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      短期干旱脅迫對桔梗生理生態(tài)及其皂苷含量的影響

      2021-10-26 12:07:16王士杰楊利民
      中成藥 2021年10期
      關(guān)鍵詞:復(fù)水桔梗皂苷

      李 敏, 張 萌, 王士杰, 程 林, 韓 梅*, 楊利民*

      (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院,吉林 吉林 132101)

      桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.) A.DC.是一種傳統(tǒng)的中草藥。桔梗主要種植在我國安徽、河北、河南、四川、江蘇和內(nèi)蒙古等干旱半干旱地區(qū)[1]。桔梗作為保健食品和中藥,用于治療咳嗽、痰多、喉痛等病癥[2]。三萜皂苷廣泛存在于中草藥中,以游離形式存在或以糖苷或酯結(jié)合糖的形式存在。藥理學(xué)研究證明,桔梗皂苷為其主要的有效成分,具有抗腫瘤、降血糖、抗肥胖等多種藥理活性[3],其中桔梗皂苷D(platycodin D,PD)與去芹糖桔梗皂苷D(deapio-platycodin D,DPD)為桔梗中的主要活性成分,具有抑制胰脂肪酶和抗腫瘤活性[4-5]。

      植物次生代謝產(chǎn)物決定了藥材的質(zhì)量,而植物次生代謝產(chǎn)物本身也受到脅迫條件的影響,尤其是干旱對藥物質(zhì)量的影響較大[6]。在栽培過程中,可以通過干旱脅迫等多種途徑增加藥用植物的次生代謝產(chǎn)物[7]。適度的干旱脅迫有利于桔梗幼苗總皂苷的積累[8]。到目前為止,桔梗適應(yīng)干旱的生理機(jī)制尚未全面闡明,為了探究桔梗在短期干旱脅迫下的生理反應(yīng),如光合作用、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、抗性酶系統(tǒng)及桔梗皂苷積累等情況,本實(shí)驗(yàn)對2年生桔梗進(jìn)行系統(tǒng)研究,以期為提高桔梗品質(zhì),實(shí)現(xiàn)桔梗的生態(tài)種植提供指導(dǎo)。

      1 材料

      1.1 藥材 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)選在吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物栽培育種及生理生態(tài)調(diào)控實(shí)踐教學(xué)基地。成熟的桔梗種子采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊利民教授鑒定為桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.) A.DC. 種子。選擇大小一致、飽滿、無病蟲害的種子,種植在同一規(guī)格花盆中(上口徑32 cm,下口徑28 cm,深度25 cm)。每盆裝5 kg混有有機(jī)肥的土壤。試驗(yàn)土壤為疏松的砂壤土,透氣排水性能良好,有機(jī)質(zhì)18.42 g/kg、堿氮108.15 mg/kg、速效磷39.86 mg/kg、速效鉀98.65 mg/kg。定株,定期進(jìn)行管理,包括除草、除蟲、澆水等。

      1.2 試劑及儀器 PRO測定試劑盒、MDA測定試劑盒、SOD酶活性測定試劑盒、POD酶活性測定試劑盒、CAT酶活性測定試劑盒、可溶性糖測試劑盒、可溶性蛋白測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。桔梗皂苷對照品購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈(色譜純,美國Fisher Scientific公司);水為雙重蒸餾水;其他試劑為國產(chǎn)分析純。MDF-382E超低溫冰箱(日本SANYO公司);高速離心機(jī)(美國Thermo公司);SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);Agilent1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);LCpro+便攜式光合儀(英國 ADCBioScientific Ltd.公司);調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(英國 Hansatech公司)。

      2 方法

      2.1 短期干旱脅迫試驗(yàn) 在短期干旱脅迫試驗(yàn)前的半個月,每個花盆每2 d灌溉1次,以保證水分條件一致。2018年9月5日,開展干旱脅迫試驗(yàn)。將60盆生長良好、一致性好、無病蟲害的桔梗植株隨機(jī)分為干旱組和對照組,每組30盆。干旱組的土壤在試驗(yàn)開始前(2018年9月4日)一次性灌溉至飽和,土壤含水量約為33.7%。而后干旱組在連續(xù)干旱處理中不再澆水,直到桔梗的葉子枯萎。對照組根據(jù)長春地區(qū)近10年的9月份平均降雨量,每2 d澆一次水,澆水量為800 cm3,土壤含水量控制在16% ~18%,以保證桔梗的正常生長發(fā)育。在12 d,桔梗的葉子開始枯萎,下午6點(diǎn)再向干旱組供水。此后干旱組與對照組的管理相同,直至2018年10月30日秋季(HT)統(tǒng)一收獲。

      在干旱脅迫實(shí)驗(yàn)中,分別在第3、6、9、12、15、18天以及秋季進(jìn)行了取樣。每次取樣時隨機(jī)選擇3盆,去泥沙、清洗、瀝干水分后,取部分桔梗根組織,貯存于-80 ℃超低溫冷藏箱,用于后續(xù)試驗(yàn)。剩余部分桔梗根置于烘箱中,65 ℃烘干至恒定質(zhì)量,用高速萬能打粉機(jī)磨成細(xì)粉,過60目篩,用于桔梗皂苷的測定。

      2.2 桔梗皂苷含量測定 稱取桔梗根粉末200 mg,80%甲醇在60 ℃下超聲提取3次,每次20 min,蒸發(fā)溶劑,將殘?jiān)?0%甲醇溶解稀釋至10.0 mL量瓶中,0.45 μm微孔濾膜過濾,取上清液。

      分析采用Promasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流動相乙腈 (A)-0.2% 甲酸(B),梯度洗脫(0~15 min,20%A;15~60 min,22%A;60~65 min,30%A;65~70 min, 20% A,最后用20%A運(yùn)行5 min);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。漂移管溫度75 ℃;載氣(N2)體積流量2.5 L/min。制備含桔梗皂苷D(PD)、去芹糖-桔梗皂苷D(DPD)和桔梗皂苷D3(DP3)的甲醇溶液母液,稀釋至適當(dāng)濃度,以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,得PD、DPD、PD3的回歸方程分別為logY=0.611 5logX-3.324 6(r=0.999 9)、logY=0.6004logX-3.341 1(r=0.999 9)、logY=0.596 9logX-3.269 1 (r=0.999 8)。色譜圖見圖1。

      1.桔梗皂苷D3 2.去芹糖-桔梗皂苷D 3.桔梗皂苷 D

      2.3 光合作用及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 在桔梗短期干旱脅迫期間,每個處理隨機(jī)選取長勢相似的植株15株,掛牌,于2018年9月4日開始,每隔3 d,上午 8:30~11:30 采用Li-6400便攜式光合儀對桔梗葉片進(jìn)行光合參數(shù)測定,同時采用PAM-2100便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測定桔梗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定。

      2.4 生理生化指標(biāo)測定 PRO、MDA、SOD、POD、CAT、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)含量測定均按照試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行操作,并計(jì)算各指標(biāo)水平。

      2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2013對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0、OriginPro進(jìn)行分析和作圖。

      3 結(jié)果

      3.1 土壤水分變化 土壤含水量變化見圖 2,可知在短期水分脅迫開始后,處理組土壤含水量由處理開始時的 33.5%,不斷下降到12 d后的8.5%,13 d開始進(jìn)行復(fù)水處理,使處理組土壤水分恢復(fù)到與對照組相同水平(16%~18%)。

      圖2 短期干旱脅迫下土壤水分含量變化

      3.2 短期干旱脅迫對桔梗光合指標(biāo)參數(shù)影響 短期干旱脅迫對桔梗葉片光合特性的影響見圖3,可知隨著土壤含水量的降低,桔梗的WUE和Pn均呈下降趨勢,Ls和Ci在干旱初期增加,后期逐漸下降;處理組Pn、WUE和Ci均低于對照組,處理組Ls在干旱初期高于對照組(P<0.01);復(fù)水后,桔梗的WUE、Ci和Ls得到了恢復(fù),短期內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn),處理組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

      注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

      3.3 短期干旱脅迫對桔梗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 桔梗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)受到短期干旱脅迫的影響見圖4,可知隨著干旱程度加重,桔梗葉片F(xiàn)v/Fm和φPSⅡ逐漸降低,并在干旱的12 d分別降到最低0.733和0.31(P<0.01),提示桔梗在受到干旱影響后光能的利用力減弱;在干旱處理下桔梗的NPQ亦也受到影響,在開始干旱的6 d,NPQ升高(P<0.05),之后逐漸下降,復(fù)水后仍未能達(dá)到對照組的正常水平,而qP受干旱影響不明顯。

      注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

      3.4 短期干旱脅迫對桔梗根保護(hù)酶活性的影響 短期干旱處理對桔梗根部保護(hù)酶活性的影響結(jié)果見圖5,可知在短期干旱處理過程中,對3種保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性均有影響,其中在整個實(shí)驗(yàn)階段,處理組SOD與POD活性變化趨勢與對照組基本一致;在開始干旱的3、6 d,SOD活性低于對照組(P<0.05,P<0.01),隨著干旱程度的增加,處理組SOD活性不斷提高,并在9、12 d活性高于對照組(P<0.05),復(fù)水后出現(xiàn)降低,但仍高于對照組;POD除了3、18 d外,在整個實(shí)驗(yàn)過程總,處理組均高于對照組(P<0.05);CAT活性受干旱影響較大,在干旱3 d時,處理組低于對照組(P<0.01),然后隨著干旱的加重,處理組急劇增加并高于對照組,復(fù)水后雖然略有下降,但仍高于對照組。

      注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

      3.5 短期干旱脅迫對桔梗根滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 短期干旱對桔梗根部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和丙二醛水平的影響結(jié)果見圖6,可知在實(shí)驗(yàn)過程中,處理組與對照組的SP和PRO水平變化趨勢基本一致,SP呈現(xiàn)逐漸升高后下降的趨勢,且隨著干旱程度增加,處理組在干旱最嚴(yán)重的12 d達(dá)到最大值為 7.636 mg/g(P<0.05),在復(fù)水后SP水平有所下降但仍高于對照組(P<0.05),PRO整個實(shí)驗(yàn)過程中,處理組均高于對照組,桔梗根部PRO水平在干旱的3 d增加,在6、9 d下降,在干旱最嚴(yán)重的12 d又開始增加,并且復(fù)水后仍在上升;SS水平受干旱影響不明顯,僅在干旱比較嚴(yán)重的9 d和12 d高于對照組(P<0.05),復(fù)水后2組間無顯著差異;MDA在開始干旱的3 d出現(xiàn)短暫的水平降低,隨后在干旱程度的加深過程中不斷累積,12 d達(dá)到最大值 25.289 nmol/g,在復(fù)水后MDA水平有所下降。

      注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

      3.6 短期干旱脅迫對桔梗皂苷含量變化的影響 短期干旱對桔梗皂苷含量的影響見圖7,可知桔梗皂苷含量可以反映出植物對水分變化的響應(yīng)程度,也是評價桔梗質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明,隨著土壤含水量的減少PD及DPD含量總體呈增長趨勢;在處理組中,PD及DPD總體趨勢相似,在9、12 d 重度干旱階段,其含量均增加,PD分別達(dá)到了130.526、119.542 μg/g,DPD分別達(dá)到了45.209、 45.45 μg/g,均高于對照組;在干旱脅迫實(shí)驗(yàn)過程中,兩組間PD3的含量變化并不明顯,但在秋季HT時對照組高于處理組(P<0.01);PD、DPD含量在秋季HT時均高于對照組,說明干旱脅迫有利于桔梗主要皂苷類成分的積累。

      注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

      3.7 短期干旱脅迫下桔梗各指標(biāo)的相關(guān)分析及主成分分析 利用SPSS 22.0對短期干旱脅迫下桔梗皂苷與各生理指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果見表1,可知光合參數(shù)中僅Pn與PD極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),Ls 與 DPD 為極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01);葉綠素?zé)晒鈪?shù)中,F(xiàn)v/Fm與PD3有顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05),而φPSⅡ與 PD、DPD均為極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),可能因?yàn)楣夂献饔脜?shù)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)并未直接參與于桔梗根部皂苷的合成而起間接作用,故對 PD、PD3 及DPD 的生物合成影響較弱。植物保護(hù)酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中 SOD、SP、MDA 對 PD及 DPD 的合成有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05),而其他生理指標(biāo)與桔梗皂苷的相關(guān)性并未達(dá)到顯著水平。

      表1 短期干旱脅迫下桔梗皂苷與各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

      為了探討短期干旱對桔梗3種皂苷(PD、DPD、PD3)、光合作用(Pn、WUE、Ci、Ls)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、 φPSII、qP、NPQ)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SP、PRO、SS)、MDA、保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)共18個指標(biāo)間的交互影響,基于主成分析構(gòu)建各指標(biāo)的雙標(biāo)圖,雙標(biāo)圖中的向量表示了指標(biāo)的信息,2個指標(biāo)間夾角的余弦的絕對值表示它們之間相關(guān)性的大小[9],其值越大表明2個向量對應(yīng)的指標(biāo)之間相關(guān)性越高,當(dāng)2個向量近似垂直時,指標(biāo)之間相關(guān)性很弱,幾乎互不影響[10]。

      對短期干旱脅迫下桔梗各指標(biāo)進(jìn)行主成分析并繪制雙標(biāo)圖,結(jié)果見圖8。根據(jù)18個主成分所保留原始變量信息的大小,提取2個主成分,其中PC1(第一主成分)和 PC2(第二主成分)差異顯著,對原始資料的解釋率分別為35.40%、21.87%,共計(jì)57.27%。圖8、表2 顯示,PC1與桔梗皂苷(PD、DPD、PD3)、WUE、Ci、qP、NPQ、3種保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)、MDA 及 SP 正相關(guān),且Ci、SOD、CAT、SP、MDA、PD、DPD的變量系數(shù)較大,為正向主導(dǎo)變量,而Ls、Fv/Fm 和φPSⅡ?yàn)樨?fù)向主導(dǎo)變量;PC2中,WUE、POD和 PRO 的變量系數(shù)為較大且為正,為正向主導(dǎo)變量,負(fù)向變量系數(shù)Ls、SOD、SS、MDA、PD、DPD 中僅SS和PD變量絕對值較大,為負(fù)向主導(dǎo)變量。PC1 和 PC2 中這些主導(dǎo)變量可以反映18個變量的綜合指標(biāo)。

      圖8 短期干旱脅迫下桔梗各指標(biāo)的主成分分析圖

      表2 旋轉(zhuǎn)后因子載荷

      4 討論與結(jié)論

      在干旱脅迫發(fā)生后,植物會通過自身一系列理態(tài)學(xué)程和機(jī)理去防御和適應(yīng)脅迫。干旱處理對桔梗的光合特性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)有一定的影響。處理組Pn、WUE和Ci均低于對照組,處理組Ls 在干旱初期高于對照組(P<0.05)。復(fù)水后的短期觀察發(fā)現(xiàn),處理組與對照組桔梗Pn、WUE、Ci 和Ls無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Fv/Fm、φPSⅡ受到短期持續(xù)干旱的顯著影響,隨著干旱程度加重桔梗葉片F(xiàn)v/Fm和φPSⅡ逐漸降低,并在干旱的12 d分別降到最低0.733和0.31(P<0.01),提示桔梗在受到干旱影響后光能的利用力減弱。

      PRO、SP、SS 等作為滲透保護(hù)劑,在脅迫條件下植物的適應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),處理組SP 干旱最嚴(yán)重的12 d達(dá)到最大值為7.636 mg/g(P<0.05),復(fù)水后有所下降但仍高于對照組(P<0.05)。PRO 整個實(shí)驗(yàn)過程中,處理組均高于對照組。MDA在干旱脅迫條件下,其水平隨膜脂過氧化程度的增加而增加[12]。在桔梗短期干旱脅迫中,MDA水平在3 d出現(xiàn)短暫降低,隨著干旱程度加深不斷累積,12 d達(dá)到最大值 25.289 nmol/g。

      干旱脅迫前期不同處理防風(fēng)SOD、POD、CAT 活性均呈增加趨勢[7],當(dāng)植物受到脅迫后,植物的細(xì)胞和亞細(xì)胞系統(tǒng)通過 SOD、POX、CAT 等抗氧化酶來抵御活性氧自由基的細(xì)胞毒作用[13];隨干旱程度增加,處理組SOD活性不斷提高,并在9、12 d 活性高于對照組(P<0.05),復(fù)水后出現(xiàn)降低,但仍高于對照組;除了3、18 d 外,處理組POD均高于對照組;CAT隨干旱加重,處理組急劇增加并高于對照組,復(fù)水后仍高于對照組。以上結(jié)果說明,桔梗根部組織通過增加 SOD、POD、CAT 等抗氧酶活性來抵御干旱脅迫帶來的傷害。

      適度的干旱脅迫有利于藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累[14-16],在受不同非生物脅迫的法國南部的大葉菊植物中觀察到大量倍半萜[17]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著土壤水分含量的減少,PD及DPD含量總體呈增長趨勢,在 9、12 d 重度干旱階段其含量均高于對照組,動態(tài)變化可認(rèn)為是對抗干旱脅迫的防御機(jī)制。

      綜上所述,本研究可為考察短期干旱脅迫對桔梗活性成分積累的影響提供依據(jù),也能為進(jìn)一步探討該藥材對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供參考。

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