基于Nrf2/HO-1通路的三七總皂苷對(duì)腦栓塞大鼠的保護(hù)機(jī)制

魏丹丹，李 爽，岳孟龍

血栓性中風(fēng)(thrombotic stroke，TS)占中風(fēng)發(fā)病率的80%以上[1]。目前針對(duì)TS的治療以血栓發(fā)生早期再灌注時(shí)間窗內(nèi)溶栓取栓和后期恢復(fù)性治療為主[2]。影響血栓形成的因素如凝血酶原、纖溶酶等都參與氧化應(yīng)激相關(guān)通路[3]。此外，丙二醛(malondialdehyde，MDA)等氧化應(yīng)激產(chǎn)物引發(fā)的細(xì)胞毒害也是腦損傷過(guò)程中神經(jīng)元凋亡的重要原因[4]。三七是常用于防治心腦血管缺血性疾病的中藥，其提取物三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)具有抑制血栓形成的作用[5-6]。目前PNS相關(guān)研究多在抗栓和抗炎作用上，其在腦栓塞病理過(guò)程中抗氧化應(yīng)激作用方面的研究并不多。本研究以雄性SD大鼠為研究對(duì)象，向大鼠顱內(nèi)頸內(nèi)動(dòng)脈注入月桂酸鈉進(jìn)行TS造模，腹腔注射PNS和陽(yáng)性藥物(巖藻黃質(zhì))進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠行為，評(píng)定神經(jīng)功能損傷，檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，神經(jīng)元核心抗原(NeuN)和胱冬肽酶3(Caspase-3)免疫組織熒光染色鑒定神經(jīng)元凋亡情況，檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)、Kelch樣相關(guān)蛋白1(Keap1)、血紅素加氧酶1(HO-1) mRNA和蛋白水平，探討PNS對(duì)TS模型大鼠Nrf2/HO-1通路的影響及神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)成年雄性SD大鼠54只，體重(350±25)g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜循環(huán)光照(12 h/12 h)，溫度(23±3)℃，濕度(43±5)%。

1.2 主要藥品及試劑 三七總皂苷(華中海威基因科技有限公司生產(chǎn)，純度：HPLC>98%，貨號(hào)：p31005)；巖藻黃質(zhì)(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)，純度：HPLC>95%，貨號(hào)：BP0603)；TRIzol Invitrogen、TaqMan One Step RT-qPCR Kit、BCA試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)分別為：15596026、T2210、PC0020)；GITC兔抗NeuN單克隆抗體、羊抗小鼠IgG(DyLight?650)、兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗Keap1多克隆抗體、兔抗HO-1多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、兔抗GAPDH多克隆抗體、大鼠MDA試劑盒均購(gòu)自英國(guó)abcam公司，貨號(hào)分別為ab223994、ab96874、ab137550、ab139729、ab13243、ab7090、ab9485、ab238537；小鼠抗Caspase-3單克隆抗體(美國(guó)賽默飛世爾生產(chǎn)，貨號(hào)：MA1-16843)；三用SOD ELISA試劑盒(美國(guó)R & D Systems生產(chǎn)，貨號(hào)：DYC3419)；BCA試劑盒(碧云天生產(chǎn)，貨號(hào)：P0012)；ECL試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：ECL-P-100)。

1.3 動(dòng)物模型建立與分組 將54只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、PNS低劑量組、PNS中劑量組、PNS高劑量組和陽(yáng)性藥物組，每組9只。參考劉英等[7]月桂酸鈉造栓法，將1.2 mg月桂酸鈉溶解于2 mL生理鹽水中配制成造栓工作液；25 mg/kg 3%戊巴比妥鈉麻醉后剪開(kāi)頸部皮膚，玻璃分針挑出右側(cè)頸總動(dòng)脈；采用連有微量進(jìn)樣針的PE管吸取造栓工作液300 μL，維納斯剪剪開(kāi)頸總動(dòng)脈分支點(diǎn)附近頸內(nèi)動(dòng)脈，PE管沿頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)15 mm后推注200 μL工作液，3 min后撤出PE管，縫合傷口完成造模。其中假手術(shù)組以300 μL生理鹽水代替，其余步驟相同。建模后腹膜下注射給藥，PNS低、中、高劑量組分別按照每天50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg注射PNS，陽(yáng)性藥物組按照每天50 mg/kg劑量經(jīng)口飼喂巖藻黃質(zhì)，連續(xù)給藥14 d后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分及后續(xù)實(shí)驗(yàn)[8-9]，假手術(shù)組、模型組每天注射2 mL生理鹽水。

1.4 大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分測(cè)定 對(duì)神經(jīng)功能損傷程度進(jìn)行連續(xù)評(píng)分(mark)，大鼠行為表現(xiàn)在0～5分之間。正常(0分)；輕度障礙(0～1分)，即大鼠提尾懸空，左右前肢伸展程度有明顯差異；中度障礙(>1～2分)，即大鼠拽尾后拖時(shí)左前肢無(wú)力反抗；中重度障礙(>2～3分)，即大鼠前行時(shí)向左側(cè)打圈；重度障礙(>3～4分)，即大鼠站立不穩(wěn)，向左側(cè)傾倒；嚴(yán)重障礙(>4～5分)，即大鼠意識(shí)不清，無(wú)法行動(dòng)。多次評(píng)估結(jié)果取均值為該只大鼠的神經(jīng)功能損傷評(píng)分[10]。

1.5 ELISA檢測(cè)大鼠腦脊液中MDA和SOD含量 加注樣品稀釋液后加注標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL，封板37 ℃孵育，注洗板3次后加注酶標(biāo)抗體孵育，拍干加注底物室溫顯色，終止反應(yīng)后上酶標(biāo)儀讀板。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA和SOD含量。

1.6 樣本采集 從每組大鼠中隨機(jī)抽取3只用于免疫組化試驗(yàn)，其余6只用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)。大鼠麻醉后俯臥于鼠臺(tái)上，用一端連有微量進(jìn)樣器的頭皮針穿入寰枕大池，抽出150 μL腦脊液，4 ℃暫存。大鼠取完腦脊液后仰置于蠟盤(pán)上，剪開(kāi)胸腔暴露出心臟，先快速灌入200 mL生理鹽水，后灌入4 ℃ 4%多聚甲醛150 mL。用刀片冠狀截取A5.5 mm至A7.5 mm(距后囟)之間腦組織固定，用于組織切片。大鼠抽完腦脊液后取腦低溫勻漿，置于-80 ℃凍存。

1.7 免疫組織熒光檢測(cè)大鼠腦組織中NeuN和Caspase-3染色細(xì)胞數(shù)量 組織切片脫蠟復(fù)水后放入SSC(0.1 M，Ph=6.0)中漂洗，封閉，加一抗4 ℃過(guò)夜(NeuN 1∶500，Caspase-3 1∶2 000)后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗。加二抗37 ℃孵育1 h后沖洗、封片。熒光顯微鏡拍照后使用imageJ 15.1軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。神經(jīng)元凋亡比例=Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA水平 提取腦組織勻漿總RNA，使用TaqMan一步法試劑盒進(jìn)行PCR定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25 μL)：25×One Step RT-qPCR RTase mix(1 μL)、5×One Step RT-qPCR Buffer(5 μL)、前后引物各100 nmol/L(2.5 μL)、TaqMan Probe 500 nmol/L(4 μL)、RNA(4 μL)、無(wú)酶雙蒸水(6 μL)。循環(huán)體系：反轉(zhuǎn)錄 52 ℃ 20 min；預(yù)變性 95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s；退火延伸 60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。引物由金唯智生物科技有限公司完成。序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.9 Western Blot檢測(cè)大鼠腦組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)量 大鼠腦組織勻漿0.1 g提取蛋白，檢測(cè)總蛋白含量和純度。再將蛋白濃度稀釋至5 μg/μL，熱變性后上樣。電泳、轉(zhuǎn)膜后，NC膜脫脂奶清室溫封閉2 h，加一抗(均為 1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育2 h后沖洗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，凝膠成像儀拍照進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能損傷評(píng)分 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組及PNS低、中、高劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，PNS高劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS低劑量組比較，PNS中、高劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS中劑量組比較，PNS高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.2 各組腦脊液MDA和SOD水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組腦脊液SOD水平明顯降低、MDA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、PNS低劑量組、PNS中劑量組、PNS高劑量組MDA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性藥物組及PNS中劑量組、高劑量組SOD水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，PNS高劑量組MDA水平明顯降低，SOD水平明顯升高，而PNS低劑量組SOD水平明顯降低，MDA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS低劑量組比較，PNS中劑量組、高劑量組MDA水平明顯降低，SOD水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS中劑量組比較，PNS高劑量組MDA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腦脊液MDA和SOD水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 各組NeuN和Caspase-3染色結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)元凋亡比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、PNS中劑量組、PNS高劑量組神經(jīng)元凋亡比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，PNS高劑量組神經(jīng)元凋亡比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS低劑量組比較，PNS中劑量組、高劑量組神經(jīng)元凋亡比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS中劑量組比較，PNS高劑量組腦神經(jīng)元凋亡比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表4。

表4 各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡情況比較(±s) 單位：%

圖1 各組大鼠腦組織NeuN、Caspase-3免疫熒光染色結(jié)果(×400)

2.4 各組Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA、HO-1 mRNA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Keap1 mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、PNS低劑量組、PNS中劑量組、PNS高劑量組Keap1 mRNA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，PNS高劑量組Keap1 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS低劑量組比較，PNS高劑量組Keap1 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS中劑量組比較，PNS高劑量組HO-1 mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腦組織中Nrf2、Keap1、HO-1的mRNA水平比較(±s)

0.05；與PNS中劑量組比較，⑤P<0.05。

2.5 各組大鼠腦組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯降低，Keap1蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組及PNS中劑量組、PNS高劑量組Keap1蛋白水平明顯降低，Nrf2、HO-1蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，PNS低劑量組Nrf2、HO-1蛋白水平明顯降低、PNS高劑量組Keap1蛋白水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PNS高劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明升高，PNS低劑量組Keap1蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS低劑量組比較，PNS高劑量組Keap1水平明顯降低，PNS中劑量組、PNS高劑量組Nrf2、HO-1蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PNS中劑量組比較，PNS高劑量組Keap1蛋白水平明顯降低，Nrf2、HO-1蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表6。

圖2 各組大鼠腦組織Nrf2蛋白、Keap1蛋白、HO-1蛋白水平表達(dá)條帶圖

表6 各組大鼠腦組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

腦缺血后，神經(jīng)組織細(xì)胞內(nèi)活性氧反應(yīng)性地急劇上升是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的直接原因[11]。在創(chuàng)傷性腦病的病理過(guò)程中，Nrf2/HO-1途徑是抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性抵抗的關(guān)鍵通路之一[12]。上調(diào)Nrf2/HO-1通路可誘導(dǎo)一系列抗氧化酶和解毒酶系，加快酶促反應(yīng)，使SOD等抗氧化物質(zhì)水平均升高，并降低自由基及其他氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，同時(shí)有利于維持細(xì)胞膜正常電位[13-14]。Nrf2通過(guò)與Keap1動(dòng)態(tài)結(jié)合實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)水平穩(wěn)定，二者在細(xì)胞抗氧化調(diào)節(jié)中處于中心地位[15]。ROS等氧化應(yīng)激產(chǎn)物激活蛋白激酶C調(diào)控可誘導(dǎo)Nrf2磷酸化，使其與Keap1蛋白解聚傾向增大，能夠與核內(nèi)多種抗氧化劑反應(yīng)元件結(jié)合的Nrf2量也相對(duì)增加，從而上調(diào)HO-1等下游因子的轉(zhuǎn)錄水平。研究表明，HO-1可調(diào)節(jié)應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)、低氧誘導(dǎo)因子1α、高遷移率族蛋白等下游抗氧化信號(hào)通路[16-17]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的MDA和其造成的線粒體損傷是神經(jīng)元凋亡的重要原因[18]。因此，上調(diào)Nrf2/HO-1通路有利于抑制神經(jīng)元凋亡。腦栓塞在中醫(yī)辨證上屬于氣滯血瘀，治療上應(yīng)以行氣活血、疏通經(jīng)絡(luò)為主[19]。三七能散瘀止血、消腫祛痛。傳統(tǒng)中醫(yī)通過(guò)針對(duì)性的炮制使三七發(fā)揮不同功效[20]?，F(xiàn)有研究表明，三七主要藥效成分為三七素和PNS，三七素是一種具有強(qiáng)效止血作用的特殊非蛋白氨基酸，PNS是活血抗栓的主要藥效成分[21]。

本研究結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)功能損傷評(píng)分、MDA水平、神經(jīng)元凋亡比例明顯高于假手術(shù)組，SOD水平和Nrf2/HO-1通路水平比假手術(shù)組明顯下降。Hu等[22]研究表明，巖藻黃質(zhì)能上調(diào)腦缺血再灌注模型大鼠Nrf2/HO-1通路，改善神經(jīng)功能損傷。有研究顯示，巖藻黃質(zhì)可使皮膚細(xì)胞Nrf2/HO-1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[23]。陽(yáng)性藥物組與模型組比較，腦組織中Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白水平、腦脊液中SOD水平明顯升高，神經(jīng)功能損傷評(píng)分、神經(jīng)元凋亡比例、腦脊液中MDA水平明顯降低，結(jié)果符合上述研究。PNS各劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分、MDA水平、神經(jīng)元凋亡比例、Keap1 mRNA和蛋白水平均降低，Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白水平、SOD水平均升高。實(shí)驗(yàn)中PNS治療機(jī)制與巖藻黃質(zhì)相似，高劑量時(shí)治療效果優(yōu)于巖藻黃質(zhì)。說(shuō)明PNS可能通過(guò)影響Nrf2和Keap1轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Nrf2/HO-1通路，降低大鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，抑制神經(jīng)元凋亡，從而減輕神經(jīng)功能損傷，而且這種治療效果與劑量呈正相關(guān)。

綜上所述，在TS大鼠治療過(guò)程中，PNS能夠下調(diào)Nrf2/HO-1通路，降低組織氧化應(yīng)激水平，減輕神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)并未排除PNS的溶栓通血作用對(duì)神經(jīng)元凋亡可能造成的影響，是本研究的不足之處。