王 重，樊哲儒，張躍強(qiáng)，李劍峰，高 新，時 佳

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆南疆三地州(喀什地區(qū)、和田地區(qū)和克孜勒蘇柯爾克孜自治州)果麥間作比例占70%左右，形成了南疆三地州特有的林果與種植業(yè)復(fù)合生產(chǎn)模式[1]。農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)中，林果植物冠層對入射光產(chǎn)生攔截作用，改變了小麥接收到的入射光質(zhì)量，降低小麥光合有效輻射和產(chǎn)量[2,3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高等植物體內(nèi)參與光合作用的重要物質(zhì)是葉綠素，包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等，其中葉綠素a和葉綠素b主要發(fā)揮吸收光能的作用，前者偏向?qū)t光的吸收，而后者更偏向?qū)λ{(lán)紫光的吸收。農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)中由于木本植物林冠層的遮蔽作用減少了小麥接收到的入射光，漫射光增加，紅光減少，藍(lán)紫光增加，葉片單位葉面積葉綠體體積增大，數(shù)量減少，葉綠素含量尤其是葉綠素b的含量增加，葉綠素a/b值下降[4,5]，捕捉漫射光中含量較高的較短波長藍(lán)紫光，提高光能利用效率；提高捕光色素復(fù)合體LHCP的含量，增加基粒數(shù)與基粒片層[6,7]；均衡激發(fā)光能在光系統(tǒng)PS I和PS II間的分配[7,8]；葉綠素b含量增加后，葉綠素a/b值下降，對于光合電子傳遞具有重要影響；葉綠素a/b值下降，增加了葉綠體對2，6-二氯酚靛酚的還原能力，增強(qiáng)了葉綠體的光合磷酸化活性，使捕光色素維持在較高水平，可吸收更多光能[9,10]?！颈狙芯壳腥朦c】葉綠素b是葉綠素a經(jīng)葉綠素酸酯a氧化酶和葉綠素合成酶共同作用形成的，此途徑是葉綠素b形成的惟一途徑，葉綠素酸酯a氧化酶(CAO)基因是催化葉綠素b合成的唯一主控基因[11,12]。研究小麥葉綠素酸酯a氧化酶(TaCAO)基因的克隆與表達(dá)分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)GenBank上的已知序列，結(jié)合小麥基因組測序信息，以新疆南疆果麥間作主栽小麥品種新冬20號為材料，克隆小麥葉綠素酸酯a氧化酶(CAO)基因ORF，并對其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系等生物信息學(xué)分析，在不同光照強(qiáng)度下通過半定量PCR方法分析TaCAO的表達(dá)差異，為農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)中小麥對于弱光環(huán)境在葉綠素合成層面的響應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

取新冬20號旗葉迅速置于液氮中，凍存于-80℃冰箱中備用。

Trizol、MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix、2X 高保真PCR Mix預(yù)混液、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、TA克隆載體pUCm-T Vector、大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海生工，6×Loading buffer購自TAKARA公司，2×PCR Master Mix購自博邁德公司，GoldViewTM、DL2000購自北京莊盟生物，其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。PCR引物合成及DNA測序服務(wù)均由上海生工提供。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取小麥旗葉總RNA，取1 μL進(jìn)行檢測，使用Nanodrop分光光度計檢測RNA質(zhì)量，并跑瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度。使用MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA凍存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2CAO基因ORF克隆

根據(jù)GenBank上公布的擬南芥CAO基因序列在小麥基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，篩選出位于3號染色體上的TaCAO基因序列。利用Primer Premier 5.0軟件參照序列設(shè)計特異性引物：TaCAO-F：GCGTCCATGACCACAGTG；TaCAO-R：TGTTTGCCTATGATCCACTC。

以小麥cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，獲得的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的基因，退火溫度49～52℃。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收大小正確條帶連接至pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α后37℃暗培養(yǎng)20 h。挑取白斑進(jìn)行PCR驗證，陽性克隆送至上海生工測序。

1.2.3 生物信息學(xué)

將測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的ORF Finder、BLAST、CD-search等工具進(jìn)行在線比對，確定序列完整編碼框、同源序列及保守結(jié)構(gòu)域；使用序列處理在線工具包(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)分析TaCAO編碼蛋白的氨基酸序列；使用蛋白分析系統(tǒng)ExPASy(http://www.expasy.org/protparam)分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)[13]；使用SoftBerry在線軟件(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)對蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測；使用在線工具TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；使用在線分析工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的疏水性/親水性[14,15]；使用在線軟件SOPMA分析蛋白二級結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)[16]；使用在線工具Smart(http://smart.embl.de/smart/)分析該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域[17,18]；通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對分析[19]，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[20,21]。

1.2.4 不同光強(qiáng)下TaCAO表達(dá)變化

新冬20號生長至三葉一心期，分別置于900、1 800、3 600和7 200 lx光照強(qiáng)度下處理3 h，提取葉片RNA并反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行半定量PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

研究表明，OD260/280=1.94，28S條帶最亮，提取RNA質(zhì)量較好。圖1

2.2 TaCAO克隆

研究表明，在1.6 KB左右有明顯特異性條帶，與已知CAO基因的ORF全長接近，回收目的片段并構(gòu)建克隆載體進(jìn)行測序。圖2

2.3 TaCAO基因的核酸與蛋白質(zhì)序列

研究表明，小麥CAO基因開放閱讀框的長度為1 653 bp；GC含量為53.4%，編碼包含550個氨基酸的蛋白質(zhì)，含量最高的氨基酸為亮氨酸(11.5%)和絲氨酸(7.8%)，半胱氨酸(2.4%)和色氨酸(2.5%)含量最少。表1

表1 TaCAO編碼蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of the protein encoded by TaCAO

2.4 TaCAO編碼蛋白的基本理化性質(zhì)

研究表明，TaCAO編碼蛋白的大小約為62.12 KD，原子總數(shù)為8 696，理論等電點為7.00，其負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為63個，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為62個；脂肪指數(shù)為83.82；不穩(wěn)定指數(shù)(II)為37.12(不穩(wěn)定指數(shù)<40時，表示穩(wěn)定)，親水性平均值為-0.309(親水性平均值<0代表親水性)，小麥CAO為親水性的穩(wěn)定蛋白。TaCAO編碼蛋白包含一個35個氨基酸殘基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，定位于葉綠體中。表2

表2 TaCAO編碼蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 The physical and chemical properties analysis of the protein encoded by TaCAO

2.5 TaCAO編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

研究表明，該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈以及β-轉(zhuǎn)角組成，其中無規(guī)則卷曲(44.18%)和α-螺旋(37.64%)的含量最高，β-轉(zhuǎn)角(5.09%)含量最低。無規(guī)則卷曲均勻分布于整條肽鏈，而α-螺旋則較為集中的分布于多肽鏈兩端。表3，圖3

表3 TaCAO編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)比例Table 3 Proportion of secondary structure of the protein encoded by TaCAO

2.6 TaCAO編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

研究表明，該蛋白質(zhì)包含5個保守結(jié)構(gòu)域，分別是PLN02281、Rieske_RO_Alpha_CAO、Rieske、HcaE和nirD_assim_sml。其中PLN02281和Rieske_RO_Alpha_CAO均是與葉綠素酸酯a氧化酶功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。圖4

2.7 TaCAO編碼蛋白的同源性

研究表明，TaCAO編碼蛋白與大麥(Hordeumvulgare，AF173228.1)同源性最高，為99.45%，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon，XP_003565123.1)次之，同源性為94.73%，與水稻(OryzasativaJaponicaGroup，XP_015614086.1)、矢竹(Pseudosasajaponica，AMH40452.1)、糜子(Panicummiliaceum，RLN22716.1)、高粱(Sorghumbicolor，XP_002459143.1)、玉米(Zeamays，NP_001151343.1)、小米(Setariaitalica，XP_004971349.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_175088.1)的同源性分別為86.18%、86.18%、84.91%，84.03%、83.67%、83.43%和67.39%。不同植物CAO氨基酸序列具有較高保守性，TaCAO編碼蛋白可能與其他植物的CAO具有相同的進(jìn)化起源。小麥CAO與大麥CAO親緣關(guān)系最近，與糜子和小米親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。圖5，圖6

2.8 不同光強(qiáng)下TaCAO表達(dá)

研究表明，TaCAO相對表達(dá)量隨著光照強(qiáng)度減弱而逐步增強(qiáng)，呈現(xiàn)遞增關(guān)系。900 lx光照強(qiáng)度下TaCAO相對表達(dá)量最高，7 200 lx光照強(qiáng)度下TaCAO相對表達(dá)量最低，弱光環(huán)境下TaCAO表達(dá)是上調(diào)的。圖7

3 討 論

葉綠素酸酯a加氧酶(CAO)是一種Rieske型單加氧酶，能夠?qū)Ｒ恍缘淖R別葉綠素酸酯a，通過對其C7側(cè)鏈上的甲基(-CH3)進(jìn)行兩步氧化反應(yīng)使其形成甲酰基(-CHO)，轉(zhuǎn)變?yōu)槿~綠素酸酯b[22]；然后再由葉綠素合酶催化在葉綠素酸酯b的D環(huán)上加一個植醇合成葉綠素b。葉綠素酸酯a 氧化酶(CAO)在葉綠素a、b的轉(zhuǎn)化和平衡中具有極其重要的作用。

在線分析氨基酸序列，在試驗中克隆得到的TaCAO編碼蛋白含有一個35個氨基酸殘基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，還存在Rieske_RO_Alpha_CAO和Rieske鐵硫配位中心2個保守結(jié)構(gòu)域，與姜可以[23]、Yamasato[24]等的研究結(jié)果一致。在該蛋白序列中還存在苯丙氨酸雙加氧酶和亞硝酸還原酶2個活性位點，可能在葉綠素b合成過程中參與了表達(dá)調(diào)控作用。

對獲得的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，禾本科植物中的CAO相似性全都在80%以上，大麥、二穗短柄草等親緣關(guān)系較近的植物相似性更是達(dá)到了90%以上，進(jìn)化分析結(jié)果表明，小麥CAO與大麥CAO的親緣關(guān)系最近，同時擬南芥CAO與高粱、玉米CAO的親緣關(guān)系也較近，在高等植物中CAO可能存在相同的進(jìn)化起源，也具有高度的保守性。

通過半定量PCR對TaCAO在不同光照強(qiáng)度下的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，弱光環(huán)境下該基因表達(dá)上調(diào)，其相對表達(dá)量與光照強(qiáng)度呈現(xiàn)出反比關(guān)系。TaCAO表達(dá)量的提高能夠增加小麥葉片中葉綠素b含量，增強(qiáng)對于較短波長的藍(lán)紫光的吸收能力，使小麥在弱光環(huán)境下仍然能夠保持較高水平的光合效率。

4 結(jié) 論

由小麥品種新冬20號中克隆了小麥葉綠素酸酯a氧化酶基因TaCAO，該基因ORF長度為1 653 bp，編碼由550個氨基酸殘基組成的蛋白，大小為62.12 kD，含有葉綠素轉(zhuǎn)運肽和Rieske_RO_Alpha_CAO結(jié)構(gòu)域，還存在一個Rieske鐵硫配位中心和鐵結(jié)合位點，具有完整的CAO活性。該蛋白與大麥的親緣關(guān)系最近，并具有較高的保守性。該基因的表達(dá)與光照強(qiáng)度呈現(xiàn)反比關(guān)系，在小麥適應(yīng)弱光環(huán)境中可能發(fā)揮了保持光合效率的作用。