吳 琳 張渭波 行艷麗 李 艷 趙美峰 姚 歡
1.陜西省咸陽市中心醫(yī)院藥學(xué)部,陜西咸陽 712000;2.陜西省咸陽市中心醫(yī)院病理科,陜西咸陽 712000
陽和湯出自清代王維德的《外科證治全生集》[1],由麻黃、肉桂、鹿角膠、熟地、炮姜炭、白芥子、生甘草組成,具有溫陽散寒、活血通絡(luò)、化痰散結(jié)的功效,是治療陰疽的經(jīng)典效方。陰疽病變部位往往堅(jiān)硬如石且漫腫不紅,多為陰痰郁滯氣血、阻隔經(jīng)絡(luò)所致,相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤[2-3]。近年來,陽和湯廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療[4-5],相關(guān)研究[6-7]顯示,其在腫瘤治療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。有研究顯示,陽和湯治療腫瘤的具體病種中,肺癌的使用頻率位居第二,僅次于乳腺癌,占比為28.6%[8]。隨著研究的深入,腫瘤免疫微環(huán)境已被視為腫瘤的“第七大標(biāo)記性特征”,在腫瘤形成及進(jìn)展中發(fā)揮著非常重要的作用[9-10]。近年來,中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境方面具有重要的作用[11-12],因此本研究擬觀察陽和湯對Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應(yīng),對腫瘤免疫微環(huán)境中白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transformed growth factor-β,TGF-β)的表達(dá)及對細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory cell,Treg)的影響,以期為陽和湯治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
一月齡SPF 級C57BL/6 小鼠50 只,雄性,體重18~22 g,購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號SCXK(陜)2018-001,合格證號410021003105 279。飼養(yǎng)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房(溫度22~27℃,相對濕度45%~66%),小鼠可自由飲水并攝取食物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司。
陽和湯由熟地30 g、鹿角膠9 g、白芥子6 g、肉桂3 g、生甘草3 g、麻黃2 g、炮姜炭2 g 組成,藥材均購于西安中藥飲片有限責(zé)任公司,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室鑒定,按上述劑量稱取,根據(jù)常規(guī)方法煎煮(鹿角膠打粉烊化),濃縮至2.75、1.84、0.92 g/ml 的藥液,置于4℃冰箱備用。環(huán)磷酰胺片(50 mg/片)購于通化茂祥制藥有限公司(201902)。
Rabbit anti-mouse IL-2(江蘇親科生物研究中心有限公司,AF5105);Rabbit anti-mouse TGF-β(博士德生物工程有限公司,BA0290);Rabbit anti-mouse CD3(江蘇親科生物研究中心有限公司,DF6594);Rabbit anti-mouse CD25(江蘇親科生物研究中心有限公司,DF7132);Rabbit anti-mouse CD4(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,BF0174);Rabbit anti-mouse CD8(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,EC6872);Rabbit anti-mouse FoxP3(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,AF6544);Rabbit IgG-SABC-FITC kit(江蘇親科生物研究中心有限公司,S0011);DAPI 染色液(博士德生物工程有限公司,AR1176)。
CO2培養(yǎng)箱(美國Thermoe scientifican 公司,CCB-150 型);離心機(jī)(德國Eppendorph 公司,Centrifuge 5427R);電子精密天平(德國Sartorius 公司,bsa423s,精度0.01 g);石蠟切片機(jī)(德國Leica 公司,RM2235);生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司,TC-120S);自動(dòng)恒溫烘片儀(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司,TK-213)。
將培養(yǎng)濃度為2×107/ml Lewis 肺癌細(xì)胞懸液0.2 ml分別接種在適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后的50 只雄性C57BL/6小鼠右側(cè)前腋皮下以形成Lewis 肺癌荷瘤模型。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為荷瘤模型組、環(huán)磷酰胺組、陽和湯高劑量組、陽和湯中劑量組和陽和湯低劑量組,每組10 只。造模5 d 后用手觸摸到接種部位有結(jié)節(jié)提示造模成功,分別用生理鹽水、環(huán)磷酰胺(25 mg/kg)、陽和湯高劑量(27.5 g/kg)、陽和湯中劑量(18.3 g/kg)、陽和湯低劑量(9.2 g/kg)進(jìn)行灌胃給藥,0.2 ml/次,1 次/d,連續(xù)10 d。
1.6.1 小鼠的體重、瘤重及抑瘤率 首次給藥前及末次給藥后的第2 天分別稱量各組小鼠的體重;末次給藥后的第2 天脫頸處死小鼠剝離右側(cè)前腋下的瘤塊并稱取重量,并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(荷瘤模型組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量)/荷瘤模型組平均腫瘤重量×100%。
1.6.2 Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 的表達(dá) 對剝離并稱重后的腫瘤組織采用免疫組化法檢測IL-2和TGF-β 的表達(dá),具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件測量IOD/Area,并進(jìn)一步對腫瘤組織中表達(dá)的IL-2、TGF-β 進(jìn)行定位、定性及相對定量分析。
1.6.3 Lewis 肺癌組織中CTL 和Treg 的標(biāo)志物CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)情況 對剝離并稱重后的腫瘤組織采用免疫熒光技術(shù)檢測CTL 和Treg 的標(biāo)志物CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá),具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。結(jié)果判讀方法:在紫外光的激發(fā)下DAPI 染出的細(xì)胞核為藍(lán)色,相對熒光素標(biāo)記的紅色光為其陽性表達(dá),通過Image J 軟件做最后處理。
采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
用藥前,各組小鼠體重比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。用藥后,與荷瘤模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠體重降低(P <0.01),陽和湯高、中劑量組小鼠體重增加(P <0.05 或P <0.01);與環(huán)磷酰胺組比較,陽和湯高、中、低劑量組小鼠體重增加(P <0.01);與陽和湯高劑量組比較,陽和湯低劑量組小鼠體重降低(P <0.05)。與荷瘤模型組比較,環(huán)磷酰胺組、陽和湯高劑量組小鼠瘤重降低(P <0.05 或P <0.01);與環(huán)磷酰胺組比較,陽和湯中、低劑量組小鼠瘤重增加(P <0.05);陽和湯高劑量組小鼠瘤重與環(huán)磷酰胺組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。抑瘤率由高到底分別為環(huán)磷酰胺組、陽和湯高劑量組、陽和湯中劑量組、陽和湯低劑量組。見表1。
表1 各組小鼠體重、瘤重及抑瘤率比較
IL-2 和TGF-β 的表達(dá)位于細(xì)胞間質(zhì),呈黃色或棕黃色,見圖1~2。與荷瘤模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)降低(P <0.01),陽和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)增加(P <0.05 或P <0.01);與環(huán)磷酰胺組比較,陽和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)增加(P <0.01);與陽和湯高劑量組比較,陽和湯中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)降低(P <0.01)。與荷瘤模型組比較,環(huán)磷酰胺組,陽和湯高、中劑量組小鼠Lewis 肺癌組織TGF-β 表達(dá)降低(P <0.01);與環(huán)磷酰胺組比較,陽和湯中、低劑量組小鼠Lewis肺癌組織TGF-β 表達(dá)增加(P <0.05)。見表2。
圖1 小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果
圖2 小鼠Lewis 肺癌組織中TGF-β 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果
圖3 小鼠Lewis肺癌組織中CD3+CD8+免疫熒光結(jié)果
表2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達(dá)比較()
表2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達(dá)比較()
注:與荷瘤模型組比較,aP <0.05、bP <0.01;與環(huán)磷酰胺組比較,cP <0.05、dP <0.01;與陽和湯高劑量組比較,eP <0.01。IL-2:白細(xì)胞介素-2;TGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子-β
免疫熒光檢測中,陽和湯高劑量組CD3+CD8+的熒光強(qiáng)度強(qiáng)、密度最大;環(huán)磷酰胺組CD4+Foxp3+密度最小,其次是陽和湯高劑量組。見圖3~4(封四)。與荷瘤模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)降低(P <0.01),陽和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)增加(P<0.05 或P <0.01);與環(huán)磷酰胺組比較,陽和湯高、中、低劑量組小 鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)增加(P <0.01)。與陽和湯高劑量組比較,陽和湯中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)降低(P <0.01)。與荷瘤模型組比較,環(huán)磷酰胺組,陽和湯高、中劑量組小鼠Lewis肺癌組織CD4+Foxp3+表達(dá)降低(P <0.05 或P<0.01)。見表3。
表3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)比較()
表3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)比較()
注:與荷瘤模型組比較,aP <0.05、bP <0.01;與環(huán)磷酰胺組比較,cP <0.01;與陽和湯高劑量組比較,dP <0.01
Stephen Paget 在1889 年提出的“種子與土壤”假說,為腫瘤微環(huán)境概念的提出奠定了基礎(chǔ)[13]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞形成和增殖過程中所依賴的生長環(huán)境,是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[14-15],是機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要場所,是抗腫瘤免疫的重要部分[16-17]。其中由免疫相關(guān)細(xì)胞和因子及其他活性成分構(gòu)成的“腫瘤免疫微環(huán)境”影響著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18-19]。在腫瘤免疫微環(huán)境中,CTL 在抗腫瘤免疫應(yīng)答中對腫瘤細(xì)胞具有高度特異性和殺傷效應(yīng),與自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞共同發(fā)揮抗腫瘤作用[20],該細(xì)胞主要標(biāo)志物為CD3+CD8+。IL-2 又稱T 細(xì)胞生長因子,能促進(jìn)CTL 和NK 細(xì)胞活化和增殖[21-22],介導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒效應(yīng)。Treg 是一類具有免疫抑制功能的CD4+T 細(xì)胞功能亞群,其中表達(dá)CD4+Foxp3+的Treg 通過產(chǎn)生TGF-β 等細(xì)胞因子對腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮免疫抑制作用[23-24]。同時(shí)TGF-β 又可誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞的擴(kuò)增[25]。
環(huán)磷酰胺的細(xì)胞毒性免疫抑制雖然有顯著的抑瘤效應(yīng),但能降低荷瘤小鼠體重和腫瘤免疫微環(huán)境中IL-2、TGF-β 表達(dá)及CTL、Treg 的含量。高劑量陽和湯在抑瘤效應(yīng)方面與環(huán)磷酰胺比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),且不影響荷瘤小鼠的體重,并能促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的IL-2 表達(dá)和CTL 增加,降低腫瘤免疫微環(huán)境中具有抑制作用的TGF-β表達(dá)及Treg 的含量。陽和湯中、低劑量的抑瘤效應(yīng)不是很明顯,但在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中IL-2、TGF-β的表達(dá)和CTL、Treg 的含量方面發(fā)揮著一定的作用,且不影響荷瘤小鼠的體重。本研究結(jié)果顯示,陽和湯對荷瘤小鼠的Lewis 肺癌組織具有一定的抑制作用。其抑制腫瘤的機(jī)制可能與影響腫瘤免疫微環(huán)境中IL-2、TGF-β 表達(dá)及CTL、Treg 的含量有關(guān)。應(yīng)進(jìn)一步開展陽和湯對腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫相關(guān)細(xì)胞和因子及其它活性成分的影響研究,以深入探討其抑瘤作用機(jī)制。