稅 雪 許 榮 謝清華 張彩勤 譚鄧旭 師長宏 趙菊梅

(1. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安 716000)(2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種雄激素驅(qū)動(dòng)的疾病，它依賴于配體介導(dǎo)的雄激素受體(androgen receptor，AR)激活從而促進(jìn)疾病進(jìn)展[1]。盡管雄激素剝奪可以有效控制腫瘤生長，但大多數(shù)患者最終會(huì)發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[2]。Watson等[3]、Parker等[4]以及Hussain等[5]研究表明，大多數(shù)CRPC仍依賴于AR信號通路，一些新型的AR通路抑制劑(androgen receptor inhibitor，ARPI),如：恩雜魯胺(enzalutamide，ENZ)和阿比特龍作為治療藥物應(yīng)用于晚期前列腺癌患者以延長生存期。Nadal等[6]和Bishop等[7]報(bào)道，ARPI會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)內(nèi)分泌性前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer，NEPC)，出現(xiàn)特征性多器官轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致難以治愈。目前，ARPI引起PCa神經(jīng)內(nèi)分泌分化(neuroendocrine transdifferentiation，NED)的確切分子機(jī)制尚未完全闡明，主要原因是缺乏模擬臨床特征的異質(zhì)性轉(zhuǎn)化模型。因此，構(gòu)建NEPC轉(zhuǎn)化模型已成為PCa防治研究亟待解決的重大問題。

單胺氧化酶A(monoamine oxidase A，MAOA)是一種位于線粒體上的氧化還原酶，通過氧化脫氨催化膳食胺和單胺神經(jīng)遞質(zhì)降解，產(chǎn)生副產(chǎn)物過氧化氫，即活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要來源[8-10]。Trachootham等[11]報(bào)道，ROS可使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Wu等[12]、Liao等[13]及Li等[14]研究證實(shí)MAOA表達(dá)水平的升高會(huì)促進(jìn)PCa細(xì)胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞干性等。目前，MAOA對ENZ誘導(dǎo)NED的影響還未見報(bào)道。因此，本研究擬通過ENZ誘導(dǎo)建立NEPC細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，探索MAOA在該誘導(dǎo)過程中發(fā)揮的作用及潛在機(jī)制，旨在為揭示 NEPC的發(fā)生機(jī)制提供良好的模型，為PCa的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究選用15只6～7周齡SPF級雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量22～25 g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中飼養(yǎng)和繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(陜)2018-001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理證書編號：20190207。

1.1.2細(xì)胞：人前列腺癌細(xì)胞C4-2和22RV1購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素)，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基和0.05%胰酶購自HyClone；FBS購自浙江天杭生物科技股份有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot制膠試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MAO-Glo試劑盒購自Promega;熒光定量PCR等分子生物相關(guān)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司?？贵w：神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物抗體(CGA和SYP)和前列腺癌特異性抗體(PSA和AR)均購自Abcam；神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物抗體ENO2抗體購自ProMab；Actin抗體和二抗購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。藥品：ENZ購自Selleck；MAOA特異性抑制劑氯吉靈(clorgyline,CLG)購自MCE；異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.1.4儀器：酶標(biāo)儀購自Biotek Take；基因擴(kuò)增儀購自Eppendorf；Real-time PCR購自StepOne Plus、Thermo Fisher等。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和Real-time PCR：使用TRIzol破碎和溶解細(xì)胞， 收集總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用 Step One Plus 實(shí)時(shí) PCR 檢測系統(tǒng)(Thermo Fisher ABI)，PrimeScriptTMRT 試劑盒和 TB Green? Fast qPCR Mix(Takara)進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，95 ℃聚合酶激活3 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的兩步法PCR(95 ℃、30 s和60 ℃、40 s)，最終PCR反應(yīng)結(jié)束后直接進(jìn)行熔解曲線分析。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參。

1.2.2免疫印跡分析：細(xì)胞或破碎后瘤體組織，使用RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白在10% SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h。特異性一抗4 ℃孵育過夜，酶標(biāo)二抗室溫2 h后，通過ECL試劑盒觀察細(xì)胞膜上的信號。β-actin作為內(nèi)參。

1.2.3MAOA活性分析：熒光素酶裂解緩沖液裂解1×104個(gè)細(xì)胞，MAO-Glo試劑盒分析細(xì)胞裂解液的MAOA活性，MAO-Glo檢測系統(tǒng)記錄熒光信號值[15]。

1.2.4MTT法檢測各細(xì)胞株耐藥指數(shù)：將2×103/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，使用100 μL含有不同濃度的ENZ培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞96 h后，向每孔加入培養(yǎng)基/ CCK8混合物(9∶1)，繼續(xù)孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀檢測，于450 nm處讀取吸光度值。

1.2.5體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：所有小鼠均接受手術(shù)去勢，于一周后右側(cè)皮下植入1 × 106個(gè)22RV1細(xì)胞，建立異種移植模型。腫瘤體積=1/2 ×(長軸 × 寬軸)2。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3，將小鼠隨機(jī)分為三個(gè)治療組，A組：對照組(22RV1)、B組：10 mg/kg的ENZ每日灌胃(22RV1+ENZ)及C組：10 mg/kg ENZ+10 mg/kg 的CLG，每日腹腔注射(22RV1+ENZ+CLG)，n=15。治療兩周后視為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，對所有荷瘤小鼠CO2窒息處死，并取組織用于免疫組化分析。

1.2.6免疫組化：小鼠腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm切片，通過間接免疫過氧化物酶技術(shù)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察出現(xiàn)背景清晰的棕色或棕黃色顆粒判為陽性染色。

2 結(jié)果

2.1 ENZ誘導(dǎo)的NEPC模型建立與表征

為了選擇適合NED研究的PCa細(xì)胞系，對PCa細(xì)胞系C4-2和22RV1對AR抑制劑的敏感性進(jìn)行了評估。MTT檢測結(jié)果顯示，C4-2細(xì)胞對ENZ敏感，22RV1細(xì)胞對ENZ不敏感(圖1A)，因此選擇C4-2細(xì)胞進(jìn)行 10～20 μmol/L ENZ連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4個(gè)月，以期獲得神經(jīng)內(nèi)分泌樣的細(xì)胞。結(jié)果如圖1B所示，與親本相比，ENZ處理的C4-2細(xì)胞能在更高濃度的藥物中增殖，耐受濃度從34.64 μmol/L升高至82.17 μmol/L。同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈現(xiàn)突觸增多、胞體聚集等神經(jīng)樣細(xì)胞表型(圖1C)。因此，將ENZ耐藥細(xì)胞株C4-2命名為C4-2ENZR。Western blot結(jié)果表明，與親本細(xì)胞相比，C4-2ENZR細(xì)胞中NE標(biāo)志物嗜鉻粒蛋白A(CGA)、突觸素(SYP)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(ENO2)的蛋白表達(dá)增加，腺癌標(biāo)志物雄激素受體(AR)表達(dá)降低(圖1D)。這表明該細(xì)胞模型為NEPC模型[7]。

圖1 NEPC模型的建立注：***P<0.001Fig.1 Establishment of NEPC modelNote：***P<0.001

2.2 NEPC細(xì)胞模型中MAOA表達(dá)升高

根據(jù)Wu等[12]報(bào)道，MAOA的表達(dá)與PCa的惡性程度相關(guān),因此使用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析MAOA在兩個(gè)不同臨床隊(duì)列的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常前列腺組織相比，人類PCa組織中MAOA的表達(dá)更高，且與Gleason評分呈正相關(guān)(圖2A)。進(jìn)一步通過RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與親本C4-2細(xì)胞相比，C4-2ENZR細(xì)胞中MAOA的mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高(圖2B、圖2C)，從而驗(yàn)證了上述生物信息學(xué)結(jié)果，即：MAOA可能在ENZ誘導(dǎo)的NED中起關(guān)鍵作用。

圖2 MAOA的表達(dá)與ENZ誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌分化有關(guān)注：*P<0.05，**P<0.01Fig.2 The expression of MAOA is associated with the development of NED induced by ENZNote：*P<0.05, **P<0.01

2.3 MAOA抑制劑CLG可以延緩ENZ引起的NED發(fā)生

CLG作為一種選擇性抑制劑，可以顯著降低MAOA酶的活性(圖3A)。對C4-2細(xì)胞進(jìn)行ENZ給藥時(shí)，同時(shí)添加1 μmol/L的CLG聯(lián)合處理細(xì)胞2個(gè)月后檢測發(fā)現(xiàn)，ENZ與CLG聯(lián)合使用可以減輕ENZ所引起的神經(jīng)內(nèi)分泌樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并抑制神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物NCAM1和ENO2表達(dá)(圖3B、圖3C)。這表明MAOA是促進(jìn)NED和維持神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特性的關(guān)鍵因素，以MAOA為靶點(diǎn)的抑制劑CLG可以延緩ENZ引起的NED的發(fā)生。為了進(jìn)一步證實(shí)體外細(xì)胞系研究的結(jié)果，建立了22RV1裸鼠異種移植模型，結(jié)果顯示ENZ確實(shí)可以誘導(dǎo)NEPC體內(nèi)模型形成，該模型表現(xiàn)出超高水平的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物陽性表達(dá)。更重要的是，與ENZ單藥治療的腫瘤相比，ENZ+CLG聯(lián)合使用能夠降低22RV1小鼠腫瘤中的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物表達(dá)(圖3D)。

圖3 MAOA抑制劑CLG可以顯著延緩體內(nèi)和體外的NED注：***P<0.001Fig.3 Clorgyline, inhibitors of MAOA, can significantly delay NED in vivo and in vitroNote：***P<0.001

2.4 靶向MAOA抑制缺氧信號以克服NED

缺氧是多種實(shí)體瘤的常見情況，Lu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，從而促進(jìn)疾病進(jìn)展。Shih等[10]證實(shí)，MAOA介導(dǎo)的酶促反應(yīng)產(chǎn)生大量作為ROS主要來源的過氧化氫。因此，流式分析C4-2、C4-2+ENZ 和C4-2+ENZ+CLG細(xì)胞的ROS水平。如圖4所示，MAOA刺激ROS的產(chǎn)生，由26.5%增至48.8%；CLG延緩ROS的升高，使其降為40.3%。以上結(jié)果提示，MAOA可以通過改變C4-2細(xì)胞中的缺氧信號來克服ENZ引起的NED。

圖4 MAOA 激活缺氧信號以促進(jìn) NEDFig.4 MAOA triggers hypoxia signaling to promote the NED

3 討論

PCa是老年男性患者死亡的主要原因之一，NEPC屬于PCa的終末階段，侵襲性強(qiáng)且預(yù)后極差[17]。目前NEPC的研究進(jìn)展緩慢，主要是缺乏模擬臨床特征的異質(zhì)性轉(zhuǎn)化模型[18]。因此， NEPC模型的構(gòu)建是本研究的關(guān)鍵。通過ENZ構(gòu)建具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的NEPC體外模型C4-2ENZR，該細(xì)胞模型高表達(dá)SYP，CGA和ENO2，低表達(dá)AR，為典型的NEPC細(xì)胞。體內(nèi)模型選取22RV1細(xì)胞系，相比于C4-2細(xì)胞，22RV1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)具有較好的成瘤率，并且對ENZ表現(xiàn)出耐藥性，更接近于NEPC特征[7,19]。本研究將22RV1移植入去勢小鼠體內(nèi)建立異種移植模型，進(jìn)一步用ENZ誘導(dǎo)并經(jīng)組化染色證實(shí)，神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物SYP表達(dá)強(qiáng)陽性，提示該模型具有NEPC特征。以上模型的成功建立為后續(xù)分子機(jī)制研究提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

目前，ENZ引起NED的具體機(jī)制仍不完全清楚。Luo等[20]發(fā)現(xiàn)LncRNA-p21調(diào)節(jié)EZH2/STAT3信號通路改變ENZ誘導(dǎo)的PCa NED。Bishop等[7]也發(fā)現(xiàn)主神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(BRN2)是AR抑制后NEPC形成的主要驅(qū)動(dòng)基因，但MAOA與NEPC的關(guān)系尚未見報(bào)道。此外，目前除化療外，尚無針對NEPC患者的有效治療方法。一些靶向抑制劑，如EZH2抑制劑GSK126[21]，AR降解增強(qiáng)劑ASC-J934[21-23]等被證明能起到一定的治療效果，但多處于臨床前研究或臨床試驗(yàn)階段，距離新藥上市時(shí)間較長。因此，重新利用現(xiàn)有藥物是解決這些問題的有效方法。

現(xiàn)有的抗抑郁藥物CLG可有效抑制MAOA的活性，Wu等[15]發(fā)現(xiàn)CLG可以擾亂導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲和增殖的信號通路，進(jìn)而抑制PCa進(jìn)展。同樣，本研究也證實(shí)，在晚期PCa中，靶向MAOA可能是抑制PCa進(jìn)展的潛在治療策略，結(jié)果表明(1)ENZ處理后，MAOA的活性和表達(dá)量增加，提示MAOA可能在ENZ誘導(dǎo)的NED中起關(guān)鍵作用；(2)MAOA升高可以促進(jìn)神經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)，并且可能通過改變下游缺氧信號通路實(shí)現(xiàn)的。最重要的是，證明CLG可以有效延緩ENZ引起的NED。

綜上所述，本研究證實(shí)，MAOA是促進(jìn)NED和維持神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特性的關(guān)鍵因素，現(xiàn)有的MAOA抑制劑CLG可以延緩NEPC發(fā)生。將CLG與ENZ聯(lián)合使用，有可能成為PCa患者的新型治療方案。