榆梔止血顆粒調(diào)控PI3K-Akt通路對(duì)子宮出血大鼠的保護(hù)作用*

池曉蓉 陳德招 王趙偉 李敏 姜艷玲

(1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 廈門 361000;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350001；3.中國(guó)制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006)

子宮出血是指與月經(jīng)無(wú)關(guān)的子宮異常出血，是臨床常見(jiàn)的婦科疾病[1-2]。子宮異常出血可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變、貧血甚至不孕等，其發(fā)病率較高，嚴(yán)重危害女性生命健康[3-4]。子宮出血機(jī)制復(fù)雜，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，子宮出血與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡、血管生成障礙、胞外基質(zhì)異常及激素水平異常等子宮局部微環(huán)境改變有關(guān)[5-6]。而磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B,Akt)可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡，且與血管生成關(guān)系密切[7-8]，但PI3K-Akt通路在子宮出血病理過(guò)程中的調(diào)控作用研究較少。中醫(yī)藥在治療子宮出血方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，榆梔止血顆粒(Yuzhi Zhixue Granule,YZZXKL)原名婦科止血顆粒，具有清熱涼血、調(diào)經(jīng)止血，臨床上常用于治療血熱所致的月經(jīng)過(guò)多，有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)在早孕子宮出血癥方面止血效果較好[9]。然而YZZXKL治療子宮出血的具體機(jī)制還不明確，這不利于YZZXKL的推廣和應(yīng)用，本研究通過(guò)建立大鼠子宮出血模型并設(shè)置PI3K-Akt通路抑制劑對(duì)此進(jìn)行研究，以期闡明PI3K-Akt通路在YZZXKL治療子宮出血中的作用，為臨床合理用藥及中醫(yī)藥走向國(guó)際化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)同遺傳背景SD大鼠，體重 260～280 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，噪音低于80分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本試驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，試驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 YZZXKL(成藥組成：地榆、梔子、墨旱蓮、黃芩、茜草、貫眾、槐花、蒲黃、拳參、大薊、丹皮、白芍、側(cè)柏葉(炒炭)、仙鶴草、當(dāng)歸等，批號(hào)：2003L01364,由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：10 g/袋，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20130019)；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining,HE)染色試劑盒(貨號(hào)：LMO105,廠家：上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；米非司酮(貨號(hào)：10412,購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司)；米索前列醇片(貨號(hào)：RK170327,購(gòu)自深圳市洛克生化科技有限公司)；血清雌二醇(E2)、孕酮(P)酶聯(lián)免疫(Enzyme linked immunosorbent assay,ELSA)試劑盒(貨號(hào)：YE01847、YE01938,均購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；PI3K抗體、Akt磷酸化p-Akt抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)、(貨號(hào)分別為：ab39307、ab38449、ab19956、ab32152、ab134184,均購(gòu)自美國(guó)abcam公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號(hào)分別為P0768,P0231,均購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司)。手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號(hào)RM2125RTS,德國(guó)Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)SMZ745,日本尼康公司)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)1659001、Trans-Blot SD,美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號(hào)：GIS-500,Miulab公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠子宮出血模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[9]建立大鼠子宮出血模型，具體操作方法為：將健康雌性SD大鼠80只、雄性大鼠40只，按2∶1比例合籠飼養(yǎng)，于第2天8∶00進(jìn)行陰道涂片檢查，以發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1天，取妊娠大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal組)、模型組(Model組)、YZZXKL低(4 g/kg)、高(16 g/kg)劑量組、PI3K/Akt通路抑制劑LY294002組(LY組，0.3 mg/kg)、YZZXKL+LY組(16 g/kg+0.3 mg/kg)，各組10只。除Normal組外，其余各組大鼠均于妊娠第7天8∶00和18∶00時(shí)分別灌服米非司酮(13.8 mg/kg)和米索前列醇(135 μg/kg)復(fù)制子宮出血模型，并于大鼠陰道置于棉球，若次日取出棉球觀察，若棉球上有血，表明造模成功；Normal組于相同時(shí)間灌胃給予等量生理鹽水。各組大鼠均于造模成功后(妊娠第8 d)開(kāi)始給藥，YZZXKL參照文獻(xiàn)[9]及人與動(dòng)物等效劑量換算設(shè)置低、高劑量組，并用生理鹽水稀釋成0.4、1.6 g/mL的混懸液，LY294002參照文獻(xiàn)[10]用DMSO溶液配制為0.03 mg/mL的混懸液，YZZXKL低、高劑量組按10 mL/kg的劑量灌胃給予相應(yīng)濃度的YZZXKL混懸液；LY組按10 mL/kg的劑量腹腔注射給予相應(yīng)濃度的LY294002混懸液；YZZXKL+LY組按10 mL/kg的劑量灌胃給予YZZXKL混懸液和腹腔注射給予LY294002混懸液；Normal組和Model組均按10 mL/kg的劑量灌胃給予生理鹽水，并腹腔注射給予DMSO溶液。各組連續(xù)給藥7 d,1次/d。

1.2.2 大鼠陰道出血量(UBQ)測(cè)定 各組大鼠均參照文獻(xiàn)[9]在給藥期間(妊娠第8 d～14 d)于陰道內(nèi)置入重量為75～80 mg棉球一個(gè)(塑料薄膜包裹半側(cè)，以防血液漏出和尿液返流)，次日分別于8∶00和18∶00將棉球取出，放入塑料袋中密閉冷藏保存，同時(shí)置換一個(gè)新棉球于陰道內(nèi)，觀察陰道出血情況。將各組大鼠每天收集的子宮出血棉球分別置于燒杯內(nèi)，根據(jù)出血量的情況加適量50 g/L NaOH浸泡擠壓、搓洗棉球血漬，浸洗后的溶液倒入一燒杯內(nèi)保存。并用50 g/L NaOH浸洗3～4次，收集所有浸洗液，混勻，并記錄所用50 g/L NaOH總體積，取5 mL浸提液過(guò)濾，取4 mL濾液，作為試驗(yàn)管。用血紅蛋白吸管，吸取大鼠尾靜脈血0.02 mL,加入50 g/L NaOH溶液4 mL,混勻作為空白對(duì)照管。將空白管和對(duì)照管在546 nm波長(zhǎng)記錄吸光度(A)值，根據(jù)公式子宮出血量(mL)=0.02×浸提液A值×浸提子宮血所用NaOH總體積(mL)/空白管A值/4,計(jì)算陰道出血量(UBQ)。

1.2.3 大鼠血液指標(biāo)檢測(cè)及子宮組織標(biāo)本采集 各組大鼠在末次給藥24 h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉，取頸總動(dòng)脈血6 mL (不加抗凝劑)，全血以3000 r/min離心10 min,取上層血小板血漿 (PPP)用半自動(dòng)凝血分析儀按照凝血四項(xiàng)說(shuō)明書測(cè)定凝血四項(xiàng)，另取全血2 mL,靜置30 min后以 3000 r/min 離心10 min,取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清E2、P含量。處死大鼠，取子宮組織，剪取0.5 g子宮內(nèi)膜組織，用組織勻漿器勻漿、離心分離后取上清液于-20 ℃冰箱保存；剩余子宮組織，迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HE染色觀察子宮組織形態(tài)變化 取1.2.3于4%多聚甲醛中固定的子宮內(nèi)膜組織，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。按HE試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1.2.3于-20 ℃冰箱保存的子宮內(nèi)膜組織勻漿液，于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度后，取50 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,TBST溶液清洗3次后，加入一抗(PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-1、bFGF、稀釋倍數(shù)分別為1∶1000)、β-actin(內(nèi)參，稀釋倍數(shù)為1:2000)抗體，4 ℃搖床室溫孵育過(guò)夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h,TBST清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠UBQ及血清激素E2、P含量檢測(cè)結(jié)果 與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠UBQ明顯增高 (P<0.05)，E2、P含量均降低(P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠大鼠UBQ均明顯降低(P<0.05)，E2、P含量均升高 (P<0.05)，且YZZXKL各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性；而LY組大鼠UBQ明顯增高 (P<0.05)，E2、P含量均降低 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比，上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠UBQ及血清激素E2、P含量比較Table 1 Comparison of UBQ,E2 and P contents in serum of rats in each group

2.2 各組大鼠凝血指標(biāo)TT、PT、APTT及FIB檢測(cè)結(jié)果 與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠TT、PT、APTT均明顯升高 (P<0.05)，F(xiàn)IB降低 (P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠TT、PT、APTT均明顯降低 (P<0.05)，F(xiàn)IB升高 (P<0.05)，且YZZXKL各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性；而LY組大鼠TT、PT、APTT均明顯升高 (P<0.05)，F(xiàn)IB降低 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比，上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠TT、PT、APTT及FIB比較Table 2 Comparison of TT,Pt,APTT and FIB of rats in each group

2.3 各組大鼠子宮組織HE染色結(jié)果 Normal組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)正常。與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠子宮內(nèi)膜固有層間質(zhì)細(xì)胞增生、血管擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織固有層基質(zhì)細(xì)胞略有增生，可見(jiàn)少量新生血管生成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。而LY組大鼠子宮內(nèi)膜上皮柱狀細(xì)胞變性壞死，凋落，固有層纖維樣變性和增生及血管擴(kuò)張嚴(yán)重，可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至肌層，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織HE染色圖(400×)Figure 1 HE staining of uterus in each group

2.4 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果 與Normal組相比，Model組和YZZXKL+LY組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低 (P<0.05)，MMP-2蛋白表達(dá)升高 (P<0.05)。與Model組和YZZXKL+LY組相比，YZZXKL低、高劑量組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF相對(duì)表達(dá)水平均升高 (P<0.05)，MMP-2蛋白表達(dá)降低 (P<0.05)，且YZZXKL各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性；而LY組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低 (P<0.05)，MMP-2蛋白表達(dá)升高 (P<0.05)。Model組和YZZXKL+LY組相比，上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)免疫印跡圖Figure 2 Western blotting of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF and MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group注：A.Normal組；B.Model組；C.YZZXKL+LY組；D.YZZXKL低劑量組；E.YZZXKL高劑量組；F.LY組

表3 各組大鼠子宮組織PI3K、p-Akt、eNOS、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)比較 Table 3 Comparison of PI3K,p-Akt,eNOS,VEGF,MMP-2 protein expression in uterine tissue of rats in each group

3 討論

子宮異常出血是臨床常見(jiàn)、多發(fā)的疑難病癥，其中功能性子宮出血是子宮異常出血中最常見(jiàn)類型[11]。米非司酮聯(lián)合米索前列醇誘導(dǎo)早孕大鼠子宮出血是子宮出血?jiǎng)游锬Ｐ妥畛Ｒ?jiàn)和穩(wěn)定的造模方法[12]。本研究用上述方法復(fù)制大鼠子宮出血模型，結(jié)果提示用米非司酮聯(lián)合米索前列醇復(fù)制大鼠子宮出血模型后，Model組大鼠陰道出血增多，凝血時(shí)間延長(zhǎng)，激素水平紊亂并伴隨子宮內(nèi)膜炎癥和微環(huán)境改變，與文獻(xiàn)[13-14]子宮出血模型指標(biāo)變化一致，表明造模成功。

中醫(yī)藥在治療子宮出血方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[15]，YZZXKL方中君藥炒地榆涼血瀉熱、收斂止血，旱蓮草入肝經(jīng)血分而涼血止血，為治血熱出血之要藥，二者相伍，清熱涼血止血，直中病機(jī)。臣藥梔子清三焦之火而清熱涼血，側(cè)柏葉和槐花入血分清血熱，而涼血止血；蒲黃可活血、收斂、止血，為活血行滯之要藥，且對(duì)崩漏不止效果較好；四者炒制可入血分而清熱涼血、收斂止血，并能輔助君藥清熱涼血。佐藥：仙鶴草、拳參、大薊、陳棕炭為清熱止血佳品，且入血分而止血甚佳；丹皮與紅茜草可涼血、止血、活血之功，可防苦寒滯留、除瘀；生地養(yǎng)陰生津，涼血止血；白芍柔肝斂陰而治熱盛津傷；黃芩、貫眾苦寒，直折其火。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)止血，為婦科之良藥，與白芍、生地共伍，可養(yǎng)血而除煩，與蒲黃、丹皮同用，可理氣行滯，和血止痛，且當(dāng)歸性溫能散，味甘能緩，體潤(rùn)能補(bǔ)，引諸藥以入沖任，共奏清熱涼血止血，調(diào)經(jīng)止血之功。尹艷艷等[9]發(fā)現(xiàn)YZZXKL即婦科止血顆粒對(duì)早孕大鼠子宮出血具有較好的治療作用。本研究結(jié)果提示YZZXKL低、高劑量組大鼠陰道出血減少，凝血時(shí)間降低，激素水平升高，子宮內(nèi)膜病變減輕且有新生血管生成，表明YZZXKL可提高子宮異常出血大鼠凝血功能、抑制子宮出血量，對(duì)異常出血子宮有一定的保護(hù)作用。然而其保護(hù)作用具體機(jī)制還不甚明確，本研究對(duì)此進(jìn)行繼續(xù)探究，以期為YZZXKL走向國(guó)際化提供理論依據(jù)。

子宮異常出血機(jī)制復(fù)雜，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜血管生成障礙是造成子宮出血的主要原因之一[6]。岳明等[13]發(fā)現(xiàn)激素可使子宮局部微環(huán)境發(fā)生改變，促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮和血管再生，是徹底終止子宮出血的重要機(jī)制，其中血管生成受到VEGF等不同生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。MMPs可參與新生血管、胚胎形成以及傷口愈合[16]，黃琪等[17]發(fā)現(xiàn)黃芩炭可通過(guò)升高VEGF和降低MMP-2、MMP-9表達(dá)，降低早孕大鼠子宮出血量。本研究結(jié)果表明Model組大鼠子宮出血可能與VEGF降低和MMP-2表達(dá)升高有關(guān)。Nasirzadehd等[18]發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt-eNOS通路可參與血管生成。PI3K激活后可與Akt結(jié)合并促進(jìn)Akt磷酸化，激活的AKT可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，通過(guò)磷酸化作用激活eNOS促進(jìn)其合成一氧化氮(nitricoxide,NO)，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、增殖和防止血栓形成[19]。儲(chǔ)佳佳等[20]發(fā)現(xiàn)柚皮苷可通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路，減輕高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。本研究結(jié)果提示Model組大鼠子宮組織PI3K-Akt-eNOS通路被抑制，YZZXKL降低大鼠子宮出血量的作用，可能是通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路蛋白表達(dá)，促進(jìn)子宮組織血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，本研究設(shè)置PI3K-Akt通路抑制劑LY研究，結(jié)果表明PI3K抑制劑可阻滯YZZXKL對(duì)PI3K/Akt通路的激活作用，減弱其對(duì)子宮出血大鼠的保護(hù)作用。進(jìn)一步提示YZZXKL對(duì)異常出血的保護(hù)作用可能通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)論與啟示

YZZXKL可提高子宮異常出血大鼠凝血功能和激素水平，改善出血情況，可能通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS通路，促進(jìn)血管生成實(shí)現(xiàn)。為闡明YZZXKL治療子宮出血機(jī)制提供了一定參考價(jià)值。但PI3K-Akt-eNOS通路，促進(jìn)血管生成抑制出血的機(jī)制十分復(fù)雜，且中藥治療疾病具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用，YZZXKL還可能通過(guò)其他途徑抑制子宮出血，有待后續(xù)深入研究。