，加入4ml 0.9%氯化鈉溶液，用氯化鈉溶液洗去氣泡。氯化物0.9%用小于 100 C/m2 的氯化鈉和雙馬丁等離子體。

3.2 培養(yǎng)基的靈敏度和無菌檢查

取 13 管巰基乙酸鹽，每管體積為 12 毫升，吸入 2 管金黃色葡萄球菌，培養(yǎng)3天，以每管9毫升的劑量服用9片馬丁片，并注射2片LBD bin和2片濃縮咖啡，每片小于100 cfu / ml。不是設(shè)計(jì)為不育控制的空控制器和 SD 培養(yǎng)。每天觀察結(jié)果，如果有細(xì)菌的培養(yǎng)基管生長(zhǎng)良好，空對(duì)照管生長(zhǎng)相同，則判斷培養(yǎng)基的敏感性和無菌性。

3.3 直接接種法

取供試品的H型管，用六種巰基乙酸鹽液制成供試品，其中一根注射管每米吸收50-100個(gè)葡萄球菌作為陽性試驗(yàn)。輕輕搖動(dòng)使供試品與培養(yǎng)基混合，將測(cè)試產(chǎn)品與容器混合。根據(jù)需要培養(yǎng) 14 天后，將適當(dāng)數(shù)量的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，以恢復(fù)細(xì)菌培養(yǎng)（2 天、3 天），并觀察結(jié)果，結(jié)果如表1所示。

3.4 薄膜過濾法

將待測(cè)樣品用少量洗滌液浸濕至濾膜，加入待測(cè)樣品至內(nèi)含一次性周圍細(xì)菌并排干。用流水沖洗，在 100 ml 試管中加入 100 ml 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基溶液。將 1 ml 金黃色葡萄球菌肉湯加入一個(gè)管中，然后將 100 ml 真菌培養(yǎng)基加入另一個(gè)在 30-35 度下孵育的管中。真菌在20-25°C的溫度下生長(zhǎng)，14天后觀察結(jié)果，在此期間每天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)。取渦輪培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入惰性液后，出現(xiàn)湍流，染色及鏡檢結(jié)果為無菌。分子過濾法 膜過濾法2個(gè)品種一次3次，共6個(gè)樣品在規(guī)定條件下培養(yǎng)7天，每天無細(xì)菌生長(zhǎng)。陽性試管為（+），符合要求，應(yīng)為無菌檢查合格。

3.5 口罩無菌檢測(cè)方法

在我國醫(yī)用口罩執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中，有GB19083-2010《醫(yī)用防護(hù)口罩技術(shù)要求》、YY0469-2011《醫(yī)用外科口罩》和YY/T0969-2013《一次性使用醫(yī)用口罩》。對(duì)此，需要理化指標(biāo)檢測(cè)儀器、環(huán)氧乙烷殘留檢測(cè)儀器及微生物指標(biāo)檢測(cè)儀器。在上述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)于微生物指標(biāo)檢測(cè)執(zhí)行GB/T15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄B–產(chǎn)品微生物檢測(cè)方法和GB/T14233.2-2005《 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法》第3章–無菌試驗(yàn)。

B1 ?產(chǎn)品采集與樣品處理于同一批 號(hào)的 二個(gè)運(yùn)輸包裝中至少抽取 12個(gè)蕞小銷售包裝樣品，1/4樣品用于檢測(cè)，1/4樣品用于留樣，另 1/2樣品（可就地封存）必要時(shí)用于復(fù)檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應(yīng)有破裂，檢驗(yàn)前不得啟開。在100級(jí)凈化條件下用無菌方法打開用于檢測(cè)的至少 3個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱取10g±1g樣品。剪碎后加人到200ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時(shí)，稀釋液量可按每次 50ml遞增，直至能吸出足夠測(cè)試用樣液。在計(jì)算細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)時(shí)相應(yīng)調(diào)整稀釋度。

B2 ?細(xì)菌菌落總數(shù)與初始污染菌檢測(cè)方法

本方法適用于產(chǎn)品初始污染菌與細(xì)菌菌落總數(shù)（以下統(tǒng)稱為細(xì)菌菌落總數(shù)）檢測(cè)。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計(jì)數(shù)。共接種 5個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加人 1ml樣液，然后用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 15～20ml倒人每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻 。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置 35℃±2℃培養(yǎng) 48h后，計(jì)算平板上的菌落數(shù)。

B2.2 結(jié)果報(bào)告

菌落呈片狀生長(zhǎng)的平板不宜采用;計(jì)數(shù)符合要求的平板上的菌落，按式（B1）計(jì)算結(jié)果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–細(xì)菌菌落總數(shù) cfu/g或cfu/mL;

A——5塊營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌菌落總數(shù);

K——稀釋度。

當(dāng)菌落數(shù)在 100以內(nèi)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于 100時(shí)采用二位有效數(shù)字。

如果樣品菌落總數(shù)超過本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，按 B2.3進(jìn)行復(fù)檢和結(jié)果報(bào)告。

B2.3 復(fù)檢方法

將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測(cè) 2次，2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，則判定被檢樣品合格;其中有任何 1次結(jié)果平均值超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判定被檢樣品不合格。

B3 ?大腸菌群檢測(cè)方法

B3.1 操作步驟

取樣液 5ml接種 50ml，乳糖膽鹽發(fā)酵管，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為大腸菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng) 18～24h，觀察平板上菌落形態(tài)。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個(gè)作革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)醉管，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h，觀察產(chǎn)氣情況。

B3.2 結(jié)果報(bào)告

凡乳糖膽鹽發(fā)酵骨產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，可報(bào)告被檢樣品檢出大腸桿菌。

B4 ?綠膿桿菌檢測(cè)方法

B4.1 操作步驟

取樣液 5ml，加人到50ml SCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置 35℃±2℃培養(yǎng) 18～24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液農(nóng)面呈現(xiàn)一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷三甲基溴化胺瓊脂平板，置 35℃±2℃ 培養(yǎng) 18～24h，觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其他菌不長(zhǎng)。

取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：

氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基對(duì)苯二胺試液，30s內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗(yàn)陽性，不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗(yàn)：取2-3個(gè)可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面，35℃±2℃培養(yǎng)24h，加入 3～5ml，充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈藍(lán)色時(shí)，用吸管移到另一試管中并加人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。

3.6 直接接種法

用上述條件下的6份檢品，經(jīng)過7天的培養(yǎng)和觀察，栽培品種的栽培品種沒有生長(zhǎng)。研究薄膜過濾法，分析是否符合規(guī)定，應(yīng)足以控制無菌檢查合格。

4 結(jié)論

由表1可以看出，對(duì)同一試品采用直接接種法控制周期延長(zhǎng)，采用膜過濾法縮短了控制周期并進(jìn)行了優(yōu)化。有的試品與培養(yǎng)基混合后會(huì)出現(xiàn)混亂，影響結(jié)果的判斷。薄膜過濾法可以克服直接嫁接法栽培延遲的缺點(diǎn)，特別是換種時(shí)缺乏增加污染的機(jī)會(huì)，本實(shí)驗(yàn)證明，小容量注射劑也可以采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查。

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