甲狀腺乳頭狀癌病人血清微小RNA-451的檢測及其診斷價值的研究

馬靜 張楠 馬斌林

甲狀腺癌在全世界的發(fā)病率迅猛上升，甲狀腺乳頭狀癌是其中占比最多的病理類型。甲狀腺乳頭狀癌缺乏特征性的術(shù)前檢測標(biāo)志物。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA分子，在多種人類疾病，包括癌癥中都表現(xiàn)出了功能異常或者表達(dá)異常[1]。miRNA-451位于17號染色體著絲粒附近，現(xiàn)有多項研究提示，miRNA-451在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，且其表達(dá)的下調(diào)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生有關(guān)。但是關(guān)于血清miRNA-451與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)聯(lián)研究并不多見。本研究采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測了36例甲狀腺乳頭狀癌病人血清中miRNA-451的表達(dá)情況，分析了其表達(dá)與病人臨床病理特征之間的關(guān)系，意在了解檢測血清miRNA-451是否對甲狀腺乳頭狀癌的術(shù)前診斷有幫助。

對象與方法

一、對象

2019年4～ 5月在我院接受手術(shù)治療并且病理診斷明確的甲狀腺腫瘤病人73例為研究對象(術(shù)前抽取血清備用)。其中36例為甲狀腺乳頭狀癌病人，37例為甲狀腺良性腫瘤。36例甲狀腺乳頭狀癌病人中，男性7例，女性29例；平均年齡為(49.47±8.24)歲，其中≤55歲10例，>55歲26例；病灶位于單側(cè)的30例，雙側(cè)6例；單個病灶25例，多個病灶11例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。

二、方法

1.材料：36例甲狀腺乳頭狀癌和37例甲狀腺良性腫瘤病人的血清樣本。

2.步驟：MiRcute Serum/Plasma miRNA Isolation Kit提取血漿總 RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑miRNA First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。采用qRT-PCR 儀對 miR-451進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：正、反引物(10 μmol/l)各0.5 μl，聚合酶和綠色熒光染料的預(yù)混液5.0 μl，cDNA(50 ng/μl)1.0 μl，RT-PCR試劑盒中水3.0 μl，共10 μl。反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以miR-39為外參，采用 2-△△Ct法對miR-451a在不同血漿樣品中的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.甲狀腺乳頭狀癌及良性腫瘤病人血清微小RNA-451的表達(dá)情況：對甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性腫瘤病人的血清微小RNA-451表達(dá)量進(jìn)行分析顯示，兩組血清微小RNA-451表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌病人血清中微小RNA-451表達(dá)量水平為(1.09±0.27)，良性腫瘤病人血清中微小RNA-451表達(dá)量水平為(1.31±0.23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 血清miR-451在甲狀腺乳頭狀癌與良性腫瘤病人中的相對表達(dá)水平對比

2.甲狀腺乳頭狀癌病人血清微小RNA-451與臨床病理特征的關(guān)系：血清微小RNA-451的表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系：血清微小RNA-451的表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人中明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人(0.92±0.17 vs 1.28±0.22，P<0.05)，見表1。血清微小RNA-451的表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌病人的年齡、性別、病灶位置、病灶數(shù)目等臨床病理資料無關(guān)。

3.檢測血清miRNA-451對甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷價值：以甲狀腺良性腫瘤病人血清中miRNA-451表達(dá)量作為對照，制作受試者工作特征曲線(ROC曲線)，通過ROC曲線分析，血清微小RNA-451對診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.720(圖2)；在36例甲狀腺乳頭狀癌病人中，以淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移病人血清中的miRNA-451表達(dá)量作為對照，血清微小RNA-451對于判斷甲狀腺乳頭狀癌是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積是0.873(圖3)。

圖2 血清miR-451在甲狀腺乳頭狀癌與良性腫瘤病人中的相對表達(dá)水平的ROC曲線

圖3 血清miR-451在甲狀腺乳頭狀癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中相對表達(dá)水平的ROC曲線

討論

甲狀腺腫瘤的術(shù)前診斷主要依賴于超聲檢查，依據(jù)目前超聲診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的TI-RADS分級診斷系統(tǒng)，其對4級以上結(jié)節(jié)的惡性可能性評估范圍跨度較大(5%～100%)[2]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型，其術(shù)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是超聲引導(dǎo)下的細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查。但是細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)的漏診因素較多，例如甲狀腺結(jié)節(jié)的大小、部位、距體表的距離及伴發(fā)的基礎(chǔ)疾病等[3]，且細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查屬于有創(chuàng)檢查，病人的配合度不盡相同。因此，甲狀腺乳頭狀癌的術(shù)前診斷缺乏特異性的無創(chuàng)檢測標(biāo)志物。

miRNAs是細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移的關(guān)鍵調(diào)控因子。miRNAs的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括不同類型的甲狀腺癌[4]，在已知的miRNA中，有的miRNA在甲狀腺癌組織中表現(xiàn)為下調(diào)，另一些表現(xiàn)為上調(diào)[5-6]。目前關(guān)于miRNAs與甲狀腺癌的研究多集中于病理組織標(biāo)本，關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌血清miRNAs檢測的研究并不多見，少數(shù)研究者對miRNA-221、miRNA-222、miRNA-455在甲狀腺乳頭狀癌病人血清檢測的意義做了研究[7]。

miRNA-451位于17號染色體著絲粒附近，現(xiàn)有的研究提示其在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，如在肝癌，胃癌的體外研究提示miRNA-451的表達(dá)與這些腫瘤的侵襲性呈負(fù)相關(guān)[8-9]。目前關(guān)于miRNA-451在甲狀腺癌病理組織中的研究亦很多見，如Duan等[10]、Zhang等[11]檢測了miRNA-451在甲狀腺乳頭狀癌石蠟包埋組織中的表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)其在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯為低，且后者的研究提示miRNA-451在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中的表達(dá)較無轉(zhuǎn)移者低。李曉娜等[12]的研究也提示在甲狀腺癌組織中miRNA-451表達(dá)顯著低于癌旁組織，并分析了miRNA-451可通過靶向MIF抑制PI3K/Akt信號通路抑制K1甲狀腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

基于以上miRNA-451在甲狀腺癌病理組織中研究，本研究檢測了36例甲狀腺乳頭狀癌病人和37例甲狀腺良性腫瘤病人的血清中miRNA-451的表達(dá)情況，意在通過檢測甲狀腺乳頭狀癌病人血清中miRNA-451的表達(dá)，了解其是否可以在術(shù)前對甲狀腺乳頭狀癌的無創(chuàng)診斷提供幫助。本研究結(jié)果提示甲狀腺乳頭狀癌病人血清中miRNA-451的相對表達(dá)量明顯低于甲狀腺良性腫瘤病人的表達(dá)，并且在比較了miRNA-451與甲狀腺乳頭狀癌病人臨床病理資料的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)miRNA-451在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中的表達(dá)量更低，這與上述研究者在甲狀腺乳頭狀癌石蠟包埋組織中的檢測結(jié)果一致；通過受試者工作曲線分析了血清miRNA-451對診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.720，表明檢測血清miRNA-451有助于區(qū)分甲狀腺疾病的良惡性，但是其診斷效能并不很理想；基于本研究中miRNA-451在甲狀腺乳頭狀癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中的表達(dá)明顯低于其在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中的表達(dá)的實驗結(jié)果，我們分析了血清miRNA-451在判斷甲狀腺乳頭狀癌有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積是0.873，說明檢測血清miRNA-451對于術(shù)前判斷甲狀腺乳頭狀癌病人淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有一定的診斷意義。

目前關(guān)于miRNA-451與甲狀腺乳頭狀癌關(guān)系的研究尚處于初步階段，雖然本研究提示甲狀腺乳頭狀癌病人的血清miRNA-451呈低表達(dá)，但仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析，并進(jìn)一步探索血清中miRNA-451表達(dá)是否與組織標(biāo)本中的表達(dá)完全一致，進(jìn)而從機(jī)制上了解miRNA-451如何影響甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展。在目前甲狀腺癌仍然基于超聲及術(shù)前細(xì)胞學(xué)穿刺作為手術(shù)依據(jù)的情況之下，探索血清miRNA-451在診斷甲狀腺乳頭狀癌病人的表達(dá)節(jié)點，并在術(shù)前對淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移做出預(yù)判有一定的研究意義，期待miRNA-451血清檢測能夠為甲狀腺乳頭狀癌病人的術(shù)前診斷及淋巴結(jié)預(yù)判提供一種無創(chuàng)的檢測方法。