HPLC 測(cè)定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量

張 蔚，鄺嘉穎，吉 薇，龍慧靜，周秀春

（廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510225）

山梨酸鉀是經(jīng)由山梨酸與碳酸鉀發(fā)生中和反應(yīng)而生成的，擁有山梨酸基本的性能[1]，作為常用的防腐劑，其價(jià)格低廉、毒性小，在防腐過(guò)程中可以保持食品原本的色、香、味且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不改變。雖然山梨酸鉀毒性小，但使用時(shí)仍存有一些不良反應(yīng)，如皮膚刺激性反應(yīng)、過(guò)敏性或者超敏性反應(yīng)等，并且部分食品添加劑會(huì)超標(biāo)。因此，控制山梨酸鉀的使用含量，保證其使用安全性具有重要的意義[2]。檢測(cè)山梨酸鉀含量的方法有拉曼光譜法、熒光光譜法、高效液相色譜法等，其適用范圍僅限于調(diào)味品、飲料、果醬、口服液等食品與藥品。

口服液劑內(nèi)含糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物，容易長(zhǎng)出霉菌而發(fā)霉，為了保障口服液的質(zhì)量，某些廠家會(huì)向產(chǎn)品中添加一定量的山梨酸鉀，達(dá)到防腐保質(zhì)的目的。此前，也有很多關(guān)于口服液中山梨酸含量測(cè)定的文獻(xiàn)，大多數(shù)是研究中藥口服液中的多種防腐劑，但未出現(xiàn)過(guò)葡萄糖酸鋅口服液山梨酸含量測(cè)定的研究，而葡萄糖酸鋅口服液并非中藥制劑，并且國(guó)家并未出臺(tái)相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量。試驗(yàn)參考有關(guān)資料[3-8]，確定了最適合葡萄糖酸鋅口服液的流動(dòng)相及系統(tǒng)配置，相比起其他檢測(cè)口服液中防腐劑的研究，該方法提高了專(zhuān)屬性、簡(jiǎn)化了操作，為葡萄糖酸鋅口服液中的山梨酸鉀含量測(cè)定提供一種簡(jiǎn)單、高效、便捷、準(zhǔn)確度高的新方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-20A 型四元低壓液相色譜儀及配套色譜工作站、KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器、賽多利斯BSA224S 型十萬(wàn)分之一電子天平、瑞士梅特勒托利多百萬(wàn)分之一電子天平等。

1.2 試劑

山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：101075-201602，含量100.0%），中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；隨機(jī)在市面上購(gòu)買(mǎi)的葡萄糖酸鋅口服液（批號(hào)：20180105，18060727，17092531，170601）；乙腈、甲醇，均為色譜純；水，為超純水；其他溶液均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：島津C18型柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈（75%∶25%），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液

精密稱(chēng)取山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品約20 mg，置其于100 mL 容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.2.2 樣品溶液

精密量取樣品5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，作為樣品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品輔助液

精密稱(chēng)取山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，作為標(biāo)準(zhǔn)品輔助液。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)化

主要對(duì)流動(dòng)相的類(lèi)型與比例、柱溫、進(jìn)樣量進(jìn)行比較篩選，而流速與檢測(cè)波長(zhǎng)不作為條件篩選，流速過(guò)大會(huì)對(duì)液相色譜儀造成壓力，1 mL/min 是最合適的流速；檢測(cè)波長(zhǎng)是因?yàn)樵摲椒ㄖ谎芯恳环N防腐劑，不需要同時(shí)測(cè)定幾種不同的防腐劑在口服液中的含量，參考相關(guān)學(xué)者的研究[9-10]，最后選擇波長(zhǎng)為262 nm。理論塔板數(shù)（按山梨酸鉀峰計(jì)） 不低于4 000，山梨酸鉀與相鄰峰分離度符合要求。

3.1.1 流動(dòng)相的選擇

以A 組（甲醇∶乙酸銨溶液= 5%∶95%）、B 組（乙腈∶水= 40%∶60%）、C 組（0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈= 80%∶20%） 為流動(dòng)相進(jìn)行進(jìn)樣。

不同流動(dòng)相的液相色譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，B 組流動(dòng)相組合峰形既不美觀也不對(duì)稱(chēng)，而且出峰時(shí)間也過(guò)早，A 組流動(dòng)相組合峰形相較C 組流動(dòng)相組合而言也不夠美觀，C 組流動(dòng)相組合出峰時(shí)間合適，峰形也美觀對(duì)稱(chēng)，故選擇C 組：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈= 80%∶20%作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相的液相色譜圖

3.1.2 流動(dòng)相比例

確定流動(dòng)相的組成后，用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的山梨酸鉀對(duì)照品溶液，在柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，波長(zhǎng)262 nm 的條件下，以±5%進(jìn)行流動(dòng)相比例調(diào)整以達(dá)到更佳的峰形和更合適的出峰時(shí)間，發(fā)現(xiàn)75%∶25%已經(jīng)能夠達(dá)到比較理想的效果。

不同比例的0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液與乙腈為流動(dòng)相時(shí)的液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同比例的0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液與乙腈為流動(dòng)相時(shí)的液相色譜圖

3.1.3 柱溫

確定流動(dòng)相的組成和比例后，用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的山梨酸鉀對(duì)照品溶液，波長(zhǎng)262 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL 時(shí)，分別在柱溫為40，30 ℃條件下進(jìn)樣。40 ℃的峰形更加尖細(xì)，出峰時(shí)間也相較30 ℃的更合適。

3.1.4 進(jìn)樣量

用山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的山梨酸鉀對(duì)照品溶液，固定波長(zhǎng)262 nm，流速1 mL/min 不變，分別在進(jìn)樣量為20，10 μL 的條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。20 μL 的進(jìn)樣量相較10 μL 的更加合適，峰形也比10 μL 的美觀。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 線(xiàn)性范圍

配制質(zhì)量濃度為0.008，0.016，0.032，0.040，0.048，0.064，0.080 mg/mL 的梯度溶液，以質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標(biāo)，峰面積（Y） 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。據(jù)圖3 可知，山梨酸鉀的線(xiàn)性回歸方程為Y=206 812 000X+49 078，R2=0.999 8。結(jié)果說(shuō)明，山梨酸鉀在質(zhì)量濃度為8.136～81.360 μg/mL 內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

線(xiàn)性回歸方程見(jiàn)圖3。

圖3 線(xiàn)性回歸方程

3.2.2 專(zhuān)屬性驗(yàn)證

專(zhuān)屬性驗(yàn)證指的是如果樣品除了待測(cè)成分以外還存在其他成分時(shí)，如輔料、雜質(zhì)、降解產(chǎn)物等，采用的方法可以正確地測(cè)定被測(cè)物的能力。按2.2.1的方法得到標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，按2.2.2 的方法得到樣品（批號(hào)17092531） 溶液和陰性樣品（批號(hào)20180105）溶液對(duì)照，記錄出峰時(shí)間及峰面積。

專(zhuān)屬性驗(yàn)證色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 專(zhuān)屬性驗(yàn)證色譜圖

由圖4 可見(jiàn)，山梨酸鉀峰周?chē)o(wú)雜質(zhì)峰，標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液與樣品出峰時(shí)間在誤差范圍內(nèi)，且同一時(shí)間陰性樣品并未出現(xiàn)色譜峰。證明該方法專(zhuān)屬于山梨酸鉀峰的檢出。

3.2.3 精密度驗(yàn)證

按2.2.1 的方法得到標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，連續(xù)在液相色譜儀中進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。精密度要在規(guī)定的條件之下，同1 份樣品多次取樣測(cè)得結(jié)果之間接近程度，經(jīng)計(jì)算得出山梨酸鉀峰面積的RSD 為0.27%（n=6），表明該液相色譜儀的精密度良好，經(jīng)該液相色譜儀的試驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠、準(zhǔn)確。

3.2.4 重復(fù)性驗(yàn)證

按2.2.2 的方法制備樣品（批號(hào)17092531） 溶液，分別在室溫條件下放置0，1，2，4，6，8 h 后進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。該結(jié)果測(cè)得山梨酸鉀含量的RSD 為0.60%，表明該方法的重復(fù)性良好，多次操作結(jié)果都在誤差范圍內(nèi)，該方法所得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信。

3.2.5 穩(wěn)定性驗(yàn)證

按2.2.2 的方法制備樣品（批號(hào)17092531） 溶液，分別在室溫條件下放置0，1，2，4，6，8 h 后進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得山梨酸鉀峰面積RSD 為0.52%（n=6），說(shuō)明樣品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，在8 h 內(nèi)樣品性質(zhì)未發(fā)生改變，可以用于試驗(yàn)操作，放置8 h 后試驗(yàn)結(jié)果仍然準(zhǔn)確可靠。

3.2.6 加樣回收率

準(zhǔn)備9 個(gè)50 mL 容量瓶，將這9 個(gè)容量瓶分成3 組，每組3 個(gè)，分組名為“1∶0.8”“1∶1.0”“1∶1.2”；各加入已知含量的樣品（批號(hào)17092531）5 mL，再分別加入標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，“1∶0.8”組中加入6 mL 標(biāo)準(zhǔn)品輔助液，“1∶1.0”組中加入8 mL標(biāo)準(zhǔn)品輔助液，“1∶1.2”組中加入10 mL 標(biāo)準(zhǔn)品輔助液。加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標(biāo)簽，進(jìn)行測(cè)定，記錄測(cè)得的峰面積。根據(jù)線(xiàn)性回歸方程進(jìn)行含量計(jì)算及另外進(jìn)行加樣回收率的計(jì)算。加樣回收率一般用于測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，即該方法測(cè)定出來(lái)的結(jié)果跟參考值或者真實(shí)值接近程度，該方法中的山梨酸鉀加樣回收率為98.21%，RSD 為0.53% （n=9），說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.2.7 耐用性驗(yàn)證

分別改變柱溫、流動(dòng)相pH 值，其他條件不變，記錄峰面積并進(jìn)行計(jì)算。分別改變柱溫、流動(dòng)相pH 值，其他條件不變時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響，可以為建立的日常檢驗(yàn)新方法提供依據(jù)。

3.3 樣品含量測(cè)定

按2.2.2 的方法制備樣品（批號(hào)18060727）、樣品（批號(hào)17092531）、樣品（批號(hào)170601），進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，按所得出的線(xiàn)性回歸方程進(jìn)行含量計(jì)算。

樣品中山梨酸鉀含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中山梨酸鉀含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

研究得出最適合測(cè)定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀含量的高效液相色譜條件為流動(dòng)相0.02 mol/L，磷酸二氫鈉溶液∶乙腈（75%∶25%），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm。該方法靈敏度高、可信度高、操作簡(jiǎn)便，目前我國(guó)尚未有明確的山梨酸鉀添加在藥品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此研究可以為葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量檢測(cè)提供參考。