吳宜芬 王小平

（江蘇句容市糧食局中心化驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212400）

玉米赤霉烯酮是由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌和蘭線鐮刀菌等真菌所產(chǎn)生的具有雌激素毒性作用的真菌毒素。GB 2761－2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定食品中玉米赤霉烯酮限量為60 μg/kg。每年國家糧食和物質(zhì)儲備局都要組織人員對新收獲糧食的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測，這既能為全面了解我國糧食品種質(zhì)量情況，促進(jìn)產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)化發(fā)展，科學(xué)地調(diào)整糧食種植結(jié)構(gòu)，以優(yōu)質(zhì)的糧油產(chǎn)品來提高食用安全；又能為貫徹國家糧油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，確保國家糧食安全和嚴(yán)防糧食質(zhì)量安全風(fēng)險。

2020 年6 月，江蘇省糧食和物資儲備局下達(dá)了蘇糧發(fā)［2020］34 號《關(guān)于開展專項(xiàng)行動進(jìn)一步加強(qiáng)糧食質(zhì)量安全監(jiān)管的緊急通知》文件要求嚴(yán)把收購入庫關(guān)口，把小麥中玉米赤霉烯酮列入入庫必檢項(xiàng)目。在2020 年夏糧入庫工作中，句容市糧食局中心化驗(yàn)室承擔(dān)了國家新收獲糧食質(zhì)量的部分安全監(jiān)測任務(wù)，主要負(fù)責(zé)小麥玉米赤霉烯酮的檢測，共檢測小麥樣品300 余份，得到了一些用液相色譜法測定玉米赤霉烯酮的經(jīng)驗(yàn)。

1 測定原理、儀器、試劑與配制

1.1 測定原理

小麥中玉米赤霉烯酮經(jīng)乙腈水提取、免疫親和柱凈化后，用液相色譜熒光檢測器測定。樣品溶液中的各組分經(jīng)過反復(fù)多次的吸附—解吸分配過程，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，樣品通過檢測器時的濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式展現(xiàn)，再經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理，按保留時間定性、外標(biāo)法定量，從而得到被測組分含量。

1.2 儀器

安捷倫1260 液相色譜，配有FLD 熒光檢測器；天平，感量 0.01 g、0.0001 g；試管研磨機(jī)、離心機(jī)、超聲洗滌儀、抽濾裝置、200 μL 和1000 μL 移液槍 、直徑 11 cm 孔徑 1.5 μm 玻璃纖維濾紙、20 mL 注射器、50 mL 聚丙烯刻度離心管、玉米赤霉烯酮免疫親和柱等。

1.3 試劑的配制

甲醇—水溶液：量取65 mL 甲醇加入到35 mL水中，混勻。

10%異丙酮（介質(zhì)為水）：吸取1mL 異丙酮用水定容至10 mL。

乙腈—水溶液：量取90 mL 乙腈加入到10 mL水中，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)品：玉米赤霉烯酮母液20.52 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品梯度設(shè)置在待測物響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。

2 樣品制備

采集2020 年6—8 月句容市新收獲糧食和夏糧入庫混合小麥樣品300 余份。

2.1 樣品預(yù)處理

2.1.1 去除雜質(zhì)

雜質(zhì)是指小麥以外的其他物質(zhì)，包括篩下物、無機(jī)雜質(zhì)和有機(jī)雜質(zhì)等。首先分取大樣1200 g，分4 次篩選，每次約300g，撿出篩上大型雜質(zhì)并棄除下層篩下物，合并上下層篩上的糧食籽粒測定容重，然后再進(jìn)行分樣，部分樣品留作水分和不完善粒測定，部分樣品按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定撿出所有雜質(zhì)后作為凈小麥留作粉碎。

2.1.2 粉碎

取不少于500 g 的樣品，用試管研磨機(jī)將其粉碎（細(xì)度通過40 目），混合均勻后縮分至100 g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供玉米赤霉烯酮提取用。

2.2 檢測方法

水分按GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》執(zhí)行。

容重按GB/T 5498—2013《糧食檢驗(yàn) 容重》執(zhí)行。

不完善粒按GB/T 5494—2019《糧食檢驗(yàn) 糧食、油料的雜質(zhì)、不完善粒檢驗(yàn)》執(zhí)行。

玉米赤霉烯酮按GB 5009.209—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測定》液相色譜法執(zhí)行。

3 測定步驟

3.1 樣品的提取凈化

3.1.1 樣品提取步驟

稱取 40 g（準(zhǔn)確到 0.1 g）磨碎試樣于250 mL具塞三角瓶中→加入4 g 氯化鈉→加乙腈水100 mL混勻→振蕩或渦旋 15 min→提取液倒入試管中離心10 min（6000 r/min）或過濾；準(zhǔn)確吸取濾液10 mL于100 mL 玻璃試管中再加入40 mL 純水混勻→用玻璃纖維濾紙過濾于50 mL 潔凈試管中備用。

3.1.2 樣品凈化步驟

（1）連接洗脫：泵操作→將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫→棄去免疫親和柱內(nèi)原有液體→剪去螺紋突出部分→針筒裝連接親和柱放在樣品架上→準(zhǔn)確移取上述濾液10 mL→開泵（根據(jù)液體流速調(diào)節(jié)泵的開關(guān)）→樣液以1 滴/s 流速通過親和柱。

（2）純水淋洗：分2 次吸取純水各10 mL→以2滴/s 流速通過親和柱→淋洗結(jié)束取下針筒和親和柱→再用原鏈接針筒排空水分。

（3）甲醇淋洗：將用純水淋洗過的親和柱放入小試管架→注入2.0 mL 色譜純甲醇于親和柱中（以自然重力下滴）→凈化樣液直接進(jìn)液相小瓶→凈化樣液上機(jī)待測。

3.2 液相色譜儀的操作條件

色譜柱，C18 柱、柱長 150 mm×4.6、粒度 4 μm；流動相，V甲醇∶V水=65∶35；流速，1.0 mL/min；柱溫，35 ℃；進(jìn)樣量，20 μL；激發(fā)波長，274 nm；樣品采集時間，11 min。

3.3 測定步驟

3.3.1 軟件操作

先管沖洗：開啟儀器狀態(tài)準(zhǔn)備就緒后，用四元泵右擊方法扭松排液閥，改流量5.000，A 管應(yīng)用（約2 min 氣泡排完）；B 管輸100 應(yīng)用，氣泡排空后改0；C 管、D 管依次沖洗；再進(jìn)行柱沖洗，改流量1.000，改B 管65（甲醇水為流動相）應(yīng)用，關(guān)排液閥，沖洗20 min。

3.3.2 樣品盤設(shè)置（P1 盤和P2 盤可隨意放置）

如采用 P1 盤，可以 P1a1 空白；P1a2 至 P1a7 校正標(biāo)準(zhǔn)；P1a8 樣品依次排列。

3.3.3 樣品檢測

在線信號選擇FLD，基線走平后點(diǎn)擊運(yùn)行；樣品自動檢測。

3.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)選擇關(guān)聯(lián)全部；打開測試的所有標(biāo)樣和樣品，選用GC/CC 定量，調(diào)用前處理，方法另存輸文件名保存；看色譜圖：根據(jù)被測物出峰時間刪去多余雜峰，應(yīng)用空白扣除，所有進(jìn)樣使用指定空白；點(diǎn)擊色譜圖中的留用峰，峰作為化合物添加到方法；輸入有關(guān)信息，點(diǎn)重新處理全部。結(jié)果見表1。

表1 部分小麥樣品玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果

4 監(jiān)控結(jié)果有效性

應(yīng)用GB 5009.209—2016 中的液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮含量，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對檢測過程的各個環(huán)節(jié)需進(jìn)行有效控制，以確保儀器的性能及整個檢測工作質(zhì)量能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

4.1 加標(biāo)回收

用液相色譜法測定玉米赤霉烯酮的樣品前處理比較復(fù)雜，稍有操作不當(dāng)就會導(dǎo)致樣品含量損失或污染，因此加標(biāo)回收是最好的驗(yàn)證方法。通過回收率可找出實(shí)驗(yàn)中各環(huán)節(jié)存在的問題，控制實(shí)驗(yàn)誤差，達(dá)到檢測人員能提供可靠數(shù)據(jù)的要求。表2 為加標(biāo)回收驗(yàn)證結(jié)果。

表2 加標(biāo)回收驗(yàn)證結(jié)果

從表2 可以看出，空白加標(biāo)、試樣加標(biāo)、樣品洗脫液加標(biāo)均符合GB/T 27404—2008 附錄F 規(guī)定的回收率范圍（80.0%～110.0%），說明液相色譜法測定玉米赤霉烯酮操作技術(shù)水平符合規(guī)范要求。

4.2 質(zhì)量控制樣品驗(yàn)證

質(zhì)量控制樣品驗(yàn)證對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密性起著關(guān)鍵作用。在實(shí)驗(yàn)中購置已知濃度樣品，將與試驗(yàn)樣品在相同條件下測試，驗(yàn)證其質(zhì)量控制樣品的實(shí)際檢測數(shù)據(jù)與給定的檢測數(shù)據(jù)是否一致（誤差在允許范圍），以判斷這次檢測過程的準(zhǔn)確性和樣品數(shù)據(jù)的可信度。表3 是本次研究的質(zhì)量控制樣品檢測結(jié)果。

從表3 中可以看出，質(zhì)量控制樣品再測數(shù)據(jù)在可控范圍內(nèi)，符合GB 5009.209 重復(fù)條件下兩次獨(dú)立測定結(jié)果絕對差值不超過算術(shù)平均值15 %的規(guī)定要求，驗(yàn)證了液相色譜法測定玉米赤霉烯酮操作正確、技術(shù)過關(guān)、數(shù)據(jù)可靠。

表3 質(zhì)量控制樣品驗(yàn)證結(jié)果

5 應(yīng)用與分析

5.1 脫氣處理采用流動相，以提高檢測靈敏度

流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，除去其中溶解的氣體，以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析；溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。

5.2 選擇合適標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度，以取得標(biāo)準(zhǔn)品良好線性

選用合適的標(biāo)準(zhǔn)梯度，保證樣液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，使校正曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 以上，確保樣品檢測結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性。

5.3 采用適當(dāng)溶液比例流動相，以獲得較好峰形

改善峰形是提高靈敏度和定量分析精確度的目的。在實(shí)際檢測過程中，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和具體情況調(diào)整流動相的配比，樣品的出峰時間和峰形與流動相的極性有很大關(guān)系，峰的保留時間6～15 min 為宜；色譜峰區(qū)域?qū)挾仁欠磻?yīng)色譜分離條件好壞的重要參數(shù)，要使其達(dá)到峰高的0.607 處的要求。

5.4 進(jìn)行監(jiān)控結(jié)果有效性控制，以檢測工作質(zhì)量

為確保檢測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和科學(xué)性，使檢檢工作有序、有效進(jìn)行，在檢測工作過程中必須對各個環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控結(jié)果有效性控制。加標(biāo)回收和開展質(zhì)量控制樣品驗(yàn)證是確保檢測工作質(zhì)量的具體措施，是衡量檢測人員業(yè)務(wù)技術(shù)水平的有效手段。只有選用得當(dāng)?shù)臋z測方法，準(zhǔn)確掌握儀器的使用性能，檢測人員才能熟能生巧。同時實(shí)驗(yàn)環(huán)境能滿足儀器運(yùn)行條件，對監(jiān)控結(jié)果能實(shí)施有效性控制，才能確保玉米赤霉烯酮液相色譜法的準(zhǔn)確性和可靠性。