李諺語(yǔ)，劉 麗，范 穎，李 軍，張英利，盧 健

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847）

肝臟是人體主要的代謝器官，肝損傷常見(jiàn)的原因有病毒感染、創(chuàng)傷、及化學(xué)中毒等[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年10萬(wàn)人中約有13．9～24．0人發(fā)生藥物性肝損[2]。因此尋求抗肝損傷，抗肝纖維化的藥物日益受到關(guān)注。保肝湯由黃芪、葛根、枸杞子、五味子等組成，具有疏肝理氣、清熱解毒的功效。本研究旨在分析中藥保肝湯對(duì)四氯化碳（CCl4）致慢性化學(xué)性肝損傷小鼠的肝臟保護(hù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠84只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 保肝湯：由黃芪、葛根、枸杞子、五味子等組成（飲片購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）。用10倍蒸餾水浸泡上述飲片30min，煎煮1h，過(guò)濾，取濾液；再加8倍蒸餾水于藥渣，煎煮40 min，過(guò)濾，取濾液；合并兩次煎煮濾液，濃縮，分別配置高、中、低劑量灌胃藥液，備用。其中高、中、低劑量組灌胃藥液濃度分別為含生藥 0．024 g/mL、0．012 g/mL、0．006 g/mL。護(hù)肝片：由柴胡、茵陳蒿、板藍(lán)根、綠豆、五味子、豬膽粉組成（批號(hào)：201405080，購(gòu)自黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司）。將護(hù)肝片配制成濃度為含生藥0．006 g/mL的溶液，備用。

1.3 主要試劑 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)試盒（1113051，南京建成生物工程研究所）；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)試盒（CH0105202，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）測(cè)試盒（20140530，南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（20140529，南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：201404，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；甘油三酯（TG）測(cè)試盒（批號(hào)：1213061，南京建成生物工程研究所）。

1.4 主要儀器與設(shè)備 電子天平（ALC-210．3，賽多利斯科學(xué)儀器）；臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（TGL20M-Ⅱ，湖南省凱達(dá)實(shí)業(yè)以展）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 13R，上海力申科學(xué)儀器）；全自動(dòng)生化儀（TBA-40FR，日本東芝）；-80℃冰箱（DWHL38，中科美菱）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（SHA-C，常州國(guó)華電器）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組方法 將84只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、護(hù)肝片組、保肝湯高劑量組、保肝湯中劑量組、保肝湯低劑量組，每組14只。

2.2 造模與給藥方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常組外，其余各組分別在實(shí)驗(yàn)第 1、3、10、16、22、25、28天腹腔注射0.5%CCl4；于造模后第10天開(kāi)始灌胃，其中正常組和模型組給予蒸餾水（0.01 mL/g）灌胃，護(hù)肝片（0.5 g/kg）及保肝湯高劑量組（32 g/kg）、保肝湯中劑量組（16 g/kg）、保肝湯低劑量組（8 g/kg）分別給予灌胃藥液。第30天灌胃2 h后稱質(zhì)量，腹主動(dòng)脈取血，于肝左、右中葉、尾狀葉各取材1塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，待測(cè)病理；將取材后的肝臟以冷生理鹽水沖洗后，置低溫冰箱保存，待測(cè)指標(biāo)。

2.3 病理組織學(xué)檢測(cè)及肝臟指數(shù)計(jì)算 病理組織學(xué)檢測(cè)：取4%多聚甲醛溶液中固定的肝組織用石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察。

計(jì)算肝指數(shù)：肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/進(jìn)食體質(zhì)量[3]。

2.4 指標(biāo)測(cè)定 采用基于IFCC2002配方法檢測(cè)血清ALT、AST的活性；采用抽提法測(cè)定SOD，采用TBA法測(cè)定MDA含量；嚴(yán)格按試劑盒操作。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)肝組織病理的影響 在光學(xué)顯微鏡下觀察，模型組中央靜脈和肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變形明顯，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核變大，肝細(xì)胞界限不清，有的部位核仁消失，可見(jiàn)多處大片肝細(xì)胞脂肪變性，并見(jiàn)多處灶狀壞死。表明實(shí)驗(yàn)造模成功。保肝湯各劑量組與模型組比較在肝組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)上均有所改善，中、低劑量組肝組織鏡下改變明顯肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常，散見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性。見(jiàn)圖1。

3.2 對(duì)肝指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組及保肝湯高、中、低劑量組肝指數(shù)升高明顯（P＜0.05）；與模型組比較，保肝湯無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3.3 保肝湯對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT、AST、AST/ALT的影響

3.3.1 對(duì)ALT的影響 與正常組比較，模型組ALT明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，保肝湯高、中、低劑量組ALT均明顯降低（P＜0.05）。保肝湯中劑量組比低劑量組明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

3.3.2 對(duì)AST的影響 與正常組比較，模型組AST顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，保肝湯中劑量組AST明顯降低（P＜0.05）；保肝湯中劑量組AST值低于保肝湯低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 保肝湯對(duì)小鼠肝組織形態(tài)的影響（肝組織HE,×400）Fig.1 Effect of Baogan Decoction on the morphology of liver tissueof mice(HE,×400 of liver tissue)

表1 對(duì)肝指數(shù)的影響（s）Tab.1 Influenceon liver index（±s）

表1 對(duì)肝指數(shù)的影響（s）Tab.1 Influenceon liver index（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 肝指數(shù)（%）正常組 14 4.10±0.33模型組 12 4.56±0.48*護(hù)肝片 13 4.50±0.66保肝湯高劑量組 13 4.68±0.52保肝湯中劑量組 12 4.74±0.46保肝湯低劑量組 13 4.49±0.59

3.3.3 對(duì)AST/ALT的影響 與模型組比較，保肝湯高、中、低劑量組均顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.4 保肝湯對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清SOD、MDA、TG的影響

3.4.1 對(duì)SOD的影響 與模型組比較，保肝湯高、中、低劑量組SOD值均有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。保肝湯中劑量組與正常組比較顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表 2 對(duì) ALT、AST、AST/ALT 的影響（±s）Tab.2 Influenceon ALT、AST、AST/ALT（±s）

表 2 對(duì) ALT、AST、AST/ALT 的影響（±s）Tab.2 Influenceon ALT、AST、AST/ALT（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) ALT(U/L) AST(U/L) AST/ALT正常組 14 42.08±7.66 81.69±12.78 1.98±0.35模型組 12 54.23±12.57* 125.77±30.04* 2.52±1.35護(hù)肝片 13 37.40±6.70 100.40±21.33 2.72±0.57Δ保肝湯高劑量組 13 36.71±13.32△ 110.64±28.22 3.37±1.76△保肝湯中劑量組 12 34.71±6.26△ 97.50±21.63△ 2.87±0.66△保肝湯低劑量組 13 43.00±17.89△# 120.73±33.56# 3.01±0.85△

3.4.2 對(duì)MDA的影響 與正常組比較，模型組MAD值明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，保肝湯中劑量組和低劑量組顯著降低（P＜0．05）。保肝湯高劑量組和中劑量組比較顯著升高（P＜0．05）。見(jiàn)表3。

3.4.3 對(duì)TG的影響 與模型組比較，保肝湯高劑量組和低劑量組顯著升高（P＜0．05）。保肝湯低劑量組TG值明顯高于保肝湯中劑量組（P＜0．05）。見(jiàn)表3。

表 3 對(duì) SOD、MDA、TG 的影響（±s）Tab.3 Influence on SOD、MDA、TG（±s）

表 3 對(duì) SOD、MDA、TG 的影響（±s）Tab.3 Influence on SOD、MDA、TG（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與保肝湯中劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) SOD（U/mg） MDA（nmol/mL） TG（mmol/L）正常組 14 258.86±91.45 0.42±0.06 1.39±0.40模型組 12 272.88±25.49 0.57±0.03* 1.09±0.31護(hù)肝片 13 261.56±43.56 0.51±0.08 1.22±0.42保肝湯高劑量組 13 272.96±51.33 0.55±0.06# 1.59±0.39Δ保肝湯中劑量組 12 307.97±44.42 0.44±0.09Δ 1.30±0.30保肝湯低劑量組 13 290.25±38.67 0.48±0.07Δ 1.67±0.49△#

4 討論

CCl4是化學(xué)性肝毒劑，腹腔注射能引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的酶釋放，其分子中的三氯甲基基團(tuán)經(jīng)催化后形成三氯甲基過(guò)氧化基團(tuán)，引起了肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟損傷及肝功能異常[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制CCl4致慢性化學(xué)性肝損傷模型，研究保肝湯對(duì)CCl4致慢性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。

ALT和AST是反映肝損傷程度的指標(biāo)[6]，其中ALT是最常用的判斷肝細(xì)胞是否受損的敏感指標(biāo)；AST大幅度升高意味著肝細(xì)胞損傷的程度比較嚴(yán)重[7]。AST/ALT比值增大，說(shuō)明肝細(xì)胞損傷程度嚴(yán)重且認(rèn)為是慢性化程度加重的標(biāo)志[8]。本研究中，保肝湯高、中、低劑量組ALT水平較模型組明顯降低。保肝湯高、中、低劑量組AST水平均較模型組降低，其中保肝湯中劑量組最低。保肝湯高、中、低劑量組AST／ALT值較模型組均升高。結(jié)果表明保肝湯對(duì)小鼠肝損傷有一定保護(hù)作用；保肝湯中劑量降低肝細(xì)胞的損傷程度在保肝湯3組中效果最好；在肝損傷慢性化程度進(jìn)展上保肝湯各劑量組均無(wú)明顯作用。

SOD是一種抗氧化酶，SOD的活性可以反映自由基的清除率。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，間接反應(yīng)肝損傷程度[9-11]。TG在肝臟、脂肪等組織中進(jìn)行合成，肝臟也將血液中的糖類轉(zhuǎn)化為TG。本研究中，模型組SOD稍升高，和空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與其他實(shí)驗(yàn)研究趨勢(shì)不同[12-13]，考慮是CCl4進(jìn)入機(jī)體后激活了機(jī)體的氧化應(yīng)激信號(hào)通路，引起SOD應(yīng)激性升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保肝湯中劑量組SOD明顯升高，MDA值最低，可見(jiàn)，保肝湯中劑量組的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物最少，脂質(zhì)過(guò)氧化程度最輕，對(duì)清除自由基、抑制自由基啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)效果最好。此外，保肝湯高劑量組和低劑量組與模型組比較TG值顯著升高，說(shuō)明保肝湯高、低劑量組對(duì)肝臟的作用傾向于提高肝臟對(duì)TG的合成。

由此可見(jiàn)，保肝湯能夠減輕CCl4對(duì)小鼠肝細(xì)胞的損傷程度，并具有一定的保肝作用，其中，以保肝湯中劑量組作用最優(yōu)；作用機(jī)制與抑制肝損傷后脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。