普浩宇，亐開興，楊貴偉，程美玲，黃必志，王 蓉，任珂青，尹革芬* (.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，云南 昆明 6500；.云南省草地動物科學(xué)研究院，云南 昆明 650)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)可通過直接接觸和垂直傳播途徑引起感染[1]，其中垂直傳播是導(dǎo)致商品化血清BVDV抗原陽性的主要原因[2-3]。不同品種、年齡段的牛對BVDV均易感，以12月齡以下的犢牛最為易感。感染牛臨床主要以發(fā)熱、腹瀉、漸進(jìn)性消瘦及消化道黏膜充血、出血、水腫至糜爛為特征，奶牛感染后呈現(xiàn)產(chǎn)乳量下降或停止，妊娠母牛發(fā)生流產(chǎn)。1946年美國最早報(bào)道了BVDV的出現(xiàn)[4]，隨后在比利時、澳大利亞和新西蘭等多國也相繼報(bào)道了該病毒。1980年李佑民等[5]首次從國內(nèi)牛流產(chǎn)死胎的脾臟中分離得到BVDV，此后相繼新疆、內(nèi)蒙古、甘肅等20多個省市報(bào)道了該病毒的出現(xiàn)[6-7]。1989年美國首次報(bào)道了BVDV-2的出現(xiàn)[8-9]，隨后多個國家報(bào)道了BVDV-2的流行[10]。我國也有多個省份報(bào)道了BVDV-2毒株的流行[11-12]，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

BVDV與豬瘟病毒(CSFV)、綿羊邊界病毒(BDV)同屬黃病毒科瘟病毒屬成員[13]，屬于單股正鏈RNA病毒，基因組約12.3 kb，病毒粒子為有囊膜的球形顆粒，直徑約50～80 nm。基因組兩端為非編碼區(qū)(5′UTR和3′UTR)，僅有1個開放閱讀框(ORF)，編碼12種蛋白，其中包含4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1和E2)。目前，BVDV可分為3個基因型(BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3)。根據(jù)毒株是否可引起細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)和NS2-3氨基酸序列中泛素編碼序列的插入情況[14]，BVDV分為2個生物型：致細(xì)胞病變型(CP)和非致細(xì)胞病變型(NCP)[15]。依據(jù)5′UTR核苷酸序列和P54氨基酸序列特征可將BVDV-2型毒株分為高毒力毒株和低毒力毒株[16-17]。

2020年云南省景谷縣某牛場發(fā)生導(dǎo)致犢牛嚴(yán)重腹瀉的傳染病，本研究采集病樣進(jìn)行疾病的診斷，對病原進(jìn)行分離、鑒定、擴(kuò)增分離病原的全基因序列并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，揭示了BVDV云南流行株的分子遺傳特征，為該病毒的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑MDBK細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶購自Gibco公司；cDNA Synthesis Mix、PCR SuperMixⅡ購自北京全式金公司；RNAiso plus、pMD18-T、DH5α、T4連接酶購自大連寶生物公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR試劑iScriptTMcDNA Synthesis Kit、SsoFastTMEvaGreen?SuperMix購自美國Bio-Rad公司；BVDV抗原檢測試劑盒(IDEXX cat：99-0010876)購自美國IDEXX公司；多聚甲醛、TritonX-100、封閉液、DAPI購自上海碧云天公司；鼠源抗羊BVDV-2型單抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 樣品檢測根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的參考序列設(shè)計(jì)了BVDV的檢測引物JC-F/JC-R，引物序列見表1，運(yùn)用RT-PCR方法對采集的樣本進(jìn)行檢測。利用質(zhì)粒回收試劑盒將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并連接到pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒送生物公司測序。

1.3 病毒分離在經(jīng)測序確認(rèn)的陽性樣品中加入等體積的MEM培養(yǎng)基(含0.1%雙抗)，置于4℃冰箱過夜，使病毒充分懸浮。離心收集上清并用0.22 μm 過濾器過濾，將濾液接種MDBK細(xì)胞，感作1 h后換新鮮的MEM培養(yǎng)基(含10% FBS)，于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察。72 h后收取細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次后離心收集上清，再進(jìn)行下一代培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR檢測利用1.2中構(gòu)建的含有病毒DNA片段的質(zhì)粒建立絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA，使用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR Green法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，將所得Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出不同代次細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒載量。

1.5 ELISA抗原檢測將接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)至72 h，吸取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，利用BVDV抗原檢測ELISA試劑盒對不同代次病毒進(jìn)行抗原檢測，得到不同代次細(xì)胞培養(yǎng)物BVDV抗原的D450 nm值。

1.6 免疫熒光試驗(yàn)(IFA)將生長狀態(tài)良好的MDBK細(xì)胞，按1×104個細(xì)胞/孔接種96孔培養(yǎng)板，添加含10% FBS的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞約鋪滿孔底的85%時，接種100 TCID50病毒，感作1 h后，更換為含有5% FBS的MEM繼續(xù)培養(yǎng)，于48，72 h棄上清，用37℃預(yù)溫的PBS(pH7.4)漂洗細(xì)胞3遍，向孔中緩慢加入100 μL預(yù)冷的2%多聚甲醛固定20～30 min；固定結(jié)束后用預(yù)冷的PBS漂洗3遍，自然干燥，加入0.3%的TritonX-100穿透15 min，用1%的脫脂奶粉4℃封閉2 h，加一抗4℃過夜孵育；用PBS漂洗3次，自然干燥后加入二抗37℃孵育1 h，用PBS漂洗3次，自然干燥后每孔加入DAPI室溫孵育10 min，用PBS洗3遍，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.7 病毒毒力測定將病毒液倍比稀釋成10-1～10-8共8個濃度梯度，每個濃度設(shè)置8個重復(fù)，分別接種96孔板培養(yǎng)的MDBK細(xì)胞，每日觀察，培養(yǎng)5 d 后，各孔細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的CPE，故采用IFA法檢測各試驗(yàn)孔中病毒的增殖情況，按照Reed-Muench法計(jì)算該BVDV分離株的TCID50。

1.8 病毒全基因測序及分析根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中BVDV參考毒株序列，設(shè)計(jì)全基因擴(kuò)增引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。提取細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，利用全基因擴(kuò)增引物，用PCR SuperMixⅡ進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將陽性PCR產(chǎn)物純化回收并克隆入pMD18-T，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α中，涂布于抗性平板，過夜培養(yǎng)后挑取單個菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，利用DNAStar 6.0進(jìn)行序列拼接，得到Y(jié)NJG毒株全基因序列。

表1 BVDV檢測和全基因測序引物

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測結(jié)果顯示，在預(yù)期大小310 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1)?；厥占兓禺愋詳U(kuò)增條帶，克隆至pMD18-T載體，進(jìn)行序列測定，將所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BVDV序列進(jìn)行比對，證實(shí)所采集樣本為BVDV陽性樣本。

M.DL1000 DNA Marker；1～6.1～6號樣品；7.陰性對照(ddH2O)圖1 樣品BVDV RT-PCR檢測結(jié)果

2.2 病毒分離及鑒定結(jié)果利用qRT-PCR方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒載量，將所得Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各代次細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒載量，結(jié)果顯示，隨著病毒接種代次的增加，病毒載量逐漸升高然后趨于穩(wěn)定(表2)。運(yùn)用BVDV抗原檢測ELISA試劑盒對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，根據(jù)不同代次病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的抗原D450 nm值計(jì)算出S/N值(樣本/陰性對照>0.4為陽性)，結(jié)果顯示，隨著接種代次的增加，上清液中的病毒載量逐漸升高(表3)。將病毒接種于MDBK細(xì)胞，收取接毒后48，72 h的細(xì)胞樣品，通過IFA進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，熒光標(biāo)記的BVDV特異性單克隆抗體識別并結(jié)合病毒蛋白，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)綠色熒光，可確認(rèn)分離獲得了BVDV毒株。

圖2 病毒免疫熒光染色結(jié)果(200×)

表2 qRT-PCR檢測各代次細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒載量

表3 不同代次毒株的ELISA抗原檢測S/N值

2.3 病毒毒力測定將病毒液稀釋成10-1～10-8共8個梯度，然后接種細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后，采用免疫熒光染色法觀察各試驗(yàn)孔中病毒的增殖情況，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算出YNJG分離株的滴度為10-4.4TCID50/100 μL。

2.4 基因型分析測序得到該毒株5′UTR序列的大小為384 bp，利用MegAlign與參考毒株(表4)進(jìn)行比對，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，YNJG分離株與BVDV-2代表毒株(New York 93、XJ-04等)聚集在一個獨(dú)立分支，與BVDV-1和BVDV-3明顯分開(圖3)，表明該分離株屬于BVDV-2毒株。

圖3 YNJG分離株與參考毒株5′UTR序列的遺傳進(jìn)化樹分析

表4 不同基因型BVDV參考毒株信息

2.5 全基因遺傳進(jìn)化分析測序產(chǎn)物拼接后顯示，該毒株全基因序列長為12 288 bp，與國內(nèi)外參考毒株全基因序列進(jìn)行比對，遺傳進(jìn)化樹分析顯示：YNJG分離株與BVDV-2代表毒株(New York 93、XJ-04等)聚集在一個分支，與美國分離株9231(MH 806437.1)和B9497(MH 231134.1)親緣關(guān)系最近(圖4A)；核苷酸同源性分析顯示：YNJG與分離株9231和B9497的核苷酸同源性分別為95.4%，94.7%(圖4B)。

圖4 YNJG與參考毒株全基因遺傳進(jìn)化分析(A)和核苷酸同源性分析(B)

2.6 E2基因氨基酸位點(diǎn)變異分析YNJG分離株E2基因全長1 116 bp，編碼372個氨基酸殘基。與國內(nèi)外參考毒株相比，在B細(xì)胞抗原表位區(qū)116～126 aa(紅色框)含有1個N-糖基化位點(diǎn)(黃色三角)，其中116位氨基酸為疏水性的丙氨酸(A)； T細(xì)胞抗原表位區(qū)154～162 aa(藍(lán)色框)的158位和162位氨基酸分別為親水性的蘇氨酸(T)和堿性的精氨酸(R)；此外，148位和196位氨基酸分別出現(xiàn)T→I和K→R的氨基酸突變(圖5)。

圖5 YNJG與參考毒株E2基因氨基酸位點(diǎn)變異分析

2.7 毒株生物型和毒力分析與CP型BVDV-2型代表毒株New York 93(AF502399)相比，YNJG分離株的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2和NS3間(1 607 aa)無泛素編碼序列的插入，屬于非致細(xì)胞病變型(NCP)毒株(圖6A)；與強(qiáng)毒株890(U18059)和New York 93相比，其5′UTR核苷酸序列的第216位核苷酸和275位核苷酸分別為C和T，且其氨基酸全序列的第1 142 位氨基酸處無氨基酸的插入，可能屬于低毒力毒株(圖6B，C)。

3 討論

BVDV是危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展最為重要的病原之一。近年，由于跨國家、地區(qū)引種的增加及跨區(qū)域調(diào)運(yùn)的頻繁[18]，我國部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)了BVDV-2的流行[11-12]，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，有必要加大對新型毒株的監(jiān)測和預(yù)警。目前，分子流行病學(xué)研究和病毒基因組系統(tǒng)發(fā)育分析是監(jiān)測新型毒株出現(xiàn)和分析進(jìn)化選擇方向的主要手段。本研究利用MDBK細(xì)胞從臨床腹瀉的犢牛糞便中分離得到1株BVDV，命名為YNJG。利用qRT-PCR方法檢測病毒基因拷貝數(shù)，通過ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)物抗原含量[19]，利用特異性BVDV-2抗體對接種YNJG毒株的MDBK進(jìn)行IFA，結(jié)果顯示該毒株在MDBK中具有良好的增殖能力，并能與特異性抗體結(jié)合呈現(xiàn)出綠色熒光，利用IFA，按Reed-Muench方法測定YNJG分離株的滴度為10-4.4TCID50/100 μL。

設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增病毒的全基因序列，依照BVDV病毒分型方法[20]，使用5′UTR基因序列進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)該分離株遠(yuǎn)離CSFV和BDV分支，且與BVDV-2 New York 93、XJ-04等參考毒株聚集在一起，表明YNJG分離株屬于BVDV-2毒株支系。病毒全基因遺傳進(jìn)化分析和核苷酸同源性分析顯示，YNJG毒株與2018年美國分離株9231(MH 806437)、B9497(MH 231134)的核苷酸同源性分別為95.4%，94.7%。根據(jù)BVDV-2毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2與NS3氨基酸序列之間有無泛素編碼序列的插入，在翻譯過程中能否加工產(chǎn)生大量單一的NS3蛋白，將其分為NCP或CP生物型[14]。序列分析顯示，YNJG分離株NS2～3氨基酸序列之間無泛素編碼序列插入，且不能導(dǎo)致MDBK細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE，屬于NCP毒株。BVDV-2毒株毒力有強(qiáng)弱之分，5′UTR序列的第216位和275位核苷酸是區(qū)分其毒力的分子標(biāo)記，強(qiáng)毒株分別為T和C，而弱毒株則為C和T[16]；研究報(bào)道，強(qiáng)毒株在氨基酸全序列第1 142位處有連續(xù)76個氨基酸的插入[17]；通過與強(qiáng)毒株比對分析顯示，YNJG分離株為弱毒株。

E2蛋白是BVDV的主要囊膜蛋白，屬于糖蛋白，具有高度的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。YNJG分離株E2基因氨基酸的B細(xì)胞抗原表位區(qū)域(116～126 aa)[21]含有1個N-糖基化位點(diǎn)，且116位氨基酸為疏水性的丙氨酸(A)；在T細(xì)胞抗原表位區(qū)(154～162 aa)的158位和162位氨基酸分別為親水性的蘇氨酸(T)和堿性的精氨酸(R)，與美國分離株9231和中國新疆分離株FJ527845一致，故可能存在較高的中和活性和交叉反應(yīng)性，臨床上可導(dǎo)致相似的癥狀和病理損傷。另外，在148位和196位氨基酸分別出現(xiàn)T→I和K→R的氨基酸突變，其中148位氨基酸的突變導(dǎo)致了氨基酸由親水性到疏水性的改變，是否會導(dǎo)致毒株的中和抗體敏感性降低還需要進(jìn)一步的研究。

全基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)，各地區(qū)流行毒株的基因型不同，感染能力和毒力各異。通常，BVDV-1毒株只引發(fā)免疫力較低的牛出現(xiàn)輕度腹瀉，而BVDV-2毒株可導(dǎo)致嚴(yán)重的急性出血性腹瀉、淋巴細(xì)胞減少及呼吸道癥狀，還可造成犢牛持續(xù)性感染，引起免疫抑制，犢牛死亡率可達(dá)25%以上[8,22]。血清交叉中和試驗(yàn)表明，BVDV-1疫苗與BVDV-2毒株存在較大的抗原差異[23]，BVDV-1疫苗對BVDV-2毒株僅具有較低的保護(hù)作用，因此，開發(fā)新型毒株疫苗防控牛病毒性腹瀉已成為亟待解決的問題。