郭延華，皮文輝

(綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

1 材料與方法

1.1 材 料

pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene，42230)，pCAS9-mCherry-Frame+1(Addgene,66940)，pCRISPaint-TagGFP2-PuroR(Addgene，80970)，pMAX(VDC-1040,Lonza)電轉(zhuǎn)儀(Amax NucleofectorⅡ)，流式細(xì)胞儀(BDFACSAria Ⅲ)。綿羊原代成纖維細(xì)胞采自新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所種羊場(chǎng)，采集8月齡試驗(yàn)羊只耳緣組織，帶回實(shí)驗(yàn)室原代培養(yǎng)保存。

QuickExtract DNA 抽提液(QE09050，Epicentre)、PrimerSTAR DNA Polymerase(R045，Takara)、Surveyor 凝膠電泳突變檢測(cè)試劑盒(706025，Transgenomic)、10× T4ligase buffer(B0202S,NEB)、T4PNK(M0201S,NEB)、2X rapid ligase buffer(B1010,Enzymatics)、T7ligase(L6020L,Enzymatics)和FastDigestBbsI(FD1014,Fermentas)。

細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管(Nunc)；DMEM 高糖培養(yǎng)液(61965059，Gibco)；胎牛血清(LOT1407738，BI)；胰酶替代物 TrypLETMExpress(1X)(12604-021，Gibco)。

1.2 方 法

1.2.1 gRNAs(guide RNAs)設(shè)計(jì)

針對(duì)綿羊ACTG1基因TAA終止密碼子位點(diǎn)，3’端保留PAM(NGG)。表1

表1 綿羊ACTG1基因羧基端gRNAs序列Table 1 Oligo sequences of C-terminal targets of sheep ACTG1 gene

AGCAGGAGTATGATGAGTCCACCGCAAATGCTTCTAAAGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGATGAGTCTGGCCCCTCCATTGTCCACCGCAAATGCTTCTAAACGGACTGCGAGCAGACAAATGCTTCTAAACGGACC

1.2.2 gRNA質(zhì)粒克隆

王積薪手捻一粒黑玉棋子停了下來，一張白玉般的臉變成了醬紫色，半晌抬頭對(duì)星雨道：“那夜月光入戶，照在床枕邊，徘徊轉(zhuǎn)移，有一刻就停留在她的臉上?！?/p>

磷酸化退火gRNA寡核苷酸，BbsI酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9質(zhì)粒，用Golden Gate克隆體系，將退火寡核苷酸連接，構(gòu)建gRNA質(zhì)粒。首先將合成的正向和反向gRNA寡核苷酸用水稀釋至100 μm，分別取1與6.5 μL的水混合，加入10×T4ligase buffer 1 μL和T4PNK 0.5 μL，將10 μL液體混勻，水浴37℃ 30 min。然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)入PCR儀，95℃ 3 min，直接關(guān)閉PCR儀，保持關(guān)閉PCR儀頂蓋，室溫下自動(dòng)降溫退火30 min。將雙鏈退火的反應(yīng)液補(bǔ)加90 μL水稀釋10倍，混勻代用。Golden Gate反應(yīng)體系是：2×rapid ligase buffer 5 μL、BSA(20 mg/mL)0.3 μL、FastDigest BbsI 0.5 μL、T7 ligase 0.5 μL、退火稀釋的gRNA溶液1 μL、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(25 ng/μL)1 μL和水2.0 μL，混勻。37℃ 水浴60 min。取2～5 μL 連接反應(yīng)液，直接轉(zhuǎn)染50 μL感受態(tài)Stbl3。抗性Amp的LB固體培養(yǎng)基涂板，37℃ 16 h培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用電轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%，消化收集2×105個(gè)細(xì)胞，20 μL電轉(zhuǎn)液[7]懸浮，加入相應(yīng)的質(zhì)粒，將電擊杯放置于電轉(zhuǎn)儀的電擊槽中，運(yùn)行CZ-167電轉(zhuǎn)程序，培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后鋪于6孔板中培養(yǎng)。

1.2.4 CRISPR-Cas9系統(tǒng)活性檢測(cè)

檢測(cè)3個(gè)gRNA質(zhì)粒編輯效率，電轉(zhuǎn)染20 μL，添加gRNA質(zhì)粒1 μg。培養(yǎng)72 h收集細(xì)胞，用30 μL QuickExtract DNA 抽提液裂解細(xì)胞，水浴65℃ 10 min；95℃ 15 min。獲得的細(xì)胞裂解液作為基因組DNA模板，ShACTG1-F：AGCATGACTGACCTCCCTTTG 和shACTG1-R：CCCAACCCCATGTAAGACCG引物，primeSTAR酶擴(kuò)增，98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 5s(38個(gè)循環(huán))；72℃ 2 min；25℃ ∞。電泳切膠回收后，按照Surveyor 凝膠電泳突變檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞檢測(cè)

ACTG1基因標(biāo)記組的細(xì)胞，電轉(zhuǎn)染20 μL體系添加的質(zhì)粒是：250 ng基因組編輯的gRNA質(zhì)粒、250 ng供體模板gRNA質(zhì)粒pCAS9-mCherry-Frame+1、500 ng供體模板質(zhì)粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR。同時(shí)單獨(dú)電轉(zhuǎn)500 ng供體模板質(zhì)粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR樣品，觀察細(xì)胞熒光。電轉(zhuǎn)陽性細(xì)胞樣品250 ng紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)質(zhì)粒pCAS9-mCherry-Frame+1和250 ng綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)質(zhì)粒pMAX，作為流式細(xì)胞儀紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。電轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)72 h，用熒光顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞GFP和RFP表達(dá)。然后收集細(xì)胞。重懸在0.5 mL的PBS中，流式細(xì)胞儀分析(BDFACSAriaⅢ，F(xiàn)ACSDiva Version 6.1.3)。FITC通道檢測(cè)GFP細(xì)胞，PE通道檢測(cè)RFP細(xì)胞。每份樣品細(xì)胞計(jì)數(shù)超過10 000個(gè)。

1.2.6 單克隆篩選

電轉(zhuǎn)染20 μL體系添加的質(zhì)粒是250 ng pX330-Cas9-ACTG1-2質(zhì)粒、250 ng pCAS9-mCherry-Frame+1質(zhì)粒、500 ng模板質(zhì)粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR，培養(yǎng)60 h，加入嘌呤霉素1 μg/mL培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)5 d，直至培養(yǎng)皿底部形成細(xì)胞克隆。用PBS漂洗2遍。然后加入8倍稀釋的PBS胰酶替代物消化液，室溫靜置7 min。在體式顯微鏡下用口吸管吸取單克隆細(xì)胞。轉(zhuǎn)入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過1次傳代培養(yǎng)，直至長(zhǎng)滿3孔，收集用于檢測(cè)。

1.2.7 測(cè) 序

將收集的嘌呤霉素抗性篩選的單克隆細(xì)胞，用30 μL QuickExtract DNA 抽提液裂解細(xì)胞，水浴65℃ 10 min；95℃ 15 min。獲得的細(xì)胞裂解液作為基因組DNA模板，ShACTG1-F和shACTG1-R引物，primeSTAR酶擴(kuò)增，98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 6 min(38個(gè)循環(huán))；72℃ 10 min；25℃ ∞。電泳切膠回收后，PCR產(chǎn)物直接送樣測(cè)序，測(cè)序引物是ShACTG1-F 和shACTG1-R。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊成纖維細(xì)胞ACTG1基因終止密碼子附近CRISPR-Cas9的gRNA靶向活性

綿羊成纖維細(xì)胞ACTG1基因終止密碼子附近設(shè)計(jì)的3個(gè)gRNA位點(diǎn)，電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入CRISPR-Cas9表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒，培養(yǎng)72 h后。圖1

圖1 Surveyor檢測(cè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的電泳圖Fig.1 CRISPR-Cas9 surveyor detection gel electrophoresis map

1、2和3號(hào)泳道樣本同正常細(xì)胞C泳道樣品比較，存在不同的DNA異源雙鏈雜交酶切帶型，說明3個(gè)設(shè)計(jì)的gRNA靶點(diǎn)，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，在綿羊成纖維細(xì)胞的基因組ACTG1基因終止密碼子靶點(diǎn)附近，成功誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞修復(fù)后產(chǎn)生突變。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

熒光顯微鏡觀察標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組，看到有RFP細(xì)胞和紅綠兩色的熒光細(xì)胞，初步判定GFP基因標(biāo)記成功。熒光顯微鏡觀察供體模板質(zhì)粒pCRISPaint-TagGFP2-PuroR的細(xì)胞樣品，未見到GFP。流式細(xì)胞儀檢測(cè)坐標(biāo)圖顯示，Q1區(qū)域是RFP細(xì)胞，Q2區(qū)域是RFP+GFP雙色熒光細(xì)胞，Q4區(qū)是GFP細(xì)胞。pX330-Cas9-ACTG1-1、pX330-Cas9-ACTG1-2和pX330-Cas9-ACTG1-3質(zhì)粒電轉(zhuǎn)標(biāo)記組，紅綠雙色熒光細(xì)胞比率占整個(gè)檢測(cè)細(xì)胞分別是0.4%、1.4%、0.8%。圖2

注：Q1(左上象限)為Y軸陽性細(xì)胞；Q2(右上象限)為雙陽性細(xì)胞；Q3(左下象限)為雙陰性細(xì)胞；Q4(右下象限)為X軸陽性細(xì)胞Note:圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)綿羊ACTG1羧基端標(biāo)記效率Fig.2 FACS analysis and efficiency of C-terminal tag GFP in sheep ACTG1 gene

由于pCAS9-mCherry-Frame+1質(zhì)粒表達(dá)RFP，流式細(xì)胞儀檢測(cè)計(jì)數(shù)的RFP細(xì)胞數(shù)量(Q2+Q1)，就是pCAS9-mCherry-Frame+1質(zhì)粒在綿羊成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)采用的轉(zhuǎn)染體系，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，pCAS9-mCherry-Frame+1質(zhì)粒在綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)4%～7.5%。而pMAX細(xì)胞樣品組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率達(dá)40%。轉(zhuǎn)染效率差異顯著的主要原因是2個(gè)質(zhì)粒大小差異顯著，pMAX(3 486 bp)和pCAS9-mCherry-Frame+1(10 122 bp)。

2.3 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

終止密碼子5’連接端，ShACTG1-F測(cè)序結(jié)果比較分析顯示，整合的外源基因片段，消除了終止密碼子。缺失和插入堿基數(shù)都是3連密碼子整數(shù)倍，整體序列沒有發(fā)生移碼，編碼框可以正常編碼GFP密碼子。篩選得到克隆細(xì)胞株都實(shí)現(xiàn)了GFP基因編碼框的正確閱讀，可以正常轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)蛋白，這也符合抗性標(biāo)記嘌呤霉素選擇的結(jié)果。圖3

圖3 ACTG1羧基端標(biāo)記5’測(cè)序結(jié)果比對(duì)Fig.3 Comparison of 5 'sequencing results of ACTG1 C-terminal tag GFP

終止密碼子3’連接端，ShACTG1-R測(cè)序結(jié)果比較分析顯示，抗性標(biāo)記選擇的細(xì)胞克隆，整合了不同長(zhǎng)度的供體模板骨架。紅色字母是綿羊細(xì)胞基因組序列，下劃線黑斜體字母是pCRISPaint-TagGFP2-PuroR骨架序列。后面數(shù)字是3’端堿基對(duì)應(yīng)的供體模板質(zhì)粒骨架上的位置。圖4

圖4 ACTG1羧基端標(biāo)3’測(cè)序結(jié)果比對(duì)Fig.4 Comparison of 3 'sequencing results of ACTG1 C-terminal tag

3 討 論

人工核酸內(nèi)切酶(Engineered endonuclease,EEN)定點(diǎn)切割基因組，產(chǎn)生特定位點(diǎn)基因組雙鏈斷裂(Double-strand brakes,DSBs)或切口(Nicks)，為剖析生物體的基因功能研究和應(yīng)用，開辟了新的方式[1,2,8,9,10]。

提高外源基因精確導(dǎo)入基因組的效率，是基因組編輯重要應(yīng)用之一[11]。基因?qū)肫鹪从诨虼虬屑夹g(shù)[12]。基因打靶技術(shù)利用了HR修復(fù)途徑，將外源DNA片段精確導(dǎo)入靶位點(diǎn)?；虼虬屑夹g(shù)效率極其低，主要是因?yàn)镠R修復(fù)途徑在細(xì)胞內(nèi)采用頻率低。當(dāng)EEN在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB后，存在3條可能的修復(fù)途徑：HR、NHEJ和MMEJ[13]。NHEJ修復(fù)途徑在細(xì)胞內(nèi)采用頻率非常高，為了獲得高的基因?qū)胄?，NHEJ修復(fù)途徑是一個(gè)較好的選擇。通過NHEJ修復(fù)途徑，獲得了較高的基因?qū)胄蔥14-19]。在細(xì)胞內(nèi)，利用EEN同時(shí)在活細(xì)胞的基因組和供體模板中誘導(dǎo)DSB，通過NHEJ修復(fù)途徑，使得線性化供體模板和切割的基因組之間發(fā)生連接。在斑馬魚和植物中，敲入效率達(dá)30%[17,19]。

CRISPaint技術(shù)是模塊化基因標(biāo)記系統(tǒng)，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)共同實(shí)現(xiàn)基因組和供體模板不同靶點(diǎn)斷裂，通過NHEJ修復(fù)途徑，將供體模板導(dǎo)入基因組特定位點(diǎn)[3,5]。利用CRISPaint技術(shù)，在綿羊成纖維細(xì)胞ACTG1基因羧基端標(biāo)記GFP效率達(dá)1.4%。通過嘌呤霉素選擇，獲得了基因標(biāo)記成功的單克隆細(xì)胞。

測(cè)序嘌呤霉素選擇獲得的單克隆細(xì)胞，顯示NHEJ連接修復(fù)呈現(xiàn)不同序列，缺失和插入堿基數(shù)都是3連密碼子整數(shù)倍，整體序列沒有發(fā)生移碼，編碼框可以正常編碼GFP和嘌呤霉素抗性蛋白。NHEJ修復(fù)連接產(chǎn)生很多結(jié)果，而那些發(fā)生移碼的修復(fù)細(xì)胞，在嘌呤霉素選擇下將無法生存。單克隆細(xì)胞3’端連接，呈現(xiàn)不同的骨架片段，說明線性化供體模板在細(xì)胞內(nèi)受多種因素作用，發(fā)生不同位點(diǎn)斷裂。

利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，結(jié)合MMEJ修復(fù)途徑，也實(shí)現(xiàn)了高效的基因組定點(diǎn)整合外源基因[20,21,22]。該方法由于需要微同源臂，實(shí)施起來需要針對(duì)不同位點(diǎn)構(gòu)建包含微同源臂質(zhì)粒。CRISPaint方法利用NHEJ修復(fù)途徑，包含大量模塊化質(zhì)粒。如果是標(biāo)記或干擾目的基因，無需構(gòu)建質(zhì)粒。CRISPR-Cas9系統(tǒng)，結(jié)合NHEJ精確導(dǎo)入外源基因，是一種高效便利的技術(shù)[3,4]。

4 結(jié) 論

CRISPaint通過cNHEJ在CRISPR-Cas9作用的細(xì)胞中整合異源遺傳物質(zhì)，提供了一種簡(jiǎn)單、精確和快速的方法[3]。利用CRISPaint能夠快速有效的將大的外源DNA序列插入綿羊成纖維細(xì)胞的預(yù)定基因組位點(diǎn)。針對(duì)綿羊ACTG1基因終止密碼子位點(diǎn)，導(dǎo)入熒光標(biāo)記基因，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，整合效率達(dá)1.4%。同時(shí)，pCAS9-mCherry-Frame+1質(zhì)粒在綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率是4%～7.5%，說明10 kb左右大小的Cas9相關(guān)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率較低。因此，提高CRISPaint系統(tǒng)的Cas9相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，將改善外源基因定點(diǎn)整合進(jìn)入綿羊成纖維細(xì)胞基因組的效率。