香鱗毛蕨有效部位乳膏體內(nèi)外抗須癬毛癬菌作用的評(píng)價(jià)

張祉思， 侯 捷， 唐春萍， 沈志濱， 陳艷芬， 李小英， 丁 慎， 江 濤

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006；3.廣州市新藥篩選模型系統(tǒng)建設(shè)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；4.廣東省局部精確給藥系統(tǒng)工程中心，廣東 廣州 510006)

皮膚癬菌是一種毛甲部霉菌，可造成角質(zhì)組織如毛發(fā)、皮膚和指(趾)甲感染即皮膚癬菌病[1]。全球約有10%-15%的人患有皮膚癬菌病[2]。目前治療皮膚癬菌病的藥物主要以化學(xué)藥物為主，但由于廣譜抗生素、免疫抑制劑等的大量應(yīng)用以及單一、過量使用化學(xué)合成的抗真菌藥物，使皮膚癬菌病發(fā)病率日趨升高和耐藥性出現(xiàn)問題[3]。

香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.) Schott為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，主要分布在我國東北地區(qū)，被廣泛用于治療多種皮膚病[4]，尤其對(duì)難治性手足癬效果顯著[5]。近年來國內(nèi)關(guān)于香鱗毛蕨的研究多集中在抗真菌活性成分篩選[6-8]，但香鱗毛蕨抗淺部真菌作用及有效部位仍不十分明確。為此，本課題組前期對(duì)香鱗毛蕨有效部位抗淺部真菌的作用及其成分進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明香鱗毛蕨對(duì)紅色毛癬菌有較好的體外抗菌作用[9]，對(duì)犬小孢子菌、糠秕馬拉色菌具有體內(nèi)外抗菌作用[10-12]，香鱗毛蕨的主要活性成分為14種間苯三酚類衍生物[13]。轉(zhuǎn)錄組測序分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香鱗毛蕨乙醇提取物抗紅色毛癬菌作用機(jī)制具有多靶點(diǎn)性[14]。由于香鱗毛蕨有效部位對(duì)皮膚癬菌菌株的MIC存在菌株依賴性[13]，新的抗菌藥物抗菌譜篩選需通過對(duì)多株臨床分離菌株進(jìn)MIC測定[15]，目前香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)T.mentagrophytes的體內(nèi)外抗菌作用及有關(guān)機(jī)制報(bào)道甚少。因此，本研究選用多種方法評(píng)價(jià)香鱗毛蕨有效部位對(duì)多株T.mentagrophytes體外抗菌作用；采用T.mentagrophytes致豚鼠體癬模型觀察香鱗毛蕨有效部位乳膏的治療作用；通過測定生物量、超微結(jié)構(gòu)、β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶和角鯊烯環(huán)過氧化酶的活性探討香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes的抗菌作用機(jī)制，為香鱗毛蕨有效部位乳膏開發(fā)成新的抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 須癬毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株5株，編號(hào)分別為CMCC(F)T5a、 CMCC(F)T5b、CMCC(F)T5c、CMCC(F)T5d、CCMCC(F)T5f；須癬毛癬菌臨床分離菌株8株，編號(hào)分別為YAMA-812、YAMA-813、YAMA-814、YAMA-815、YAMA-816、YAMA-817、YAMA-818、YAMA-819；近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(編號(hào)ATCC 22019)1株，以上受試菌株均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(南京)。臨床菌株經(jīng)過 Wood’s 燈檢查和真菌培養(yǎng)等試驗(yàn)，鑒定為須癬毛癬菌[16]。

1.2 動(dòng)物 Hartley普通級(jí)豚鼠48只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2014-0035，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)溫度保持為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，預(yù)飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物與試劑 香鱗毛蕨購于黑龍江，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定為正品(批號(hào)XLMJ-20171007)。硝酸咪康唑(純度>99.2%，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20171201)；鹽酸特比萘芬(純度>98%,大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)M0726A)；鹽酸特比萘芬軟膏(北京諾華制藥有限公司，批號(hào)L03080A)；硝酸咪康唑軟膏(西安楊森制藥有限公司，批號(hào)110619098)；RPMI-1640 (美國Gibco公司，批號(hào)1786045)；青霉素(華北制藥股份有限公司，批號(hào)J3018403)；PDA(青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20170623)；GENMED角鯊烯環(huán)過氧化酶試劑盒(編號(hào)GMS50782.3)、β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶(編號(hào)GMS0279)均由上海杰美基因醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。

1.4 儀器 DHP-9032B電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；FA2004B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；H-7650透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；WX-80A微型渦旋震蕩儀(上海滬西分析儀器廠)。

2 方法

2.1 香鱗毛蕨有效部位體外抗T.mentagrophytes作用的研究

2.1.1 香鱗毛蕨有效部位的制備 參照文獻(xiàn)[9，13]，香鱗毛蕨藥材經(jīng)50%乙醇提取和工藝富集純化后制得浸膏，然后將制得浸膏配制成含生藥質(zhì)量濃度200 mg/mL的貯備液(按有效部位計(jì)為189 mg/mL)，經(jīng)HPLC-ESI-MS分析其主要物質(zhì)成分為間苯三酚類，見圖1，經(jīng)紫外分光光度法測定，總間苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58%。

圖1 香鱗毛蕨有效部位的ESI/MS(+)總離子流圖

2.1.2 菌懸液的制備 取T.mentagrophytes菌株，置于PDA試管斜面上接種，放入28 ℃溫箱中連續(xù)傳代2次得到實(shí)驗(yàn)菌株，然后采用接種環(huán)輕刮菌落放入研磨器，加入1 mL無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，研磨成菌懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基將菌懸液濃度調(diào)至1.0×106～6.0×106CFU/mL。

2.1.3 瓊脂擴(kuò)散法 取“2.1.2”項(xiàng)下菌液100 μL至含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布棒均勻地涂抹在培養(yǎng)基平板的表面。將含有香鱗毛蕨有效部位(生藥2 g/mL)、硝酸咪康唑(1 mg/mL)、鹽酸特比萘芬(20 μg/mL)的紙片放置于培養(yǎng)皿表面，設(shè)溶媒95%乙醇作陰性對(duì)照組。平板置于28 ℃培養(yǎng)7～10 d后用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.1.4 試管藥基法 將香鱗毛蕨有效部位儲(chǔ)備液等比稀釋成10個(gè)質(zhì)量濃度梯度，范圍為0.234～120 mg/mL；陽性藥物硝酸咪康唑配制10個(gè)質(zhì)量濃度梯度，范圍為0.02～10 μg/mL。參照文獻(xiàn)[9]方法配制含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置生長對(duì)照組與空白對(duì)照組。除空白對(duì)照管外，各試管分別加入1.0×106CFU/mL 菌懸液100 μL，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，讀取MIC值。將無菌落生長的含藥培養(yǎng)基加入已滅菌的液體培養(yǎng)基中，接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基表面，充分振蕩后倒入無菌試管，于 28 ℃孵育10 d，判讀MFC值。

2.1.5 微量液基稀釋法 將藥物經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基倍比稀釋成10個(gè)質(zhì)量濃度,香鱗毛蕨有效部位質(zhì)量濃度范圍為0.039 1～20 mg/mL，陽性藥硝酸咪康唑質(zhì)量濃度范圍為0.031 25～16 μg/mL，鹽酸特比萘芬質(zhì)量濃度范圍為0.003 9～2 μg/mL。利用M38-A2中的微量稀釋法[17]，35 ℃下培養(yǎng)4 d，以肉眼觀察96孔板中無菌生長的最小藥物稀釋質(zhì)量濃度作為MIC值。用近平滑念珠菌ATCC22019為質(zhì)控菌株，氟康唑?yàn)橘|(zhì)控菌的藥物，若MIC值為0.5～4 μg/mL，表明該方法可靠。從判讀后無T.mentagrophytes生長的孔中取100 μL液體，接種于PDA固體培養(yǎng)基，繼續(xù)次代培養(yǎng)14 d，觀察是否有真菌長出，判讀MFC值。

2.2 香鱗毛蕨有效部位乳膏體內(nèi)抗T.mentagrophytes作用的研究

2.2.1 香鱗毛蕨有效部位乳膏的制備 參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道，分別將香鱗毛蕨有效部位制備成生藥0.5 g/g乳膏(香鱗毛蕨有效部位低劑量)、生藥1 g/g乳膏(香鱗毛蕨有效部位中劑量)、生藥2 g/g乳膏(香鱗毛蕨有效部位高劑量)各100 g，封裝，室溫保存于陰涼干燥處。

2.2.2T.mentagrophytes致豚鼠感染模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[18]報(bào)道，選取雌雄各半的健康豚鼠56只，用脫毛膏背部脫毛形成4 cm×4 cm的無毛區(qū)域，24 h后，對(duì)脫毛區(qū)進(jìn)行消毒，用滅菌砂紙打磨脫毛區(qū)域皮膚直至點(diǎn)狀滲血，用注射器吸取0.1 mL菌液于滲血處，以無菌棉簽涂布均勻。接種6 d后，按以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行皮膚病變?cè)u(píng)分：沒有癥狀及無鱗屑為0分；少量淺紅色紅斑散布且有少量鱗屑為1分；大量深紅色紅斑且有大量鱗屑為2分；局部出現(xiàn)糜爛，皮膚破損且有大量鱗屑為3分，若觀察到的現(xiàn)象介于兩級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)之間，取中間分值。

(1) 微網(wǎng)運(yùn)行控制技術(shù) 與傳統(tǒng)的電力系統(tǒng)控制技術(shù)不同,微網(wǎng)側(cè)重并、離網(wǎng)控制技術(shù)(分布式電源控制技術(shù)有下垂控制技術(shù)、v/f控制技術(shù)、p/v控制技術(shù))。此外,微網(wǎng)整體運(yùn)行控制也是微網(wǎng)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和趨勢。

2.2.3 分組及給藥 成功造模后，按皮膚病變?cè)u(píng)分分值將豚鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組8只，即模型組、特比萘芬組、硝酸咪康唑組、香鱗毛蕨有效部位低、中、高劑量組，另設(shè)正常對(duì)照組，每日早晚各涂1次，每次涂藥量約為0.2 g/只，連續(xù)14 d。各組于給藥后第7、14天進(jìn)行皮損評(píng)分。

2.2.4 病原學(xué)和組織病理學(xué)觀察 每只豚鼠取少量鱗屑與毛發(fā)置于含雙抗的PDA培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為溫度 28 ℃，濕度85%，培養(yǎng)時(shí)間為7 d，觀察毛發(fā)附近培養(yǎng)基菌落生長狀態(tài)，若無生長，則記為陰性；若有生長，則記為陽性[12]，真菌轉(zhuǎn)陰率=(每組培養(yǎng)陰性數(shù)/每組感染豚鼠總數(shù))×100%。給藥14 d后處死各組豚鼠，取皮損處皮膚1.5 cm×1.5 cm，按常規(guī)方法制備病理切片，并進(jìn)行PAS、HE染色，觀察組織中的真菌菌絲及孢子數(shù)量和炎癥反應(yīng)。

2.3 香鱗毛蕨有效部位抗T.mentagrophytes作用機(jī)制研究

2.3.1 香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes生物量的影響 用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋香鱗毛蕨有效部位貯備液，使各藥物組終質(zhì)量濃度分別為香鱗毛蕨有效部位低劑量組、香鱗毛蕨有效部位高劑量組、硝酸咪康唑組和鹽酸特比萘芬組，以上藥物中溶劑的體積分?jǐn)?shù)控制在1%以下，同時(shí)設(shè)生長對(duì)照組。按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備須癬毛癬菌菌懸液，終濃度為1.0×105～3.0×105CFU/mL。將藥液與菌懸液混合于錐形瓶，密封后置于28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)96 h，取培養(yǎng)液以無菌濾紙過濾得濕菌絲，烘箱干燥后稱量干質(zhì)量。

2.3.2 香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes超微結(jié)構(gòu)的影響 設(shè)置空白生長對(duì)照組、香鱗毛蕨有效部位低劑量組、香鱗毛蕨有效部位中劑量組。按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備T.mentagrophytes菌懸液，取1 mL菌液加入6孔板，取1 mL，用RPMI-1640稀釋過的香鱗毛蕨有效部位至對(duì)應(yīng)6孔板孔內(nèi)，混勻，使菌液終濃度為1×104～3×104CFU/mL，置28 ℃溫箱中培養(yǎng)7 d。將各孔菌絲經(jīng)過固定、二次固定、丙酮系列脫水、浸透、包埋、升溫、超薄切片及染色等一系列過程后制成電鏡樣品,采用透射電鏡觀察香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes超微結(jié)構(gòu)變化情況。

2.3.3 香鱗毛蕨有效部位對(duì)β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶和角鯊烯環(huán)化酶的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白生長對(duì)照組，香鱗毛蕨有效部位高、中、低劑量組。分別將不同濃度的香鱗毛蕨有效部位和T.mentagrophytes菌懸液置28 ℃下培養(yǎng)7 d，收集菌絲樣品用于酶活性測定。通過查閱文獻(xiàn)[19]略加修改。將5 mLT.mentagrophytes菌液(1.0×107～2.0×107CFU/mL)移入到預(yù)冷的10 mL錐形離心管，放置冰槽5 min，4 ℃、3 000×g離心10 min，棄上清液，加入250 μL GENMED裂解液混勻，加入100 μL GENMED強(qiáng)化液后劇烈渦旋振蕩15 s，置冰槽里1 min，重復(fù)5次，加入250 μL GENMED裂解液混勻，4 ℃、1 000×g離心10 min，移取500 μL上清液到預(yù)冷的1.5 mL離心管，根據(jù)β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶試劑盒方法進(jìn)行酶活性測定。

取5 mL待測的T.mentagrophytes菌液(1.0×107～2.0×107CFU/mL)放入預(yù)冷的離心管中，置于冰槽中5 min，4 ℃、4 000×g離心10 min，棄上清液，加入20 μL GENMED裂解液混勻，加入10 μL GENMED強(qiáng)化液后劇烈渦旋振蕩15 s，置冰槽里1 min，加入50 μL GENMED裂解液混勻，4 ℃、10 000×g離心10 min，移取500 μL上清液到預(yù)冷的1.5 mL離心管，加100 μL GENMED溶解液，混勻，按照角鯊烯環(huán)化酶試劑盒說明書進(jìn)行酶活性測定。

3 結(jié)果

3.1 香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes抑菌圈的影響 紙片法測定香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes的抑菌圈直徑為(17.70±0.68) mm，陽性對(duì)照硝酸咪康唑直徑為(15.60±0.51) mm，鹽酸特比萘芬直徑為(35.33±4.99) mm。

3.2 試管藥基法測定香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytesMIC和MFC的影響 香鱗毛蕨有效部位對(duì)2株T.mentagrophytes標(biāo)準(zhǔn)株的MIC幾何平均值為5.3 mg/mL，MFC幾何平均值為10.6 mg/mL；對(duì)2株T.mentagrophytes臨床株的MIC幾何平均值為3.75 mg/mL，MFC幾何平均值為7.5 mg/mL。硝酸咪康唑?qū)?株T.mentagrophytes標(biāo)準(zhǔn)株的MIC幾何平均值為0.22 mg/mL，MFC幾何平均值為0.44 mg/mL；對(duì)2株T.mentagrophytes臨床株的MIC幾何平均值為0.88 mg/mL，MFC幾何平均值為1.77 mg/mL。

3.3 微量稀釋法測定香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytesMIC和MFC的影響 如表1所示，氟康唑?qū)|(zhì)控菌株的MIC為2 μg/mL，符合M38-A2的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。香鱗毛蕨有效部位對(duì)13株T.mentagrophytes的MIC的幾何平均值范圍為0.197～3.15 mg/mL，MFC的幾何平均值范圍為0.313～3.969 mg/mL；硝酸咪康對(duì)13株T.mentagrophytes的 MIC的幾何平均值范圍為0.099～0.630 0 μg/mL，MFC的幾何平均值范圍為0.157～0.794 μg/mL；鹽酸特比萘芬對(duì)13 株T.mentagrophytes的 MIC的幾何平均值范圍為0.025～0.079 μg/mL，MFC的幾何平均值范圍為0.031～0.157 μg/mL。

表1 微量稀釋法測定MIC、MFC值結(jié)果(n=3)

3.4 香鱗毛蕨有效部位乳膏體內(nèi)抗T.mentagrophytes作用的研究

3.4.1 香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)豚鼠體癬模型皮膚病變?cè)u(píng)分的影響 各皮損評(píng)分值所代表的一般情形見圖2，各組于第1、7、14天的皮損外觀見圖3，各組皮損評(píng)分均值情況見圖4。脫去結(jié)痂后，所有接種T.mentagrophytes的動(dòng)物都出現(xiàn)相似程度的皮損，表現(xiàn)為表皮出現(xiàn)大量紅色斑點(diǎn)，多數(shù)有充血紅腫癥狀，少數(shù)甚至出現(xiàn)皮膚破損與潰爛。皮損處均有白色至淡黃色鱗屑。在給藥治療的第7、14天，除模型組外，其余各給藥組的皮膚病變?cè)u(píng)分均有下降(P<0.05,P<0.01)。

圖2 各組豚鼠皮損分值代表的一般情形

注: A為模型組，B為鹽酸特比萘芬組，C為硝酸咪康唑組，D為香鱗毛蕨有效部位乳膏低劑量組，E為香鱗毛蕨有效部位乳膏中劑量組，F(xiàn)為香鱗毛蕨有效部位乳膏高劑量組。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與硝酸咪康唑組比較，#P<0.05,##P<0.01。

3.4.2 香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)豚鼠體癬模型真菌轉(zhuǎn)陰率的影響 結(jié)果如表2所示。至給藥第14天，模型組轉(zhuǎn)陰率為0；香鱗毛蕨有效部位乳膏低、中、高劑量組轉(zhuǎn)陰率分別為50%、75%、87.5%，硝酸咪康唑組和特比萘芬組轉(zhuǎn)陰率分別達(dá)到75%和100%，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。

表2 香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)T. mentagrophytes逆培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率的影響

3.4.3 香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)豚鼠體癬模型病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果見圖5，可知模型組真皮層有大量炎性細(xì)胞浸潤，棘細(xì)胞層明顯增生；鹽酸特比萘芬組有少量炎性細(xì)胞浸潤，棘細(xì)胞層未見明顯增生；硝酸咪康唑組中有少量炎癥浸潤，細(xì)胞棘細(xì)胞層有一定程度的增厚；香鱗毛蕨有效部位乳膏各劑量組中棘細(xì)胞層增生均有一定程度的減輕，增生程度輕于硝酸咪康唑組。PAS染色(圖6)發(fā)現(xiàn)，模型組基底層有大量紅色真菌孢子；鹽酸特比萘芬組、硝酸咪康唑組未發(fā)現(xiàn)真菌孢子；除香鱗毛蕨有效部位乳膏低劑量組部分基底層可見紅色真菌孢子外，香鱗毛蕨有效部位乳膏中、高劑量組未見真菌孢子。

圖5 各組豚鼠HE染色(×100)

圖6 各組豚鼠PAS染色(×100)

3.5 香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes總生物量的影響 表3顯示，與生長對(duì)照組比較，香鱗毛蕨有效部位低、高劑量組、硝酸咪康唑組以及鹽酸特比萘芬組能使總生物量下降(P<0.05，P<0.01)，均能抑制真菌的生長。

表3 香鱗毛蕨有效部位對(duì)T. mentagrophytes總生物量的影響

3.6 香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes超微結(jié)構(gòu)的影響 圖7顯示，生長對(duì)照組T.mentagrophytes的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜形態(tài)完整，胞質(zhì)均勻，胞漿內(nèi)可見一些細(xì)胞器；香鱗毛蕨有效部位低劑量組的T.mentagrophytes細(xì)胞壁疏松、皺縮，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞基質(zhì)變淡，細(xì)胞內(nèi)有明顯高電子致密顆粒聚集，細(xì)胞器大部分消失，可見較多的泡狀結(jié)構(gòu)；香鱗毛蕨有效部位中劑量組T.mentagrophytes細(xì)胞壁缺損嚴(yán)重，細(xì)胞膜不連續(xù)，皺縮細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間及胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多小的高電子致密顆粒，已無完整細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)髓樣化空泡化等特征。

注：A為生長對(duì)照組， B為香鱗毛蕨有效部位低劑量組，C為香鱗毛蕨有效部位中劑量組。

3.7 香鱗毛蕨有效部位對(duì)β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶和角鯊烯環(huán)過氧化酶活性的影響 結(jié)果如表4所示，與生長對(duì)照組比較，香鱗毛蕨有效部位低、中、高濃度組可降低β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶和角鯊烯環(huán)過氧化酶的活性(P<0.01,P<0.05)。

表4 香鱗毛蕨有效部位對(duì)β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶和角鯊烯環(huán)過氧化酶活性的影響

4 討論

淺部真菌病由須癬毛癬菌等淺部真菌引起頭癬、體股癬、手足癬等淺部感染，臨床上常出現(xiàn)復(fù)發(fā)和再感染[20]。由于皮膚癬菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，使得研制新的抗真菌藥迫在眉睫。香鱗毛蕨被譽(yù)為“皮膚病的克星”，在民間被廣泛應(yīng)用[21]。本文采用試管藥基法和美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推出的M38-A2法對(duì)多株T.mentagrophytes進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes有良好的體外抑菌和殺菌效果。由于體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致性，因此進(jìn)行體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)十分必要[22]。從皮膚病變?cè)u(píng)分、真菌轉(zhuǎn)陰率和組織病理學(xué)檢查三方面評(píng)價(jià)香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)T.mentagrophytes致豚鼠體癬治療效果。研究結(jié)果表明香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)皮損部位出現(xiàn)的紅斑、紅疹、瘙癢有一定程度的緩解作用，提高真菌轉(zhuǎn)陰率，改善皮損皮膚炎性浸潤和孢子數(shù)，并呈一定的量效關(guān)系。

生物量是指某一時(shí)刻單位面積內(nèi)實(shí)際存活的有機(jī)物質(zhì)(干重)總質(zhì)量[23]，本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)防用藥，即藥物一開始便加入T.mentagrophytes培養(yǎng)體系，96 h后通過稱量菌團(tuán)恒重，觀察香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes生長的影響。研究結(jié)果表明香鱗毛蕨有效部位能通過抑制T.mentagrophytes的生長，減少T.mentagrophytes生物量，且呈量效關(guān)系。

基于轉(zhuǎn)錄組測序分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香鱗毛蕨乙醇提取物可干擾紅色毛癬菌正常新陳代謝、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、核酸的合成[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)從T.mentagrophytes超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的關(guān)鍵酶探討香鱗毛蕨有效部位的抗菌機(jī)制。本文結(jié)果表明香鱗毛蕨有效部位可使T.mentagrophytes細(xì)胞壁皺縮、破裂，細(xì)胞膜破裂，提示香鱗毛蕨有效部位可以破壞T.mentagrophytes細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

β-葡聚糖是細(xì)胞壁的主要成分，可以保證細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定性。葡聚糖合成酶抑制劑抑制葡聚糖的合成，從而抑制細(xì)胞壁形成，細(xì)胞破裂死亡[24-25]。研究結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度的香鱗毛蕨有效部位可降低β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性，香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes抑菌機(jī)制可能是抑制其細(xì)胞壁合成所需的β-(1,3)-D-葡聚糖的活性，影響葡聚糖的合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁完整結(jié)構(gòu)缺失，真菌細(xì)胞溶解死亡。

麥角甾醇是真菌生長必需的重要成分，它能夠與磷酸結(jié)合起到保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性的作用，在確保細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、流動(dòng)性、膜結(jié)合酶的活性和胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸中起到重要的作用[26]。角鯊烯轉(zhuǎn)變成羊毛甾醇是麥角甾醇合成過程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，需要角鯊烯環(huán)過氧化酶的參與[27]。研究結(jié)果表明香鱗毛蕨有效部位對(duì)T.mentagrophytes角鯊烯環(huán)過氧化酶的活性有一定的影響，提示香鱗毛蕨有效部位抗T.mentagrophytes可能與抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性有關(guān)。

綜上所述，香鱗毛蕨有效部位乳膏對(duì)T.mentagrophytes有一定的抑菌與殺菌作用，可通過抑制β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶活性，影響葡聚糖和麥角甾醇的合成，從而抑制真菌生長。