肖 勇，閔曉俊，邵嘉楷，高章遠(yuǎn)致，馮心苑

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院甲狀腺疾病診療中心，湖北 武漢 430061)

糖尿病發(fā)病率逐年增高，糖尿病足的發(fā)病率也明顯增加，并發(fā)糖尿病足潰瘍患者死亡率達(dá)11%，因糖尿病足而截肢的患者死亡率也高達(dá)22%，糖尿病足已經(jīng)成為糖尿病患者致死和致殘的主要原因之一[1]。但目前糖尿病足的發(fā)病原因尚不明確，其治療手段也較為單一，整體治療原則仍然是以預(yù)防為主[2-6]。

中醫(yī)在治療糖尿病足的長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中取得了不錯(cuò)的臨床療效，其強(qiáng)調(diào)整體辨證與局部辨證相結(jié)合、辨病與辨證相結(jié)合，運(yùn)用中藥多活性成分的特點(diǎn)，通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療作用[7]，其中傳統(tǒng)中藥穿山龍具有祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血止痛的作用，各醫(yī)家在運(yùn)用其治療風(fēng)濕痹證、四肢麻木、血脈瘀滯等方面有較好的療效與經(jīng)驗(yàn)[8-11]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)了穿山龍部分活性成分具有治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用[12-17]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科基礎(chǔ)與研究手段綜合的結(jié)果，能夠系統(tǒng)反映藥物多成分對(duì)疾病的干預(yù)機(jī)制。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)，從整體角度分析穿山龍治療糖尿病足的分子機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 穿山龍化學(xué)成分獲取

以“穿山龍、穿山薯蕷”為關(guān)鍵詞，分別在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)、臺(tái)灣中醫(yī)藥資料(TCM Database@taiwan)、中醫(yī)簡(jiǎn)化綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSID)，并參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)穿山龍的化學(xué)成分進(jìn)行搜集補(bǔ)充。將獲得的成分進(jìn)行命名規(guī)范除重并逐一輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得這些成分的分子結(jié)構(gòu)，以*.mol的格式儲(chǔ)存。

1.2 主要活性化合物篩選

基于Swiss ADME平臺(tái)預(yù)測(cè)穿山龍化學(xué)成分的吸收度和類藥性相關(guān)參數(shù)，將獲得的*.sdf格式文件上傳至Swisss ADME(http：//www.swissadme.ch/)平臺(tái)，通過篩選得到穿山龍的活性成分。

1.3 主要活性化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將篩選的活性成分的*.sdf格式文件導(dǎo)入Swiss Target Predition(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平臺(tái)，設(shè)置屬性為“Homo sapoens”，搜集預(yù)測(cè)到的所有靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行除重。根據(jù)靶點(diǎn)實(shí)際目標(biāo)的“Probility值”進(jìn)行排名，選取中位數(shù)以上的靶點(diǎn)作為活性化合物靶點(diǎn)。

1.4 糖尿病足相關(guān)靶點(diǎn)搜集

以“diabetic foot”“diabetic foot disease”為關(guān)鍵詞在Gene Card數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.genecards.org)檢索與糖尿病足相關(guān)的靶點(diǎn)。并通過OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//bidd.nus.sg/group/cjttd)尋找糖尿病足相關(guān)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病關(guān)系密切。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，若靶點(diǎn)過多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為糖尿病足潛在靶點(diǎn)，合并4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)并刪除重復(fù)值，得到糖尿病足潛在靶點(diǎn)。應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范化。通過R語(yǔ)言將藥物活性靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到藥物-疾病交集靶點(diǎn)。

1.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將獲得的藥物-疾病交集靶點(diǎn)與藥物活性成分作用靶點(diǎn)相匹配，得到藥物作用于疾病靶點(diǎn)的具體活性成分，并構(gòu)建穿山龍治療糖尿病足的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺(tái)(http：//string-db.org/)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為“Highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.8.1中的MCODE插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊，并通過分析其參與的生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其功能進(jìn)行描述。

1.7 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//Metascape.org)，設(shè)置物種為人類，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)進(jìn)行GO分析，并進(jìn)行KEGG通路富集(P<0.05)，并將獲得的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 穿山龍治療糖尿病足的活性成分篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)[18]、臺(tái)灣中醫(yī)藥資料(TCM Database@taiwan)[19]、中醫(yī)簡(jiǎn)化綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSID)和文獻(xiàn)檢索相關(guān)文獻(xiàn)[20-22]的方式，搜集到107種化學(xué)成分，將得到的所有化學(xué)成分進(jìn)行除重規(guī)范并逐一輸入Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢索到有明確結(jié)構(gòu)的活性成分69種，并將獲得活性成分以*.sdf格式文件儲(chǔ)存。

將獲得的*.sdf格式文件導(dǎo)入Swiss ADME平臺(tái)[23]，設(shè)定胃腸吸收結(jié)果為“High”作為藥物可以被吸收的條件，用于篩選具有較好的口服生物利用度的活性化合物；其次，設(shè)定Druglikeness 5種類藥性預(yù)測(cè)(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)結(jié)果中有2個(gè)及2個(gè)以上為“Yes”的化合物為活性化合物，共得到滿足條件的活性化合物30個(gè)。見表1。

2.2 穿山龍主要活性化合物潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將滿足條件的30個(gè)穿山龍活性化合物結(jié)構(gòu)的*.sdf格式文件導(dǎo)入到Swiss Target Prediction[24]平臺(tái)預(yù)測(cè)到潛在相關(guān)靶點(diǎn)1 115個(gè)。根據(jù)靶點(diǎn)實(shí)際目標(biāo)的“Probility值”進(jìn)行排名，選取中位數(shù)以上的靶點(diǎn)作為活性化合物靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)889個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)獲得457個(gè)。

表1 穿山龍化學(xué)成分及ADME篩選結(jié)果

續(xù)表1

2.3 糖尿病足相關(guān)靶點(diǎn)獲取

通過Gene Card數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，再結(jié)合OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，得到相關(guān)靶點(diǎn)4 553個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為糖尿病足相關(guān)靶點(diǎn)，靶點(diǎn)最大值為108.61，最小值為0.17，中位數(shù)為3.51，故設(shè)定Score>3.51的靶點(diǎn)為糖尿病足的潛在靶點(diǎn)，最終得到相關(guān)靶點(diǎn)2 284個(gè)。

2.4 穿山龍治療糖尿病足的主要成分及靶點(diǎn)分析

將篩選的穿山龍活性成分靶點(diǎn)與糖尿病足疾病靶點(diǎn)取交集，并通過R語(yǔ)言繪制韋恩圖，得到穿山龍成分-糖尿病足疾病共同靶點(diǎn)194個(gè)，見圖1。因穿山龍的30個(gè)主要活性成分中的Epistephanine、Deoxyvasicinone、Benzoic acid、Cyclo-(Ser-Tyr)、Betaine、Mono-p-coumaroyl glyceride、Monocrotaline、Norvaline、2-tridecanone活性成分作用靶點(diǎn)與糖尿病足疾病靶點(diǎn)無交集，故將其舍棄。共得到穿山龍治療糖尿病足活性成分21個(gè)，其中成分5-(1-hydroxyethyl)-2，8-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene作用于糖尿病足的靶點(diǎn)最多有55個(gè)，其余依次為Cyclo-(Leu-Tyr)有52個(gè)靶點(diǎn)；1-hydroxyethyl)-2，6-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene有51個(gè)靶點(diǎn)；Juncusol有46個(gè)靶點(diǎn)；Episarsasapogenin有42個(gè)靶點(diǎn)；(2s)-5-methoxy flavan-7-ol有40個(gè)靶點(diǎn)。穿山龍治療糖尿病足的成分中作用于靶點(diǎn)CDK1、ESR1的活性化合物最多各有10個(gè)，其余靶點(diǎn)依次為GSK3B、HSD11B1、ESR2各有9個(gè)，GABRB3有8個(gè)，CCNA2、MMP2、AR、SLC6A3各有7個(gè)，將以上藥物、成分、共同靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到每個(gè)成分作用的多個(gè)靶點(diǎn)數(shù)、每個(gè)靶點(diǎn)作用的多個(gè)成分?jǐn)?shù)值，制成Network文件及Type文件，將得到的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件繪制藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖2。圖2中以藥物、成分、靶點(diǎn)為3類節(jié)點(diǎn)(Node)，他們之間的相互關(guān)系分別用邊(Edge)相連，節(jié)點(diǎn)的Degree值越大，則節(jié)點(diǎn)的大小越大、顏色越深，圖中圓形代表藥物及成分，三角形代表作用靶點(diǎn)通路。其主要成分編號(hào)、名稱及作用靶點(diǎn)數(shù)見表2，其主要靶點(diǎn)名稱、Uniprot ID、被作用的成分頻次見表3。

圖1 穿山龍-糖尿病足靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 穿山龍治療糖尿病足的主要成分及靶點(diǎn)頻次

2.5 穿山龍成分-糖尿病足靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將成分-糖尿病足共同靶點(diǎn)提交至STRING 11.0平臺(tái)，選擇物種為人類，設(shè)置度值(Dgree)>0.9，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，得到穿山龍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。由于獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)的作用是相互的，所以通常是無向圖。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1中，運(yùn)用其中的MCODE插件，通過分子復(fù)合物檢測(cè)算法對(duì)互相作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)中更具有生物學(xué)意義的子網(wǎng)即Module，見圖4。

2.6 GO生物功能注釋即KEGG通路富集分析

應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)穿山龍治療糖尿病足相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG等生物通路富集分析，并借助Bioinformatics平臺(tái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。GO富集分析共得到3 006個(gè)條目，其中BP 2 637個(gè)條目，CC 157個(gè)條目，MF 212個(gè)條目；KEGG富集分析得到350個(gè)條目。根據(jù)P值選取前20個(gè)條目進(jìn)行可視化分析，通路富集結(jié)果見圖5。

表3 靶點(diǎn)、Uniprot ID及被作用頻次

圖3 穿山龍-糖尿病足靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的Module

圖5 穿山龍主要成分潛在靶點(diǎn)富集分析

2.7 穿山龍成分-糖尿病足靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.8.1構(gòu)建穿山龍成分-糖尿病足靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖6。通過Cytoscape 3.8.1中的Network Analyzer功能分析穿山龍治療糖尿病足網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心靶點(diǎn)。

圖6 穿山龍-糖尿病足靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

目前糖尿病足病的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，研究認(rèn)為此病的發(fā)生可能與多元醇和肌醇的代謝異常、氧自由基的形成、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙、軸突運(yùn)輸缺陷及非神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酶促糖基化相關(guān)[25]。糖尿病足的治療主要包括控制血糖、控制血壓、降低血脂、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善循環(huán)、抗氧化應(yīng)激、抗炎鎮(zhèn)痛等方式[26]，但這些治療手段缺乏特異性。穿山龍可以通過改善胰島素抵抗、增強(qiáng)胰島素敏感性而發(fā)揮降血糖作用[27]，并且其所含的薯蕷皂苷成分還可以通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的相關(guān)靶點(diǎn)來改善糖尿病并發(fā)癥[28]。穿山龍所含的薯蕷皂苷可以通過改善糖尿病大鼠血清中致痛物質(zhì)HA和5-HT的表達(dá)以減輕疼痛[29]，也可以抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路來降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和炎性反應(yīng)[30]。本研究對(duì)穿山龍作用于糖尿病足的相關(guān)活性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 5-(1-hydroxyethyl)-2，8-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene(D21)、cyclo-(Leu-Tyr)(D13)、1-hydroxyethyl)-2，6-dihydroxy-1，7-dimethyl-9，10-dihydrophenanthrene(D20)、juncusol(D24)、episarsasapogenin(D9)等對(duì)應(yīng)的糖尿病足的相關(guān)靶點(diǎn)最多，說明該成分可能是穿山龍治療糖尿病足的重要成分，可以為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

在穿山龍成分-糖尿病足蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，隱藏游離節(jié)點(diǎn)后共得到節(jié)點(diǎn)(Node)166個(gè)，邊(Edge)818條，其中排名前5的蛋白包括PIK3CA、SRC、SHC1、STAT3、HRAS等，有研究表明PIK3CA的上調(diào)可能與糖尿病性心臟病的發(fā)生有關(guān)，通過失活PI3K/Akt信號(hào)通路靶向PIK3CA蛋白可能對(duì)糖尿病并發(fā)癥中的心臟起保護(hù)作用[31]。并且JAK2/STAT3/SOCS軸可以通過介導(dǎo)與血管內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞相關(guān)的炎癥而促進(jìn)糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)生[32]，因此穿山龍治療糖尿病足的機(jī)制可能與以上蛋白通路相關(guān)。

由GO富集結(jié)果可知其中穿山龍參與的主要生物過程(BP)包括MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、血液循環(huán)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)等；主要細(xì)胞組成(CC)為受體復(fù)合物、細(xì)胞器外膜、溶泡、內(nèi)吞小泡等；主要分子功能(MF)包括蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、核受體活性、胰島素受體底物結(jié)合、熱激蛋白結(jié)合等功能；KEGG信號(hào)通路包括Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、胰島素抵抗等。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1作為PI3K-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵下游蛋白，在缺氧條件下，HIF-1水平迅速增加，此外，PI3K-Akt還可以減少糖原的合成并增加糖酵解[33]，穿山龍可以通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路改善糖尿病足遠(yuǎn)端血液循環(huán)及營(yíng)養(yǎng)障礙。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出穿山龍治療糖尿病足的可能機(jī)制是中藥穿山龍通過作用于CDK1、ESR1、GSK3B、HSD11B1、ESR2和GABRB3等相關(guān)靶點(diǎn)，通過Rap1 signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Endocrine resistance、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、ErbB signaling pathway等相關(guān)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、改善胰島素抵抗、降低血糖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用，從而達(dá)到治療糖尿病足的目的。本研究結(jié)果可以為穿山龍治療糖尿病足有效成分的研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。