周 鵬，李 飛，黃 婧，趙 青，張 敏*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

烏飯樹(VacciniumbracteatumThunb.)為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬常綠灌木，主要分布于長江以南低海拔山地[1]。作為我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，具有極高的食用和藥用價(jià)值。烏飯樹葉在我國食用歷史悠久，江、浙、閩一帶素有用烏飯樹嫩葉制作烏米飯食用的習(xí)俗[2]，葉片提取物已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如烏飯米、烏飯粽、烏飯酒等，具有較大的市場前景。研究表明，烏飯樹葉不僅含有豐富的類黃酮化合物，還含有萜類、甾醇、有機(jī)酸和氨基酸等次生代謝產(chǎn)物，以及豐富的糖類、蛋白質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，極具保健藥用價(jià)值，開發(fā)利用前景廣闊[3-4]。然而，目前有關(guān)烏飯樹的報(bào)道主要集中在類黃酮化合物提取[5]及其抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等藥理研究等方面，對(duì)其他活性成分的研究還有待探索。

氨基酸廣泛存在于植物組織細(xì)胞中，除參與合成蛋白質(zhì)外，在植物的生長發(fā)育、物質(zhì)代謝和營養(yǎng)價(jià)值等方面起著非常重要的作用[8]。游離氨基酸是一種重要生物活性物質(zhì)，可被人體直接吸收，具有重要的生理功能和藥用價(jià)值，其組成與含量是評(píng)價(jià)食品營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，不僅能判斷食品的營養(yǎng)狀況，而且作為食品加工或中藥炮制過程中參與美拉德反應(yīng)的底物之一，與食品的風(fēng)味和藥物的藥效有著密切的關(guān)系[9-10]。前期有學(xué)者對(duì)烏飯樹葉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)烏飯樹葉蛋白中氨基酸種類比較齊全[11]。但至今有關(guān)烏飯樹葉中游離氨基酸的研究尚未見報(bào)道，因此，對(duì)烏飯樹葉片中游離氨基酸組成種類和含量等品質(zhì)指標(biāo)開展研究，對(duì)提高其種質(zhì)資源開發(fā)利用具有重要意義。

本研究收集了5個(gè)產(chǎn)地的烏飯樹葉材料，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀分析測定其游離氨基酸組成和含量，并利用主成分分析法對(duì)不同產(chǎn)地烏飯樹葉游離氨基酸品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為從氨基酸的角度科學(xué)評(píng)價(jià)烏飯樹葉的食藥用價(jià)值及優(yōu)良種質(zhì)資源的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏飯樹葉采自湖南白云山、安徽黃山、江西上猶、江蘇溧陽以及安徽宣城5個(gè)產(chǎn)地。采集時(shí)用硅膠保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，擦拭干凈，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過60目篩備用。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%)購于北京盛世康普化工技術(shù)研究院；水合茚三酮(99%純度)、磺基水楊酸、鹽酸、檸檬酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀(日本日立高新技術(shù)公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；EPED-E1-20TF型實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；SQP型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9423A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵(鞏義市矛華儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離氨基酸測定的樣品制備 準(zhǔn)確稱取0.300 g烏飯樹葉干燥粉末于試管中，加入45 mL沸蒸餾水，并立刻移入沸水浴中浸提45 min(每隔10 min搖動(dòng)1次)，過濾，定容50 mL，搖勻。取25 mL待測樣液，加入22.5 mL的10% 磺基水楊酸，5 000 rpm離心20 min，取上清液，凍干后，加入1 mL樣品稀釋液溶解，過0.22 μm水系微孔濾膜，上機(jī)待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和茚三酮溶液的制備 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μmol/mL)：分別準(zhǔn)確稱取單個(gè)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 01 g)共同置于50 mL燒杯中，用8.3 mL 6 mol/L鹽酸溶液溶解，用水稀釋定容250 mL，混勻；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 nmol/mL)：準(zhǔn)確吸取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL，用pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液定容10 mL，混勻，為標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)液。1% 茚三酮溶液：準(zhǔn)確稱取1 g水合茚三酮，用1 mol/L乙酸鋰-二甲基亞砜溶液定容100 mL，溶解后倒入棕色瓶中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 氨基酸自動(dòng)分析條件 采用L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析測定，試驗(yàn)方法參照劉偉等[12]，并用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行初步數(shù)據(jù)整理。檢測波長為440，570 nm，柱溫57 ℃，反應(yīng)柱溫度135 ℃，分離柱為陽離子交換樹脂2619，茚三酮溶液流速為0.35 mL/min，緩沖液流速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。采用系統(tǒng)自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)每個(gè)樣品圖譜進(jìn)行積分后選定校正文件進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。參照薛敏等[13]的方法進(jìn)行游離氨基酸品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，依據(jù)方差累計(jì)貢獻(xiàn)率≥85%的標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，以各主成分對(duì)應(yīng)的方差相對(duì)貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，并利用各主成分得分和相應(yīng)權(quán)重相乘后求和得到綜合評(píng)價(jià)函數(shù)來進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地烏飯樹葉游離氨基酸組分和含量

由表1可知，從烏飯樹葉中共檢測出27種游離氨基酸，其中包括7種人體必需氨基酸，分別為亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸、色氨酸、蛋氨酸以及苯丙氨酸；7種非必需氨基酸，分別為甘氨酸、組氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸及胱氨酸；以及?；撬帷⒘姿峤z氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、磷酸乙醇胺、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、α-氨基己二酸、γ-氨基丁酸、β-氨基異丁酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸及鳥氨酸等具有重要生物學(xué)意義的游離氨基酸。不同產(chǎn)地間烏飯樹葉中游離氨基酸在含量和組成上存在差異(見表1)。其中，江西上猶含有的游離氨基酸種類最多(25種)，江蘇溧陽的有24種,湖南白云山和安徽宣城的均有23種，而安徽黃山的最少(僅21種)。烏飯樹葉游離氨基酸總量在0.346—1.184 mg/g之間。其中江蘇溧陽產(chǎn)地游離氨基酸含量最高，安徽宣城產(chǎn)地略低，安徽黃山產(chǎn)地含量最低。在檢測的27種氨基酸中，精氨酸在5個(gè)不同產(chǎn)地烏飯樹葉片中含量較高，平均含量為0.095 mg/g；3-甲基組氨酸含量最低，平均含量低于0.001 mg/g。

表1 烏飯樹葉游離氨基酸組成及含量 mg/g

2.2 主成分分析

以游離氨基酸含量為分析指標(biāo)，對(duì)27種游離氨基酸進(jìn)行主成分分析，特征根、方差貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率結(jié)果如表2所示。依據(jù)累積方差貢獻(xiàn)率大于85%的原則，確定3個(gè)主成分。第1主成分的特征值為10.677，代表了不同產(chǎn)地烏飯樹葉中27種游離氨基酸含量全部性狀39.546%的信息；第2主成分的特征值為7.538，代表了27.918%的信息；第3主成分的特征值為5.552，代表了20.563%的信息。前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到88.027%。

表2 主成分的初始特征值

根據(jù)主成分的成分矩陣結(jié)果與主成分的初始特征值，計(jì)算各變量對(duì)各主成分的方差貢獻(xiàn)率以及累積貢獻(xiàn)率(見表3)。由表3可以看出，可解釋主成分1的指標(biāo)變量有組氨酸、α-氨基己二酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸、酪氨酸、磷酸絲氨酸、谷氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺和丙氨酸；可解釋主成分2的指標(biāo)變量有β-氨基異丁酸、3-甲基組氨酸、精氨酸、磷酸乙醇胺、瓜氨酸、α-氨基丁酸、1-甲基組氨酸、?；撬帷⒌鞍彼?、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和鳥氨酸；可解釋主成分3的指標(biāo)變量有甘氨酸、β-丙氨酸、丙氨酸、?；撬?、谷氨酸、1-甲基組氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、磷酸絲氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸以及β-氨基異丁酸。

表3 指標(biāo)變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率 %

2.3 綜合評(píng)價(jià)

各主成分得分見表4，第1主成分得分最高的是安徽宣城，其次是湖南白云山，江西上猶得分最低；第2主成分得分最高的是江蘇溧陽，得分最低的是安徽黃山；第3主成分得分最高的是湖南白云山，其次是安徽宣城，安徽黃山得分最低。以每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差相對(duì)貢獻(xiàn)率作為權(quán)重建立綜合評(píng)價(jià)模型，綜合得分(F)=F1× 0.395 5 +F2× 0.279 2 +F3× 0.205 6。綜合得分排名依次為安徽宣城、江蘇溧陽、湖南白云山、江西上猶、安徽黃山。說明安徽宣城產(chǎn)的烏飯樹葉中游離氨基酸綜合質(zhì)量最好，其次為江蘇溧陽和湖南白云山，而江西上猶與安徽黃山較差。

表4 不同產(chǎn)地烏飯樹葉的各成分得分與綜合得分

3 結(jié)論與討論

隨著經(jīng)濟(jì)水平增長和人民生活水平提高，烏飯樹作為藥食兩用資源深受人們的喜愛，市場潛力巨大。為更好地開發(fā)利用烏飯樹野生資源，充分挖掘其營養(yǎng)食味品質(zhì)，本研究對(duì)5個(gè)不同產(chǎn)地的烏飯樹葉游離氨基酸品質(zhì)進(jìn)行分析和綜合評(píng)價(jià)，建立綜合評(píng)價(jià)模型，為烏飯樹品種的選育及產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。結(jié)果表明，烏飯樹葉中共檢測出27種游離氨基酸，總游離氨基酸在0.346—1.184 mg/g之間。烏飯樹葉中總游離氨基酸含量明顯低于茶葉[14-15]、藥用植物紫蘇[16]等，但游離氨基酸種類十分豐富，與茶葉[17]相當(dāng)，說明從氨基酸的角度來說，烏飯樹葉具有作為補(bǔ)充氨基酸的功能性食品的潛力。

游離氨基酸屬于植物次生代謝產(chǎn)物，其品質(zhì)的差異性很大程度上會(huì)受到種植點(diǎn)、環(huán)境及氣候等因素的影響[18-19]。許多植物如芡實(shí)(SemenEuryales)[18]、菊花(Chrysanthemummorifolium)[9]、澤瀉(Alismaplantago-aquatica)[20]、雪茄[21]、白茶[14]等的氨基酸均存在明顯的地理變異。與上述研究結(jié)果類似，本研究中烏飯樹葉游離氨基酸的組分和含量在各產(chǎn)地間存在較大程度的變異，這種變異意味著烏飯樹具有豐富的遺傳多樣性[1]，這可能是烏飯樹自身遺傳特性以及生長環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其形成和影響機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。同時(shí)，烏飯樹產(chǎn)地間豐富的遺傳變異也證實(shí)了進(jìn)行優(yōu)良產(chǎn)地的篩選具有重要的意義。

本研究從烏飯樹葉中檢測出的游離氨基酸成分復(fù)雜，分析困難，因此選擇一種科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析方法至關(guān)重要。主成分分析是一種利用降維思想，將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合變量的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)工具[22]。目前此方法已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)。薛敏等[13]利用PCA建立了不同品種獼猴桃果實(shí)游離氨基酸品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)模型；李俊芳等[22]對(duì)采用主成分分析法對(duì)10種桑椹的游離氨基酸成分進(jìn)行分析及綜合評(píng)價(jià)；黃小蘭等[10]通過主成分分析和聚類分析對(duì)不同產(chǎn)地地參樣品氨基酸進(jìn)行差異分析和綜合評(píng)價(jià)。本研究采用主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地間烏飯樹葉中游離氨基酸品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。綜合得分排名產(chǎn)地依次為安徽宣城、江蘇溧陽、湖南白云山、江西上猶、安徽黃山。以氨基酸判定各產(chǎn)地烏飯樹的種質(zhì)，得出安徽宣城為烏飯樹葉游離氨基酸開發(fā)利用的優(yōu)良種源。我國烏飯樹種植范圍廣泛，在今后研究中還需擴(kuò)大采樣量和采樣范圍，同時(shí)應(yīng)綜合考慮其他營養(yǎng)成分，以期篩選出綜合品質(zhì)優(yōu)良的烏飯樹食藥用品種。