大山楂片薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)

劉立輝，常 華，周艷林，鐘小清，呂高榮，鄒 準(zhǔn)，鄒節(jié)明

（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004）

大山楂片是桂林三金藥業(yè)股份有限公司擁有的獨(dú)家中成藥品種，其原藥品標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]。本品具有開(kāi)胃消食的功能，用于食積內(nèi)停所致的食欲不振，消化不良，脘腹脹悶。處方為山楂540 g、六神曲（麩炒）81 g、炒麥芽81 g。制法為以上三味，取山楂、炒麥芽各72.5 g，粉碎成細(xì)粉；其余山楂、炒麥芽和六神曲加水煎煮二次，每次1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.12 ～ 1.16（60 ℃）的清膏，加入上述細(xì)粉及滑石粉17 g、硬脂酸鎂5.7 g，蔗糖粉適量，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成1000片，即得。本品為淡棕色的片，味酸、甜。

近期，本公司在本品種的檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)按照原藥品標(biāo)準(zhǔn)【鑒別】項(xiàng)下的方法處理，山楂對(duì)照藥材溶液難以檢出與熊果酸對(duì)照品溶液和大山楂片供試品溶液相應(yīng)的紫紅色斑點(diǎn)。因此，本研究對(duì)山楂對(duì)照藥材溶液的制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，并改進(jìn)了展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量等色譜條件，最終使山楂對(duì)照藥材溶液能清晰地檢測(cè)出熊果酸的紫紅色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)顯色清晰，分離度好，陰性樣品無(wú)干擾，并使大山楂片供試品溶液的紫紅色斑點(diǎn)的Rf值與山楂對(duì)照藥材溶液、熊果酸對(duì)照品溶液的紫紅色斑點(diǎn)的Rf值一致，使本品種的藥品標(biāo)準(zhǔn)得到進(jìn)一步的提高和優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

REPROSTAR3薄層成像系統(tǒng)（CAMAG公司）；Wincats工作軟件（CAMAG公司）；S7540-12（T）超聲波清洗器[必能信超聲（上海）有限公司]；XP205電子分析天平（METTLER TOLEDO公司，d=0.01 mg）；XP404S電子分析天平（METTLER TOLEDO公司，d=0.1 mg）；P-1型薄層色譜展開(kāi)缸（上海信誼儀器廠有限公司）；硅膠G薄層預(yù)制板（青島海洋化工有限公司，批號(hào)：20150129，規(guī)格：100 mm×100 mm）；硅膠G薄層預(yù)制板（德國(guó)默克公司，批號(hào)：HX247632，規(guī)格：100 mm×100 mm）；硅膠G薄層預(yù)制板（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140212，規(guī)格：100 mm×100 mm）；YOKO-XR薄層顯色加熱器（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

熊果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，含量以99.3 %計(jì)，批號(hào)：110742-201220）；山楂對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供薄層鑒別用，批號(hào)：121626-201402）；大山楂片（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：140501，160601，160602，160603）；缺山楂大山楂片陰性樣品（桂林三金藥業(yè)股份有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取大山楂片6片，研細(xì)，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)檬兔眩?0～60 ℃）浸泡2次，每次5 ml（浸泡約0.5 min），傾去石油醚，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為大山楂片供試品溶液。

2.1.2 原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照藥材溶液的制備 取山楂對(duì)照藥材3 g，加水適量，煎煮約30 min，濾過(guò)，濾液加乙醚30 ml提取，分取乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為山楂對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 改進(jìn)的對(duì)照藥材溶液的制備 取山楂對(duì)照藥材1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成山楂對(duì)照藥材溶液。

2.1.4 原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備 取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為熊果酸對(duì)照品溶液。

2.1.5 改進(jìn)的對(duì)照品溶液的制備 取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含0.4 mg的溶液，作為熊果酸對(duì)照品溶液。

2.1.6 陰性樣品溶液的制備 按本品處方和工藝，不加山楂制成缺山楂的大山楂片陰性樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成缺山楂的大山楂片陰性樣品溶液。

2.2 原標(biāo)準(zhǔn)的薄層鑒別方法

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法[2]，吸取大山楂片供試品溶液與山楂對(duì)照藥材溶液各6 μl、熊果酸對(duì)照品溶液1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（13:1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，山楂對(duì)照藥材溶液在和熊果酸對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上，并沒(méi)有顯示相同的紫紅色斑點(diǎn)，且大山楂片供試品溶液的點(diǎn)樣量明顯過(guò)載，紫紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果與大山楂片原藥品標(biāo)準(zhǔn)【鑒別】項(xiàng)下描述的“供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)”有差異。

圖1 原標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法的色譜圖

2.3 改進(jìn)的薄層鑒別方法

同法，吸取大山楂片供試品溶液、山楂對(duì)照藥材溶液與缺山楂的大山楂片陰性樣品溶液各1～3 μl、熊果酸對(duì)照品溶液1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與山楂對(duì)照藥材色譜和熊果酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無(wú)干擾，說(shuō)明該薄層色譜鑒別方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 改進(jìn)的薄層鑒別方法的色譜圖

2.4 改進(jìn)的薄層鑒別方法的耐用性考察

2.4.1 不同品牌硅膠G薄層預(yù)制板的考察 按照改進(jìn)的薄層鑒別方法，對(duì)3個(gè)不同品牌的硅膠G薄層預(yù)制板（德國(guó)默克公司、青島海洋化工有限公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）進(jìn)行了考察。結(jié)果在3個(gè)不同品牌的硅膠G薄層預(yù)制板上，供試品色譜中，在與山楂對(duì)照藥材色譜和熊果酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無(wú)干擾，表明不同品牌的硅膠G薄層預(yù)制板對(duì)改進(jìn)的薄層鑒別方法無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同品牌薄層預(yù)制板的考察

2.4.2 不同溫度的考察 按照改進(jìn)的薄層鑒別方法，對(duì)低溫（8 ℃）、高溫（35 ℃）進(jìn)行了考察。結(jié)果展開(kāi)溫度為低溫（8 ℃）、高溫（35 ℃）時(shí)，供試品色譜中，在與山楂對(duì)照藥材色譜和熊果酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無(wú)干擾，表明不同溫度的展開(kāi)條件對(duì)改進(jìn)的薄層鑒別方法無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同溫度的考察

2.4.3 不同濕度的考察 按照改進(jìn)的薄層鑒別方法，對(duì)低濕（32 %）、高濕（88 %）進(jìn)行了考察。結(jié)果展開(kāi)濕度為低濕（32 %）、高濕（88 %）時(shí)，供試品色譜中，在與山楂對(duì)照藥材色譜和熊果酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無(wú)干擾，表明不同濕度的展開(kāi)條件對(duì)改進(jìn)的薄層鑒別方法無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同濕度的考察

3 討論

薄層色譜法（TLC）具有成本低、分析時(shí)間短、結(jié)果直觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前仍廣泛應(yīng)用于中藥的定性鑒別分析中。其使用關(guān)鍵點(diǎn)在于對(duì)樣品的前處理、展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量等的選擇。因此，研究者應(yīng)根據(jù)不同藥品的具體處方適當(dāng)調(diào)整薄層色譜鑒別的條件，以便獲得良好的鑒別分析效果[3-8]。

本研究中，原標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法的山楂對(duì)照藥材溶液的色譜中，在與熊果酸對(duì)照品色譜和大山楂片供試品色譜相應(yīng)的位置上，并沒(méi)有顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。而改進(jìn)的鑒別方法的山楂對(duì)照藥材溶液的色譜中，在與熊果酸對(duì)照品色譜和大山楂片供試品色譜相應(yīng)的位置上，卻能顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。經(jīng)分析，系因原標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法的山楂對(duì)照藥材溶液僅參照了大山楂片的部分制備工藝采用水煎煮處理，未能有效提出脂溶性成分熊果酸所致。而改進(jìn)后的薄層鑒別方法的山楂對(duì)照藥材溶液完全參照大山楂片供試品溶液的制備方法采用乙醚超聲處理，則可以提取并檢測(cè)出熊果酸的紫紅色斑點(diǎn)。因此，山楂對(duì)照藥材溶液的制備方法應(yīng)改進(jìn)為按照大山楂片供試品溶液的制備方法同法制備。

本研究中，按照原標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法的色譜條件操作，供試品色譜中熊果酸斑點(diǎn)的Rf值與山楂對(duì)照藥材色譜、熊果酸對(duì)照品色譜斑點(diǎn)的Rf值不完全一致，主要是因?yàn)樵瓨?biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法的展開(kāi)劑欠佳，以及大山楂片供試品溶液、山楂對(duì)照藥材溶液的點(diǎn)樣量和熊果酸對(duì)照品溶液的濃度選擇不當(dāng)，造成點(diǎn)樣量嚴(yán)重過(guò)載出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，本研究對(duì)其色譜條件進(jìn)行了改進(jìn)，選擇熊果酸薄層色譜鑒別常用的展開(kāi)劑：環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.1）[9]代替原標(biāo)準(zhǔn)采用的展開(kāi)劑：三氯甲烷-丙酮（13:1），并將大山楂片供試品溶液、山楂對(duì)照藥材溶液的點(diǎn)樣量改進(jìn)為1～3 μl，將熊果酸對(duì)照品溶液的濃度改進(jìn)為每1 ml含0.4 mg，則解決了熊果酸斑點(diǎn)的拖尾現(xiàn)象問(wèn)題，使供試品色譜中熊果酸斑點(diǎn)的Rf值與山楂對(duì)照藥材色譜、熊果酸對(duì)照品色譜斑點(diǎn)的Rf值一致。

本研究改進(jìn)了大山楂片的對(duì)照藥材的制備方法，使其與供試品溶液的處理方法一致，可以提取并檢測(cè)出熊果酸的紫紅色斑點(diǎn)，并改進(jìn)了展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量和熊果酸對(duì)照品溶液的濃度。改進(jìn)的大山楂片的薄層色譜鑒別方法比原方法更加科學(xué)、合理、完善，并符合質(zhì)量控制要求，可替代原標(biāo)準(zhǔn)用于大山楂片的薄層色譜鑒別。