外泌體非編碼RNA在肝纖維化中的作用及機制

錢南南， 唐露露， 魏濤華,， 楊 悅， 郝文杰， 楊文明,3

1 安徽中醫(yī)藥大學 研究生院， 合肥 230038； 2 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 合肥 230031；3 新安醫(yī)學教育部重點實驗室， 合肥 230038

肝纖維化是由多種病因(如血吸蟲、慢性病毒性肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、銅代謝性疾病、膽汁淤積和自身免疫性肝病)引起的慢性肝損傷，可逐漸發(fā)展為肝硬化，甚至引起肝癌的發(fā)生。近些年研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化是一個可逆轉(zhuǎn)的過程，給肝纖維化的臨床治療帶來了希望。肝纖維化發(fā)展過程中主要是由肝星狀細胞(HSC)活化為成纖維細胞，并分泌細胞外基質(zhì)(ECM)。因此，控制HSC的活化過程將是肝纖維化的理想治療策略。大量研究表明，非編碼RNA(ncRNA)對HSC活化、增殖、遷移、轉(zhuǎn)化等過程起著重要作用。ncRNA主要包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)、短鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA(circRNA)等幾大類，其中與肝纖維化相關(guān)的主要有：lncRNA包括MALAT1、H19、GAS5、MEG3、PVT1和P21等；短鏈非編碼RNA包括微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、PIWI-interacting RNA(piRNA)和小干擾RNA(siRNA)等。細胞外囊泡包括外泌體、微囊泡和凋亡小體，外泌體是由大小為30～100 nm的膜囊泡構(gòu)成。外泌體可以由各種動物的大部分細胞所分泌。在正常和病理情況下，外泌體參與眾多的生物學過程。有證據(jù)[1]表明，外泌體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和各種形式的RNA(例如miRNA、lncRNA等)?，F(xiàn)就外泌體ncRNA在肝纖維化中的作用進行深入探析，以期為肝纖維化治療藥物尋找潛在新靶點。

1 外泌體lncRNA與肝纖維化

1.1 外泌體MALAT1 MALAT1基因位于人染色體11q13和小鼠染色體19qA內(nèi)。MALAT1與許多蛋白質(zhì)編碼基因(如β-肌動蛋白，GAPDH)相當甚至具有更高的表達水平。MALAT1基因在人類中約為7 kb。先前有研究[2]發(fā)現(xiàn)，MALAT1可與miR-101b競爭來調(diào)節(jié)rac1的表達，影響HSC的增殖、細胞周期和激活，從而增加ECM的沉積。此外，MALAT1也可能通過介導SIRT1的下調(diào)，來活化肝星狀細胞系LX-2細胞，導致肝纖維化的形成[3]。而Dai等[4]研究發(fā)現(xiàn)，使用砷酸鹽可誘導肝細胞系L-02細胞MALAT1的過表達，并且MALAT1可以通過外泌體轉(zhuǎn)運到LX-2細胞中，并認為MALAT1可通過miR-26b調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白A2促進LX-2細胞的激活。由此可見，MALAT1可通過多種方式導致肝纖維化的形成。因此，外泌體中MALAT1可作為肝纖維化逆轉(zhuǎn)的一個潛在靶點。

1.2 外泌體H19 H19是一種lncRNA，受H19和IGF2之間的位點甲基化的基因組印跡調(diào)控，越來越多的研究表明，H19具有許多不同的生物學功能。包括參與細胞增殖和分化，以及其在癌癥中作為癌基因角色和腫瘤抑制劑等。H19主要在膽管細胞中表達，其能通過外泌體轉(zhuǎn)移至肝細胞中顯著下調(diào)小分子異二聚體伴侶的表達、調(diào)節(jié)S1PR2/SphK2和LET-7/HMGA2介導的途徑、增加G1/S細胞周期轉(zhuǎn)變促進HSC的增殖和激活等途徑進而在調(diào)節(jié)膽管細胞增殖和促進肝纖維化方面發(fā)揮重要作用[5]。此外H19還可以作為miRNAs的分子海綿(如let-7 miRNAs)，在膽汁性肝硬化的發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

1.3 外泌體GAS5 GAS5 RNA基因位于細胞遺傳學帶1q25.1，GAS5基因有31個轉(zhuǎn)錄本，其中20個為保守的內(nèi)含子，而11個為lncRNA。GAS5可以結(jié)合DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其無法調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。GAS5可通過充當miR-222的競爭內(nèi)源RNA(ceRNA)而增加p27蛋白的水平，從而抑制HSC的活化和增殖[6]。GAS5可作為miR-23a的分子海綿，從而競爭性地降低miR-23a的表達水平。miR-23a與PTEN的相互作用以及PTEN的降解進一步影響了下游信號通路PI3K/Akt/mTOR/ Snail，導致E-鈣黏蛋白表達水平降低和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白的表達水平增加，從而導致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[7]。據(jù)報道[8]，外泌體GAS5的上調(diào)參與細胞凋亡過程，另外，有研究[9]表明，GAS5可通過外泌體途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的凋亡，來發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。作為細胞外囊泡，外泌體在細胞間通訊中至關(guān)重要，并且可能是GAS5的關(guān)鍵載體[10]，因此，推測GAS5亦可通過外泌體途徑影響上述通路發(fā)揮抗纖維化作用。

1.4 外泌體MEG3 MEG3基因位于人染色體14q32.3區(qū)域的印跡DLK1-MEG3基因座上。MEG3在正常組織中表達，但在許多人類腫瘤和腫瘤衍生細胞系中丟失或減少。近些年已有研究[11-13]表明，含有MEG3的外泌體在腫瘤積液、宮頸陰道灌洗液、尿液中檢測到，并在宮頸癌、高度漿液性癌和Hunner型間質(zhì)性膀胱炎中起到作用。而關(guān)于肝纖維化的外泌體MEG3暫未有相關(guān)報道。有報道[14]指出，MEG3的過表達可激活p53并介導細胞色素c的釋放，隨后導致TGFβ1處理的LX-2細胞發(fā)生caspase-3依賴性的凋亡。這些發(fā)現(xiàn)表明，MEG3可能在HSC活化和肝纖維化進展中起重要作用，并作為肝纖維化的新型潛在治療靶標。此外，MEG3亦可通過SMO蛋白和miR-212抑制Hh信號通路介導的肝纖維化上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[15]。由此，預測MEG3可通過外泌體途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用，但還需要進一步研究。

1.5 外泌體PVT1 PVT1是一類lncRNA，人PVT1基因位于8q24，這是公認的與癌癥相關(guān)的區(qū)域。PVT1已被證明與肝纖維化相關(guān)。有研究[16]表明，通過PVT1-miR-152-ATG14信號通路的自噬誘導有助于缺氧條件下HSC的激活。目前還未有外泌體PVT1在肝纖維化中的相關(guān)研究。但是，Meng等[17]報道外泌體介導的PVT1通過miR-93-5p調(diào)節(jié)的HMGB1/TLR4/NF-κB通路來調(diào)節(jié)脂多糖(LPS)誘導的骨關(guān)節(jié)炎進展。Wu等[18]通過實驗發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細胞來源的外泌體攜帶的lncRNA PVT1共同作用于miR-21-5p，以上調(diào)SOCS5并使JAKs/STAT3途徑失活，從而減少炎癥并保護自身免疫性腦脊髓炎小鼠。由此，將外泌體PVT1擴展在肝纖維化中，預測亦可發(fā)揮相應作用。

1.6 外泌體P21 P21基因位于人類染色體6p21.2上，位于細胞周期調(diào)控基因p21/Cdkn1a的上游，首次被描述為小鼠胚胎成纖維細胞p53依賴性凋亡的誘導劑。P21有兩種亞型，它們都包含一個外顯子和Alu反向重復序列。據(jù)報道[19]，P21在HBV感染者血清中的水平低于健康對照者，且血清P21水平與感染者的肝纖維化階段呈負相關(guān)。Zheng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，P21的過度表達在體外抑制HSC的激活。慢病毒介導的P21轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)可降低肝纖維化的嚴重程度。Tu等[21]發(fā)現(xiàn)P21作為TGFβ信號的下游效應，通過與miR-30相互作用來增強TGFβ信號并介導其促進肝纖維化的作用。有報道[22]，在非小細胞肺癌患者引流靜脈血液及前列腺癌尿液中檢測到含有P21的外泌體。肝纖維化有關(guān)外泌體P21尚未有文獻報道，有待進一步研究。

2 外泌體短鏈非編碼RNA與肝纖維化

2.1 外泌體miRNA miRNA是一種由22個左右的核苷酸構(gòu)成的短鏈非編碼RNA。通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，影響多種細胞過程，包括細胞分化、能量代謝和代謝應激。根據(jù)近些年報道，與肝纖維化相關(guān)的miRNA有近百種，如能促進肝纖維化的有miR-200c[23]、miR-942[24]、miR-302c[25]、miR-182[26]、miR-195[27]等；具有抗肝纖維化作用的包括miR-30/miR-193[28]、miR-30[29]及miR-326[30]。有趣的是，一些研究發(fā)現(xiàn)miR-21[31-32]和miR-145[33-34]具有相反作用，既有促進肝纖維化又具有抗纖維化作用，因此具體的機制有待進一步研究。在外泌體miRNA相關(guān)研究[35]中發(fā)現(xiàn)，肝硬化肝癌患者血清和腹水中外泌體miR-182、miR-301a和miR-373的表達水平顯著增加。有研究[36]表明，miR-122和miR-214可通過外泌體介導抑制HSC的活化，從而達到抗纖維化的作用。此外，miR-181-5p則可通過外泌體介導抑制STAT3/Bcl-2-Beclin 1途徑來增加自噬并減少TGFβ1誘導的肝纖維化[37]。又有報道[38]，miR-199a-5p可通過外泌體作用于結(jié)締組織生長因子(CCN2)，導致CCN2及其下游靶標α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白α1的表達降低，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。miR-223通過外泌體途徑調(diào)控NLRP3和caspase-1發(fā)揮保肝作用[39]，而miR-103-3p可通過外泌體介導靶向Krüppel樣因子4(KLF4)促進HSC的增殖和激活[40]。外泌體miRNA與肝纖維化的關(guān)系總結(jié)詳見表1。

2.2 外泌體snoRNA snoRNA是一類保守的核RNA家族，在核糖體亞單位成熟過程中參與小核RNA(snRNA)或核糖體RNA(rRNA)的修飾或加工。snoRNA越來越多地被證實參與調(diào)控新類型的轉(zhuǎn)錄后過程，例如RNA乙?；⒓艚幽Ｊ降恼{(diào)節(jié)、mRNA豐度的控制和翻譯效率，或者它們本身被加工成更短的穩(wěn)定的RNA種類。先前已證實，在肝硬化患者體內(nèi)snoRNA包括SNORD115-31、SNORD37、SNORD121B被下調(diào)。一項研究[41]表明，LPS可以在小鼠模型、人類受試者及巨噬細胞培養(yǎng)基中刺激snoRNA U32a(SNORD32a)、U33(SNORD33)、U34(SNORD34)和U35a(SNORD35a)的分泌，分泌的snoRNA和外泌體共同體被受體細胞吸收。在鼠模型中，證明外泌體snoRNA通過循環(huán)并在遠端的組織中發(fā)揮功能。然而關(guān)于snoRNA在肝纖維化中的研究較少。有研究[42]表明，通過抑制SNHG7(一種snoRNA)可以抑制肝纖維化。進一步實驗表明，可能是SNHG7充當ceRNA，通過與miR-29b結(jié)合來影響DNMT3A(miR-29b的下游靶基因)的表達，從而影響HSC的活化、自噬和增殖。

2.3 外泌體piRNA piRNA是一類小RNA，長度為24～31個核苷酸。它們與PIWI蛋白締合，后者構(gòu)成Argonaute家族的種系特異性亞群，形成稱為piRNA誘導的沉默復合物的效應物復合物，該復合物通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機制抑制轉(zhuǎn)座子并維持種系基因組完整性。除了在轉(zhuǎn)座子沉默中起作用外，多種生物中的piRNA還可以調(diào)控細胞基因。越來越多的證據(jù)表明，piRNA在癌癥發(fā)展中同時具有致癌作用和抑癌作用。但piRNA在肝纖維化中的作用研究較少。有研究[43]表明，激活的HSC中piR-823顯著上調(diào)，進一步實驗表明，活化的HSC可促進piR-823的合成，另一方面piR-823上調(diào)又可以促進HSC的活化。其機制可能為piR-823與EIF3B(真核起始因子3B)結(jié)合，并且該復合物進一步募集TGFβ1的mRNA并產(chǎn)生TGFβ1，TGFβ1激活靜止的HSC所致。先前已有相關(guān)報道[44]，在血清、腦脊髓液、尿液等體液中檢測到含有piRNA的外泌體。因此，在肝纖維化中的外泌體piRNA需要進一步研究。

2.4 外泌體siRNA siRNA是一種由21～23個堿基對構(gòu)成的雙鏈RNA，包括兩個突出核苷酸的羥基化3′末端。與靶mRNA具有序列互補性的siRNA反義鏈可誘導序列特異性基因表達沉默，這被稱為RNA干擾(RNAi)。RNAi首先在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，后來在植物、動物和人類細胞中發(fā)現(xiàn)。越來越多關(guān)于siRNA的研究，其中也涉及到治療肝纖維化，Toriyabe等[45]研究發(fā)現(xiàn)siRNA可抑制HSCⅠ型膠原蛋白α1、TGFβ、α-SMA的表達。Zhang等[46]用siRNA可干擾CTGF、TIMP-1、procol-α1、PCⅢ在肝組織中的蛋白表達水平。Ge等[47]則發(fā)現(xiàn)，GRB2 siRNA消除了HMGB1誘導的HSC增殖以及上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白α1和α-SMA的作用。雖然越來越多關(guān)于siRNA的應用研究，但siRNA如何到達靶細胞發(fā)揮作用從而限制了siRNA發(fā)展

表1 外泌體miRNA與肝纖維化的關(guān)系

的機制仍不明確。目前除了常規(guī)局部及血清用藥，還有化學修飾、脂質(zhì)體、病毒載體、納米顆粒等傳遞系統(tǒng)。近些年以外泌體為載體的研究越來越多應用于臨床中，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、眼部疾病、肝臟疾病、腎臟疾病等。Pan等[48]發(fā)現(xiàn)從人肝癌細胞釋放的外泌體可以使siRNA在肝細胞之間穿梭，并抑制小鼠肝細胞中CD81的表達，這些結(jié)果使基于外泌體的siRNA在肝纖維化的治療領(lǐng)域得到進一步擴展。

3 外泌體circRNA與肝纖維化

circRNA是一種共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA，沒有5′端和3′端之分，主要由前體mRNA通過外顯子的反向剪接形成。circRNA在肝病中有很多作用機制，包括microRNA海綿、蛋白質(zhì)翻譯、RNA支架、mRNA制動等。有研究[49]表明，通過分析CCl4小鼠肝纖維化模型肝組織中circRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)肝纖維化模型組和正常對照組之間有69個circRNAs的差異表達，其中14個上調(diào)，55個下調(diào)。進一步研究[50]發(fā)現(xiàn)，circ-PWWP2A可通過充當miR-203和miR-223的分子海綿促進HSC的活化和增殖。Ji等[51]研究發(fā)現(xiàn)，Hsa_circ_0070963作為miR-223-3p的分子海綿，通過調(diào)節(jié)miR-223-3p和LEMD3來抑制HSC的激活，從而抑制肝纖維化。Wang等[52]研究表明circMTO1通過調(diào)節(jié)miR-17-5p和Smad7抑制肝纖維化，而Jin等[53]發(fā)現(xiàn)circMTO1亦可通過miR-181b-5p介導的PTEN表達抑制HSC活化。Li等[54]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004018/hsa-miR-660-3p/TEP1軸有助于HSC的增殖和激活。Zhu等[55]研究表明，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體傳遞mmu_circ_0000623，通過激活自噬防止肝纖維化。外泌體circRNA研究處于起步階段，但其在尋找治療肝纖維化藥物及新靶點的道路上具有巨大的潛力。

4 小結(jié)與展望

部分研究已經(jīng)證實外泌體中含有多種可調(diào)節(jié)肝纖維化的ncRNA，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ncRNA可通過多種途徑調(diào)節(jié)肝纖維化，包括TGFβ/Smad、Wnt/β-catenin、S1PR2/SphK2和LET-7/HMGA2、AKT/mTOR/p27、PTEN/PI3K/Akt/mTOR/Snail、NF-κB、Notch、Hh、SIRT/P53、STAT3/Bcl-2-Beclin 1和MAPK等信號傳導途徑。并且ncRNA調(diào)節(jié)肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是HSC。此外，ncRNA不同種類之間，也會產(chǎn)生相互作用，比如前面提到的circRNA充當miRNA的分子海綿，lncRNA作為miRNA的ceRNA以及siRNA對于其他ncRNA的干擾作用等。目前對于ncRNA之間的關(guān)聯(lián)性研究相對較少，因此，進一步研究不同類型的ncRNA之間的串擾和表觀遺傳網(wǎng)絡的復雜級聯(lián)，可能會突出關(guān)于肝纖維化進展的新發(fā)現(xiàn)，最終為肝纖維化的治療提供一些新的策略。然而外泌體和ncRNA及其之間的調(diào)控機制還需要進一步研究。從而為尋找肝纖維化治療藥物及尋找潛在靶點提供幫助。肝纖維化是一個可逆轉(zhuǎn)的病理過程，因此肝纖維化的早期干預在肝纖維化的治療過程中顯得尤為重要。但由于肝纖維化的發(fā)病機制復雜，調(diào)控的通路涉及眾多，目前西藥沒有特效藥物，且調(diào)控單一靶點的藥物很難在臨床上發(fā)揮良好的療效，因此具有復合成分，多靶點特點的中藥顯示了獨特的優(yōu)勢。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：錢南南負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；唐露露、魏濤華負責課題設(shè)計，修改論文；楊悅、郝文杰參與收集數(shù)據(jù)；楊文明負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。