扶正治癃顆粒提取、成型工藝的優(yōu)化

馬轉(zhuǎn)霞， 孫嵐萍， 顧志榮， 馬天翔， 呂 鑫， 許愛霞， 葛 斌

(1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

扶正治癃方由黃芪、熟地、肉蓯蓉3味中藥組成，是甘肅省人民醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，具有補氣溫腎、補血養(yǎng)陰、補腎潤燥等功效，常用于治療前列腺增生等疾病。方中君以黃芪補氣升陽、益氣溫腎、調(diào)節(jié)氣血；臣以熟地填精益髓、補血養(yǎng)陰，肉蓯蓉補腎、益精、潤燥。全方以補腎為主，氣血陰陽統(tǒng)調(diào)，標本兼治。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪利尿機制為競爭性抑制Na+-K+-ATP酶活力，且黃芪皂苷可促進膀胱逼尿肌的收縮，緩解尿道內(nèi)口括約肌緊張度，減輕前列腺增生排尿無力、排尿困難的癥狀[1]。熟地、肉蓯蓉均含有黃酮、多糖、生物堿等多種化學成分，具有抑菌、抗炎、提高機體免疫的生物活性，可保護前列腺免遭細菌和其他病原微生物侵襲，解除尿路炎性梗阻，改善局部癥狀。

中醫(yī)常將前列腺增生歸為“癃閉”“淋證”等范疇，其發(fā)病基礎為年老體衰、腎氣虧虛，基本病理因素為瘀血、痰濁、濕熱，常見發(fā)病條件為勞力過度、情志刺激、外感六淫、飲食不節(jié)等[2]。中藥及復方制劑治療該類疾病具有療效確切、整體調(diào)節(jié)、毒副作用小、適合長期服用等諸多明顯優(yōu)勢[3]。故擬將原湯劑制備成便于服用、攜帶與貯存的顆粒劑，以解決傳統(tǒng)湯劑煎煮費時、繁瑣，且藥液味苦量大等問題。本研究采用正交試驗、均勻設計優(yōu)化提取及成型工藝，為扶正治癃顆粒的開發(fā)研究提供技術資料。

1 材料

1.1 儀器 LC-16型高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV8100A型紫外-可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；BSA4202S-CW型電子天平(百萬分之一，德國賽多利斯公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(西安超杰儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DD-5M型低速大容量離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；YC-1000型實驗室噴霧制粒包衣機(上海雅程儀器設備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芪(批號180606)、熟地(批號180602)、肉蓯蓉(批號180201)均購于甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學李碩副教授鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典》一部相關規(guī)定。5-羥甲基糠醛(批號CHB171016)、松果菊苷(批號CHB170302)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號CHB171102)、毛蕊花糖苷(批號CHB171103)、D-無水葡萄糖(批號CHB180115)、蘆丁(批號CHB170303)對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。預膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素均為藥用規(guī)格。甲醇、甲酸為色譜純(天津大茂化學試劑廠)；其他試劑均為分析純(天津大茂化學試劑廠)；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 HPLC法測定4種成分含量

2.1.1.1 對照品溶液制備 精密稱取5-羥甲基糠醛、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷對照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，定容至25 mL，即得(四者質(zhì)量濃度分別為0.10、4.40、0.19、0.53 mg/mL)。

2.1.1.2 供試品溶液制備 取水煎液10 mL，置于100 mL具塞三角瓶中，精密加入15 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率500 W、頻率40 kHz、溫度20 ℃)處理60 min，提取液冷卻至室溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取上清液，溶劑回收至干，殘渣加純化水溶解，轉(zhuǎn)移至 25 mL量瓶中，純化水洗滌并定容至刻度，即得。

2.1.1.3 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～30 min，8%～62%A；30～32 min，62%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長290 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.5-羥甲基糠醛 2.松果菊苷 3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 4. 毛蕊花糖苷

2.1.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1.1”項下對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，各取10 μL，在“2.1.1.3”項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.1.1.5 方法學考察 選擇正交1號水煎液，按照2015年版《中國藥典》四部指導原則進行精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率試驗，測得RSD均小于1.88%，各成分平均加樣回收率在99.39%～102.26%之間，表明儀器精密度、方法重復性良好，水煎液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2 總多糖含量測定

2.1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取5.00 mgD-無水葡萄糖對照品，置于50 mL量瓶中，純化水振搖溶解，定容至刻度，即得。

2.1.2.2 供試品溶液制備 取1 mL水煎液至離心管中，加入無水乙醇適量，邊加邊攪拌，使其體積分數(shù)高于80%，放置過夜，濾過，殘渣加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，純化水定容，即得。

2.1.2.3 吸光度測定 取對照品溶液、供試品溶液、純化水(空白對照溶液)各1 mL，參照文獻[4]中總多糖含量的檢測方法，在486 nm波長處測定吸光度A。

2.1.2.4 線性關系考察 精密稱取D-無水葡萄糖對照品溶液2、3、4、5、6、7、8、9 mL，置于10 mL量瓶中，純化水定容至刻度，按“2.1.2.3”項下方法測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=63.184 0X-0.004 1(r=0.999 3)，在0.020 0～0.090 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.2.5 方法學考察 選擇正交1號水煎液，按照2015年版《中國藥典》四部指導原則進行精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率試驗，測得RSD均小于2.00%，平均加樣回收率為101.39%，表明儀器精密度、方法重復性良好，水煎液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 總黃酮含量測定

2.1.3.1 對照品溶液制備 精密取蘆丁對照品10.00 mg至50 mL量瓶中，60%乙醇溶解并定容至刻度，即得。

2.1.3.2 供試品溶液制備 取4 mL水煎液至50 mL三角瓶中，沿壁緩緩加無水乙醇，邊加邊振搖，待沉淀完全后過濾，取上清液，定容至刻度，即得。

2.1.3.3 吸光度測定 同“2.1.2.3”項，參照文獻[4]中總黃酮含量的檢測方法，在510 nm波長處測定吸光度A。

2.1.3.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2、3、4、5、6、7、8、9 mL，置于25 mL量瓶中，純化水定容至刻度，按“2.1.3.3”項下方法測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=11.939 0X-0.058 8(r=0.999 5)，在0.016 5～0.074 2 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3.5 方法學考察 選擇正交1號水煎液，按照2015年版《中國藥典》四部指導原則進行精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率試驗，測得RSD均小于1.94%，平均加樣回收率為99.62%，表明儀器精密度、方法重復性良好，水煎液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 干浸膏得率測定 取水煎液20 mL，置于已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，95 ℃水浴蒸干后于105 ℃烘箱中干燥3 h，蒸發(fā)皿轉(zhuǎn)移至干燥器內(nèi)，待其冷卻至室溫后稱定質(zhì)量，計算干浸膏得率，公式為干浸膏得率=(干浸膏質(zhì)量/藥材總質(zhì)量)×100%。

2.1.5 正交試驗 依照處方配比稱取相應中藥飲片，選擇煎煮時間(A)、加水量(B)、煎煮次數(shù)(C)作為影響因素，5-羥甲基糠醛(X1)、松果菊苷(X2)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(X3)、毛蕊花糖苷(X4)、總多糖(X5)、總黃酮(X6)含量及干浸膏得率(X7)作為評價指標，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝[5]。因素水平見表2。

表2 提取工藝因素水平

2.1.6 數(shù)據(jù)處理 采用信息熵理論[6]確定各評價指標的權重系數(shù)，首先建立原始評價指標矩陣X，將其轉(zhuǎn)換為概率矩陣P，計算各指標的信息熵(Hi)(Hi=[0.971 4 0.929 4 0.973 7 0.948 3 0.500 5 0.960 1 0.988 1])、i項指標的系數(shù)Wi(Wi=[0.039 3 0.096 8 0.036 1 0.070 9 0.685 9 0.054 8 0.016 3])，根據(jù)公式M=X1m×W1+X2m×W2+X3m×W3+…+Xnm×Wn計算綜合評分M，結果見表3，方差分析見表4。由表3可知，各因素影響程度依次為C>A>B，即煎煮次數(shù)>煎煮時間>加水量；由表4可知，因素A、C有顯著影響(P<0.05)，而B無顯著影響(P>0.05)；各因素較高水平組合理論上為A3B3C3，結合生產(chǎn)成本考慮，最終確定為A3B3C2，即加10倍量水煎煮2次，每次2 h。

表3 正交試驗設計與結果

表4 方差分析

2.1.7 驗證試驗 按處方配比稱取相應中藥飲片3份，按“2.1.6”項下優(yōu)化工藝進行驗證試驗，結果見表5。由此可知，3批樣品綜合評分及各指標成分得率的RSD均小于3.00%，表明該工藝穩(wěn)定可行，可用于扶正治癃方的工業(yè)化提取。

表5 提取工藝驗證試驗結果(n=3)

2.2 成型工藝優(yōu)化

2.2.1 顆粒制備 按處方量稱取相應中藥飲片，按“2.1.6”項下優(yōu)化工藝制備水煎液，濃縮，噴霧干燥后制得干燥恒重的浸膏粉。取相應比例的浸膏粉與輔料混合，因前者黏性較大，故以95%乙醇為潤濕劑制軟材(“握之成團，觸之即散”)，過20目篩，濕法制粒，在60 ℃烘箱中烘干整粒，即得。

2.2.2 指標測定

2.2.2.1 吸濕率 取顆粒2 g，置于已干燥恒重的扁形稱量瓶中，輕搖使顆粒均勻分布于稱量瓶底部，敞口放入盛有NaCl過飽和溶液的干燥器內(nèi)，干燥器密封，48 h后取出稱定質(zhì)量，計算吸濕率[7]，公式為吸濕率=[(吸濕后顆粒質(zhì)量-吸濕前顆粒質(zhì)量)/吸濕前顆粒質(zhì)量]×100%。

2.2.2.2 成型率 取過1號篩而不過5號篩的合格顆粒，稱定質(zhì)量，計算成型率[8]，公式為成型率=(合格顆粒質(zhì)量/顆?？傎|(zhì)量)×100%。

2.2.2.3 溶化率 取顆粒1 g，置于已干燥至恒重的50 mL離心管中，加入100 ℃沸水20 mL，攪拌并振搖5 min，離心，棄去上清液，殘渣置于80 ℃下烘干至恒重，稱定質(zhì)量，計算溶化率[9]，公式為溶化率=(溶化的顆粒質(zhì)量/顆粒總質(zhì)量)×100%。

2.2.2.4 休止角 將3個漏斗串聯(lián)固定在鐵架臺上，鐵架臺置于坐標紙上，保持最底端的漏斗口距坐標紙1 cm(H)，將顆粒沿壁倒入最頂端漏斗口中，待坐標紙上顆粒椎體頂端觸及最底端漏斗下沿時停止，記錄顆粒錐體底部直徑為2R，計算休止角α[10]，公式為α=arctanH/R。

2.2.2.5 堆密度 將顆粒放入已干燥恒重的量筒中，反復振蕩，記錄體積，稱定顆粒質(zhì)量，計算堆密度[10]，公式為堆密度=顆粒質(zhì)量/顆粒體積。

2.2.3 輔料篩選 對預膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素進行篩選，設定浸膏粉與輔料比例為1∶1，潤濕劑(95%乙醇)用量0.35倍，按“2.2.1”項下方法制備顆粒，測定其吸濕率、成型率、溶化率，結果見表6。由此可知，預膠化淀粉成型率及麥芽糊精吸濕率、溶化率明顯優(yōu)于其他輔料，綜合考慮，選用預膠化淀粉與麥芽糊精作為輔料[11]。

2.2.4 均勻設計 選擇浸膏粉與輔料比例(A)、95%乙醇用量(B)、預膠化淀粉與麥芽糊精比例(C)作為影響因素，吸濕率(X1)、成型率(X2)、溶化率(X3)、休止角(X4)、堆密度(X5)作為評價指標，G1-熵權法確定權重系數(shù)，計算綜合評分(Y)，采用均勻設計優(yōu)化成型工藝[12-13]，因素水平見表7。

表7 成型工藝因素水平

表8 評價指標權重值

表9 均勻設計結果

2.2.6 工藝驗證 按“2.2.5”項下優(yōu)化的成型工藝制備3批顆粒，測定吸濕率、成型率、溶化率、休止角、堆密度，計算綜合評分，結果見表10。由此可知，顆粒平均綜合評分高于表9最高值93.715 2分，而且各指標RSD均<3.00%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表10 成型工藝驗證試驗結果(n=3)

2.2.7 臨界相對濕度測定 在棕色干燥器內(nèi)配置7種鹽(CH3COOK、MgCl2、K2CO3、NaBr、NaCl、KCl、K2SO4)的過飽和溶液，放置48 h。取顆粒2 g，置于已干燥恒重的扁形稱量瓶中，輕搖使其均勻分布在稱量瓶底部，敞口放在盛有不同鹽過飽和溶液的干燥器中，放置48 h后稱定質(zhì)量，計算吸濕率[16]，結果見表11。以相對濕度為橫坐標(X)，吸濕率為縱坐標(Y)繪制曲線，在曲線前后拐點處做切線，結果見圖2，可知前、后拐點處切線方程分別為Y=0.073 4X+0.955 4、Y=0.502 6X-26.447 4，兩切線交點所對應的橫坐標為臨界相對濕度(CRH)，其數(shù)值為63.85%。

表11 顆粒吸濕率測定結果

圖2 顆粒吸濕曲線

3 討論

中藥治療過程中“多靶點、多途徑”的特點與所含的多種化學成分密不可分，因此評價指標的選擇是中藥提取工藝研究中十分重要的環(huán)節(jié)[17]。本研究所選的7種評價指標，不僅包含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷等對前列腺增生有明確治療作用的單體成分[18]，又有總黃酮、總多糖等有效部位，可較全面地評價所選工藝參數(shù)的優(yōu)劣。

因扶正治癃方中含熟地、肉蓯蓉兩味中藥，故黏性大，吸濕性大，流動性差，在制成顆粒時需加入合適的潤濕劑與輔料。預實驗發(fā)現(xiàn)，當潤濕劑乙醇濃度為95%時，顆粒成型性好。微晶纖維素和甘露醇作為填充劑時，所得顆粒松散、硬度不夠。麥芽糊精和預膠化淀粉價格低廉、口感滑膩、具有流動性好，溶解性能好，不易吸潮等特點。兩者結合使用可以很好的降低顆粒吸濕性，提高成型性與溶化性。

權重系數(shù)是中藥多指標評價時必須考慮的問題之一。目前應用較多的是主觀賦權法[19]，這類方法雖在一定程度上體現(xiàn)了中藥復方的配伍規(guī)律，但主觀性較強，常忽略實際樣本的數(shù)據(jù)信息特點。近年來，信息熵理論加權法、G1-熵權法、AHP-CRITIC混合加權法等在工藝優(yōu)化中逐漸得到廣泛應用。該類方法簡單易行、結果精確，避免了人為確定權重的隨意性和不確定性，使實驗結果更加可靠、科學。