注射用左旋泮托拉唑鈉的遺傳毒性研究

高 梅，馬 會(huì)，曹 沖，英 永，張岱州＊

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東師范大學(xué) 生命科學(xué)院，山東濟(jì)南 250014）

泮托拉唑是質(zhì)子泵抑制劑，研究表明，泮托拉唑能有效抑制胃酸分泌，主要用于治療幽門螺桿菌感染，十二指腸潰瘍，胃潰瘍，中、重度反流性食管炎等[1-2]。左旋泮托拉唑鈉是泮托拉唑鈉的 -構(gòu)型光學(xué)異構(gòu)體鈉鹽，在中性和弱酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定，與消旋體泮托拉唑鈉相比，左旋泮托拉唑鈉具有代謝半衰期長(zhǎng)、血漿蛋白結(jié)合率高、生物利用度高、療效好、毒副作用低等特點(diǎn)[3-5]，因此開發(fā)左旋泮托拉唑鈉不同制劑具有較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。目前對(duì)左旋泮托拉唑鈉的制劑研究、藥效學(xué)、毒理學(xué)研究較多[6-12]，但未見對(duì)其遺傳毒性的研究。本研究根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[13]，選用Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、體內(nèi)微核試驗(yàn)3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合，評(píng)價(jià)了注射用左旋泮托拉唑鈉的遺傳毒性，以期為臨床安全用藥提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)

鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA 1 5 3 5和TA 1 0 2購(gòu)自美國(guó)M O L E C U L A R TOXICOLOGY,INC。中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。SPF級(jí)昆明小鼠50只，雄性，體重30～40 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，試驗(yàn)在屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2018 0031。

1.2 主要儀器

AUY220電子天平（日本島津有限公司）；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HFsafe-1500TE生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；BC-J160S CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；尼康80i生物顯微鏡（Nikon公司）。

1.3 藥品與試劑

注射用左旋泮托拉唑鈉；4-硝基喹啉-N-氧化物（Sigma）；2-氨基芴（Sigma）；1,8-二羥基蒽醌（Sigma）；環(huán)磷酰胺（Sigma）；絲裂霉素C（Roche）；疊氮鈉（山東西亞化學(xué)股份有限公司）；RPMI Medium 1640 basic培養(yǎng)基（Gbico）；新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；肝微粒體酶（S9）（Molecular Toxicology, Inc）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法[13-15]

2.1.1 Ames試驗(yàn) 選用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA1535和TA102 5種菌株組合，對(duì)其分別進(jìn)行基因型特性鑒定，鑒定合格后用于試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)劑量，高劑量組有一定的細(xì)菌毒性，給藥劑量分別為5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿，每組3個(gè)平行皿，同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。試驗(yàn)在加S9和不加S9平行條件下進(jìn)行，S9在S9混合液中的濃度為10 %（v/v），采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，加藥后37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)。

2.1.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 采用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞，熒光顯微鏡檢查無(wú)支原體污染，核型檢查畸變率<5 %。CHL細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加和不加S9條件下，受試物分別染毒6 h，高、中、低劑量分別為200，100，50 μg/ml，不加S9條件下，受試物染毒24 h，高、中、低劑量分別為140，70，35 μg/ml，同時(shí)設(shè)相應(yīng)的溶媒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。各組收獲前3～4 h加入秋水仙堿溶液，制備染色體標(biāo)本。油鏡下各組至少觀察300個(gè)分散良好的分裂中期相細(xì)胞，記錄含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算畸變率。

2.1.3 小鼠骨髓微核試驗(yàn) 采用昆明小鼠，給藥起始年齡6～8周齡，雄性，受試物高、中、低劑量分別為140，70，35 mg/kg，同時(shí)設(shè)立溶媒對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺，50 mg/kg）。溶媒對(duì)照組、受試物各劑量組靜脈注射給予相應(yīng)給藥制劑，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射給藥，均給藥1次，給藥24 h后及給藥后48 h前分別采樣制備骨髓涂片。每只動(dòng)物至少計(jì)數(shù)500個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞以確定未成熟紅細(xì)胞[嗜多染紅細(xì)胞（PCE）]占總紅細(xì)胞[未成熟紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞（NCE）]的比例。每只動(dòng)物至少計(jì)數(shù)4000個(gè)未成熟紅細(xì)胞以測(cè)定未成熟紅細(xì)胞的微核率。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。P>0.05表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 Ames試驗(yàn) 在加S9和不加S9條件下，溶媒對(duì)照組中各試驗(yàn)菌株回復(fù)突變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組各菌株回變菌落數(shù)均高于溶媒對(duì)照組（P<0.05），表明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。注射用左旋泮托拉唑鈉5000 μg/皿對(duì)菌株有顯著毒性作用（P<0.05），2500 μg/皿有輕微毒性作用（P<0.05），1250，625和312.5 μg/皿無(wú)抑菌作用（P>0.05）。各劑量組回變菌落數(shù)與溶媒對(duì)照組相比均無(wú)顯著性增加，且未呈現(xiàn)濃度依賴性增加，表明注射用左旋泮托拉唑鈉無(wú)誘導(dǎo)鼠傷寒沙門菌基因突變作用，鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為陰性。結(jié)果見表1。

表1 注射用左旋泮托拉唑鈉鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果（±s，n=3）

表1 注射用左旋泮托拉唑鈉鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果（±s，n=3）

注：*P<0.05 vs 溶媒對(duì)照組

組別 劑量/μg·皿-1 S9 回變菌落數(shù)TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535溶媒對(duì)照組 / - 109.3±9.1 27.7±4.7 110.7±11.6 251.3±17.2 10.7±1.5+ 109.7±9.9 28.7±5.5 112.7±10.5 264.3±14.2 14.3±2.5陽(yáng)性對(duì)照組 / - 389.3±48.2* 318.3±21.0* 1261.3±151.2* 1189.3±75.6* 1144.0±144.2*+ 1293.3±189.7* 1269.3±136.1* 1234.7±114.4* 829.3±60.0* 344.0±34.9*注射用左旋 312.5 - 108.3±12.7 24.0±3.5 109.3±7.5 259.7±15.0 9.3±1.5泮托拉唑鈉 + 114.0±7.9 25.0±4.4 1.0±8.2 265.0±16.5 13.7±3.1 625 - 107.7±9.0 25.7±3.2 109.7±13.4 256.7±11.2 11.3±2.5+ 112.0±13.0 24.0±4.6 110.7±13.4 253.3±20.7 13.0±2.0 1250 - 108.3±9.9 23.0±3.0 118.0±17.8 248.0±15.0 11.3±2.3+ 111.7±13.0 28.3±5.9 117.0±14.4 260.7±24.4 12.7±2.1 2500 - 96.0±7.0 19.3±3.1* 76.3±12.7* 250.0±18.5 8.0±1.0+ 100.3±10.4 23.3±3.3 84.7±7.5* 258.0±18.7 8.3±1.5*5000 - 60.7±9.1* 13.0±2.0* 25.0±4.6* 210.0±12.8* 3.7±0.6*+ 62.3±4.9* 14.3±2.1* 28.0±5.0* 212.7±14.4* 4.3±1.2*

2.2.2 體外染色體畸變?cè)囼?yàn) 在加S9和不加S9條件下，染毒6 h和24 h，溶媒對(duì)照組染色體畸變數(shù)均<5 %，陽(yáng)性對(duì)照組絲裂霉素、環(huán)磷酰胺誘發(fā)產(chǎn)生的畸變率均>20 %，溶媒對(duì)照組畸變率與陽(yáng)性對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05），表明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。在加S9和不加S9條件下，注射用左旋泮托拉唑鈉在50，100，200 μg/ml劑量下作用6 h；在不加S 9條件下，3 5，7 0，140 μg/ml劑量作用24 h，各劑量染色體畸變率均<5 %，與相對(duì)應(yīng)的溶媒對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），且未呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，表明注射用左旋泮托拉唑鈉無(wú)誘導(dǎo)CHL細(xì)胞染色體畸變作用，體外染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果判定為陰性。結(jié)果見表2。

表2 注射用左旋泮托拉唑鈉體外染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

2.2.3 小鼠體內(nèi)微核試驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照組的PCE/（PCE+NCE）比值與溶媒對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），MNPCE高于溶媒對(duì)照組，有顯著性差異（P<0.05），表明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。35，70，140 mg/kg劑量下，小鼠PCE/（PCE+NCE）比值與溶媒對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性增加（P>0.05），表明對(duì)骨髓細(xì)胞的造血功能未產(chǎn)生抑制作用。各劑量組MNPCE分別與溶媒對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明注射用左旋泮托拉唑鈉在35～140 mg/kg劑量范圍內(nèi)無(wú)誘發(fā)小鼠骨髓細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞微核率增高的作用，小鼠體內(nèi)微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。結(jié)果見表3。

表3 注射用左旋泮托拉唑鈉體內(nèi)微核試驗(yàn)結(jié)果（ ±s，n＝5）

表3 注射用左旋泮托拉唑鈉體內(nèi)微核試驗(yàn)結(jié)果（ ±s，n＝5）

注：*P<0.05 vs 溶媒對(duì)照組

組別 劑量/mg·kg-1 PCE/（NCE+PCE） MNPCE/%第一次采樣 第二次采樣 第一次采樣 第二次采樣溶媒對(duì)照組 / 0.63±0.02 0.62±0.02 0.16±0.05 0.18±0.07陽(yáng)性對(duì)照組 50 0.66±0.03 0.65±0.03 2.56±0.48* 2.43±0.33*注射用左旋泮托拉唑鈉 35 0.62±0.02 0.61±0.02 0.18±0.05 0.16±0.04 70 0.64±0.02 0.63±0.03 0.17±0.04 0.19±0.05 140 0.65±0.04 0.64±0.02 0.18±0.07 0.18±0.06

3 討論

藥物遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，目前我國(guó)藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則推薦遺傳毒性試驗(yàn)組合應(yīng)包含：細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外試驗(yàn)（體外中期相染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外微核試驗(yàn)，或體外小鼠淋巴瘤TK基因突變?cè)囼?yàn)）和/或體內(nèi)試驗(yàn)（微核試驗(yàn)、骨髓中期相細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)）。因此，本研究采用Ames試驗(yàn)、CHL細(xì)胞體外染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠體內(nèi)微核試驗(yàn)3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合，體內(nèi)和體外試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)注射用左旋泮托拉唑鈉遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究的Ames試驗(yàn)，采用國(guó)內(nèi)評(píng)價(jià)常用的5種菌株TA98、TA100、TA1535、TA97a和TA102[16-17]，5種菌株均為氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌，對(duì)菌株進(jìn)行基因型、回變菌落數(shù)鑒定，鑒定合格后用于試驗(yàn)，根據(jù)受試物毒性和評(píng)價(jià)要求，為充分暴露受試物毒性，采用有一定細(xì)菌毒性的劑量作為高劑量，余下以2倍間距設(shè)立不同劑量組，同時(shí)設(shè)立對(duì)應(yīng)的溶媒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，試驗(yàn)在加S9和不加S9 平行條件下，對(duì)受試物有無(wú)誘導(dǎo)基因突變的作用進(jìn)行研究。染色體畸變?cè)囼?yàn)，指導(dǎo)原則推薦可采用哺乳動(dòng)物或人的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。因CHL細(xì)胞易在體外建立細(xì)胞系，成纖維樣貼壁生長(zhǎng)，且自發(fā)突變率低，便于染色體分析[18]，被廣泛用于染色體畸變?cè)囼?yàn)，因此體外染色體畸變?cè)囼?yàn)采用CHL細(xì)胞。試驗(yàn)前檢查細(xì)胞核型及有無(wú)支原體污染，在不同代謝活化條件、不同染毒時(shí)間下對(duì)受試物能否誘導(dǎo)染色體損傷進(jìn)行了研究，同時(shí)設(shè)立不同試驗(yàn)條件下對(duì)應(yīng)的溶媒和陽(yáng)性對(duì)照組。小鼠體內(nèi)微核試驗(yàn)選用的昆明小鼠，有較多的背景數(shù)據(jù)，也是微核試驗(yàn)常用的的動(dòng)物種屬[19-20]。根據(jù)評(píng)價(jià)要求，所采用的高劑量組有一定的毒性癥狀，如給藥后步態(tài)不穩(wěn)、自發(fā)活動(dòng)減少、俯臥不動(dòng)等，研究了受試物不同劑量下對(duì)哺乳動(dòng)物是否有致微核升高的作用。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件和劑量范圍內(nèi)，Ames試驗(yàn)、CHL細(xì)胞體外染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠體內(nèi)微核試驗(yàn)，3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)注射用左旋泮托拉唑鈉潛在的遺傳毒性作用。