郭勝超

摘? ? 要：PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物的很多領(lǐng)域，也是命制生物高考試題的重要素材來(lái)源。本文從高中生物試題的角度，分析介紹PCR衍生技術(shù)的原理、步驟和應(yīng)用，旨在引導(dǎo)廣大教師和學(xué)生關(guān)心和關(guān)注日新月異的生物科技發(fā)展，提高學(xué)生的生物學(xué)核心素養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：PCR;引物;擴(kuò)增;考查載體

PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）的縮寫，該技術(shù)是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年發(fā)明的?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)鑒定、環(huán)境監(jiān)測(cè)、分子克隆、基因序列分析、考古學(xué)等重要領(lǐng)域。PCR技術(shù)促進(jìn)了分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，也是高考評(píng)價(jià)體系中考查載體的重要來(lái)源。目前PCR的衍生技術(shù)種類繁多（見表1），本文針對(duì)常見的PCR技術(shù)在命制高中生物試題中的應(yīng)用進(jìn)行了整理和分析。

例1? 新冠疫情的快速控制，離不開政府的科學(xué)決策和我國(guó)對(duì)新冠病毒（RNA病毒）的快速檢測(cè)能力。熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接受到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成（如圖1）。隨著PCR的進(jìn)行，熒光信號(hào)的強(qiáng)度也等比例增加，可通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖（如圖2）。Ct值（循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說(shuō)法不正確的是（C）

A.檢測(cè)新冠病毒時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNA

B.PCR的每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸3個(gè)階段

C.Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性越高

D.圖2出現(xiàn)平臺(tái)期的最可能原因是反應(yīng)體系中的引物、探針數(shù)量一定

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RT-PCR）

新冠病毒屬于RNA病毒，在例1的檢測(cè)中涉及到逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)。其步驟如圖3所示：（1）逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程需要加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物P1和原料，將新冠病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。（2）再以cDNA為模板，利用引物P2合成目的基因片段。（3）利用引物P1和P2對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)行上述操作，選用的模板RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。

考查載體：逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)可用于獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)等，還可以用來(lái)分析不同組織細(xì)胞，或是相同組織細(xì)胞在不同發(fā)育階段中mRNA表達(dá)情況。

2.熒光定量PCR（RTFQ-PCR）

例1中的熒光定量PCR技術(shù)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，利用熒光探針（熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的DNA單鏈，它的兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，如圖2所示）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，推測(cè)待測(cè)樣品濃度的方法。每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成。根據(jù)題干信息可知，待檢測(cè)樣本中的病毒越多，每次消耗的熒光探針就越多，發(fā)出的熒光越強(qiáng)，達(dá)到設(shè)定熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)就越小，即Ct值越小。在PCR過(guò)程中為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般要達(dá)到或超過(guò)閾值時(shí)才能確診。當(dāng)PCR擴(kuò)增到一定輪次，加入的探針或引物消耗殆盡，熒光強(qiáng)度將達(dá)到最大值，即出現(xiàn)圖2中“平臺(tái)期”。

考查載體：熒光定量PCR可用于人和動(dòng)物疾病的診斷、食品中微生物的達(dá)標(biāo)檢測(cè)、分子生物學(xué)中的定量研究等領(lǐng)域。

例2（2020年江蘇高考題節(jié)選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖（以EcoR I酶切為例），請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是②④（從引物①②③④中選擇，填編號(hào)）。

3.反向PCR技術(shù)（Inverse PCR）

例2主要考查了反向PCR技術(shù)的應(yīng)用。常規(guī)的PCR技術(shù)是直接擴(kuò)增兩引物之間的已知DNA片段，而該技術(shù)是利用擴(kuò)增引物向相反方向擴(kuò)增未知DNA序列（如圖4），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知序列進(jìn)行分析和研究的目的。因此上述試題中要選擇②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'和④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'作為引物。

在進(jìn)行反向PCR技術(shù)時(shí)，先選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用DNA連接酶使帶有黏性末端的靶序列環(huán)化連接，再根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，最后擴(kuò)增出已知序列上游和下游的未知序列。

考查載體：反向PCR技術(shù)還可用于已知序列的上、下游未知序列的測(cè)定，還可用來(lái)制備未知序列的探針。

例3大引物PCR定點(diǎn)突變常用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，過(guò)程如圖5所示。下列敘述正確的是（不定項(xiàng)選擇）（BD ）

A.第一輪PCR過(guò)程中復(fù)性所用的溫度與第二輪PCR復(fù)性的溫度是一樣的。

B.PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分子上才能表達(dá)出相應(yīng)的性狀，該定點(diǎn)誘變產(chǎn)物需具備啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。

C.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈。

D.將某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），屬于蛋白質(zhì)工程。

4.編碼基因的特異性定點(diǎn)突變

編碼基因的特異性定點(diǎn)突變是指通過(guò)PCR等方法，插入、去除或替換個(gè)別核苷酸，最終獲得突變的基因。定點(diǎn)突變技術(shù)的類型很多，例3中是借助大引物進(jìn)行PCR定點(diǎn)突變，大致步驟是（如圖6）：（1）先合成一段含突變核苷酸的DNA引物P1，并將其雜交到目的基因的DNA單鏈上，引物上的個(gè)別突變核苷酸不會(huì)影響其與DNA單鏈結(jié)合。（2）利用突變引物P1與側(cè)翼引物P2，通過(guò)第一階段的PCR擴(kuò)增出如圖所示的DNA分子。（3）利用第一階段的PCR產(chǎn)物的單鏈作為引物，配合側(cè)翼引物P3，通過(guò)第二階段的PCR擴(kuò)增出突變基因。精確設(shè)計(jì)引物是成功的關(guān)鍵，該方法操作簡(jiǎn)單，突變的成功率較高。

考查載體：編碼基因的特異性定點(diǎn)突變常用于蛋白質(zhì)工程，通過(guò)基因定點(diǎn)突變改變編碼基因的堿基序列，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)分子中某活性部位的1個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基序列的改變。

5.融合PCR技術(shù)

PCR技術(shù)除了可以實(shí)現(xiàn)編碼基因的特異性定點(diǎn)突變，還可以通過(guò)PCR的方法實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的融合，即融合PCR技術(shù)。以圖7為例，要實(shí)現(xiàn)基因A和B的融合，需要先設(shè)計(jì)的P2引物含有基因B片段的一部分，P3引物含有基因A片段的一部分。通過(guò)PCR擴(kuò)增就能分別得到含有B基因片段序列的A基因和含有A基因片段序列的B基因。然后分別取基因A、B的PCR產(chǎn)物單鏈搭連，互為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到融合基因A-B。最后加入引物P1和P4進(jìn)行PCR，得到多個(gè)融合基因A-B的拷貝。

圖7

考查載體：隨著技術(shù)的發(fā)展，融合PCR技術(shù)逐步應(yīng)用于基因敲除、基因標(biāo)記、基因內(nèi)部點(diǎn)突變、兩種基因融合等領(lǐng)域。

PCR的衍生技術(shù)還有很多，這里不再贅述。隨著新課程改革的深入推進(jìn)，高考試題的命制越來(lái)越體現(xiàn)時(shí)代性和創(chuàng)新性，緊密結(jié)合科學(xué)技術(shù)前沿理論和工程技術(shù)領(lǐng)域，綜合考查學(xué)生的學(xué)科核心素養(yǎng)。建議教師多收集與教材知識(shí)聯(lián)系密切的生物科技素材，簡(jiǎn)化整理后介紹給學(xué)生，培養(yǎng)學(xué)生快速獲取相關(guān)的生物學(xué)信息和知識(shí)遷移的能力。

編輯/魏繼軍