曹春然 劉洪艷 李雪梅 吳 偉 朱春玥 王佳帥

(北京市藥品檢驗所,國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206)

乙型肝炎疫苗是我國的計劃免疫疫苗，新生兒出生當(dāng)日需要按規(guī)定注射的一類疫苗?！吨袊幍洹?015年版中共收載有三種重組乙型肝炎疫苗:重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母Hansenulaploymorpha)、重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母Saccharomycescerevisiae)和重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞)。除藥典收載的標(biāo)準(zhǔn)外，疫苗的生產(chǎn)企業(yè)也向國家藥監(jiān)部門申請各自的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)用于控制疫苗的質(zhì)量。異常毒性檢查是疫苗的安全性質(zhì)量控制指標(biāo)，目前已批準(zhǔn)上市的國產(chǎn)疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均設(shè)有該檢查項?！队幍洹?020年版和《歐洲藥典》10.0已經(jīng)取消了異常毒性檢查實驗，但作為疫苗的安全性考察指標(biāo)，《中國藥典》2020年版四部還繼續(xù)保留該檢查項[1]。本文通過比較三種重組乙型肝炎疫苗對異常毒性檢查用實驗動物的體質(zhì)量增長的影響，匯總注射疫苗后動物的狀態(tài)，考察分別由重組漢遜酵母、重組釀酒酵母和重組CHO細(xì)胞表達的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)經(jīng)純化，加入鋁佐劑制成的疫苗對異常毒性檢查用動物的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠(以下簡稱小鼠)，雄性，購自北京維通利華實驗動物公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001，SCXK(京)2016-0011；Hartley豚鼠(以下簡稱豚鼠)，雄性，購自北京維通利華實驗動物公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011；Hartley豚鼠，雄性，購自北京科宇實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2015-0007。

1.2 實驗環(huán)境

北京市藥品檢驗所(北京市保健食品化妝品檢測中心)動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2015-0033。

1.3 儀器

電子天平(TE2101-L)，購自德國賽多利斯有限公司。

1.4 藥物

重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)，由A公司生產(chǎn)，含HBsAg 20 μg/mL，用法用量為基礎(chǔ)免疫每劑10 μg；重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)，由B公司生產(chǎn)，含HBsAg 20 μg/mL，用法用量為基礎(chǔ)免疫每劑10 μg；重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞)，由C公司生產(chǎn)，含HBsAg 20 μg/mL，用法用量為基礎(chǔ)免疫每劑10 μg，三種乙型肝炎疫苗均為液體。本研究匯總了2016年3月—2018年2月，三種重組乙型肝炎疫苗的異常毒性檢查中的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，其中包含重組乙型肝疫苗(H.ploymorpha)28 批次、重組乙型肝疫苗(S.cerevisiae)45 批次、重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞)102批次及空白對照組61批次的小鼠體質(zhì)量變化情況，以及重組乙型肝疫苗(漢遜酵母)30批次、重組乙型肝疫苗(釀酒酵母)45批次、重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞)101批次及空白對照組38批次的豚鼠體質(zhì)量變化情況。因本研究的主要目的是對每種疫苗用動物的體質(zhì)量變化值進行分析，每批次疫苗的批號不是分組的因素，故不分別列出。

1.5 給藥和觀察

按照《中國藥典》2015年版四部附錄1141中的要求，每批次疫苗均取體質(zhì)量為18～22 g的小鼠5只和體質(zhì)量為250 ～350 g的豚鼠2只，腹腔注射疫苗，給藥體積為0.5 mL/只(小鼠)和5 mL/只(豚鼠)，同時取同批5只小鼠和2只豚鼠作為空白對照組動物，不做處理，給藥后連續(xù)觀察7 d[2]。動物給藥前后的狀態(tài)觀察包括給藥后的呼吸、自主活動、口鼻顏色、運動、排泄、死亡等，并測定給藥前和給藥7 d后的動物體質(zhì)量。在實驗中采用健康成年的動物進行實驗，考慮到雌性的性周期對體質(zhì)量的增長速度有影響，在檢查中多選擇雄性動物作為實驗對象，本研究討論對雄性動物體質(zhì)量的影響。

1.6 結(jié)果分析

三種重組乙型肝炎疫苗的異常毒性檢查實驗均在同一時間段內(nèi)完成，所以將該時間段內(nèi)的空白對照組動物進行合并，作為空白對照組參與統(tǒng)計比較，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 23分析軟件進行數(shù)據(jù)分析：①計算體質(zhì)量增長值(體質(zhì)量增長值=給藥7 d后體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量)；②對給藥前及給藥7 d后的體質(zhì)量及增長值進行數(shù)據(jù)分布情況的Kolmogorov-Smirnov(n>50)檢驗，根據(jù)結(jié)果確定統(tǒng)計分析的方法[3]；③將三種疫苗的動物體質(zhì)量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。給藥前動物的體質(zhì)量有規(guī)定的范圍，體質(zhì)量在范圍內(nèi)即可分為一組，分組未按隨機分組原則執(zhí)行，給藥7 d后動物的體質(zhì)量可作為異常毒性中動物體質(zhì)量的背景數(shù)據(jù)。本研究著重考察給藥7 d后動物體質(zhì)量的增長情況，并匯總給藥后動物的狀態(tài)。以下內(nèi)容，采用漢遜酵母、釀酒酵母和CHO細(xì)胞分別代指重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)、重組乙型肝疫苗(釀酒酵母)和重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞)。

2 實驗結(jié)果

三種疫苗的異常毒性檢查結(jié)果均符合規(guī)定，說明成品中不存在不可控制的有毒物質(zhì)。

2.1 三種重組乙型肝炎疫苗對雄性小鼠的影響

2.1.1對雄性小鼠狀態(tài)的影響：實驗用小鼠為同一種屬和同一來源。三種重組乙型肝炎疫苗的異常毒性檢查結(jié)果均符合規(guī)定，有1批疫苗(釀酒酵母給藥組)初試時，5只小鼠中有1只小鼠體質(zhì)量減輕，經(jīng)復(fù)試10只動物均健康存活，體質(zhì)量增長，實驗中動物未見異常狀態(tài)，實驗結(jié)束時均健康存活，體質(zhì)量增加。經(jīng)分析認(rèn)為，可能因?qū)嶒灢僮鞯脑驅(qū)е聞游矬w質(zhì)量減輕，故在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時將體質(zhì)量減輕動物的給藥前、后及增長值去除。

2.1.2各組雄性小鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)分布情況：采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對各組雄性小鼠的體質(zhì)量和體質(zhì)量及增長值進行數(shù)據(jù)分布情況的分析，結(jié)果顯示：給藥前各組動物的體質(zhì)量值分布均不服從正態(tài)分布(P<0.05)；給藥7 d后，體質(zhì)量數(shù)據(jù)分布檢驗結(jié)果顯示含漢遜酵母組動物的體質(zhì)量值服從正態(tài)分布(P>0.05)，其他各組動物的體質(zhì)量值分布均不服從正態(tài)分布(P<0.05)；體質(zhì)量增長值的數(shù)據(jù)分布檢驗結(jié)果顯示漢遜酵母給藥和釀酒酵母給藥組的體質(zhì)量增長值分布均服從正態(tài)分布(P>0.05)，其他各組動物的體質(zhì)量增長值均不服從正態(tài)分布(P<0.05)。各組雄性小鼠體質(zhì)量的描述見圖1和表1。

表1 注射7 d后雄性小鼠體質(zhì)量增長值數(shù)據(jù)分布情況Table 1 Distribution of weight gain data of male mice 7 days after injection

圖1 雄性小鼠給藥前和給藥7 d后體質(zhì)量數(shù)據(jù)分布Fig.1 Distribution of body weight data of male mice before administration and 7 days after administration

2.1.3對小鼠體質(zhì)量增長值的影響：采用兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗中Mann-Whitney U檢驗分析三種乙型肝炎疫苗給藥組和空白對照組雄性小鼠體質(zhì)量增長值變化，采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗中Kruskal-Wallis檢驗分析三種乙型肝炎疫苗給藥組動物的體質(zhì)量增長值變化情況，結(jié)果顯示：比較空白對照組和三種乙型肝炎疫苗給藥組動物的體質(zhì)量增長值，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；釀酒酵母給藥組動物的體質(zhì)量增長值與漢遜酵母和CHO細(xì)胞給藥組動物的體質(zhì)量增長值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 三種乙型肝炎疫苗的給藥組雄性小鼠體質(zhì)量增長值比較Table 2 Comparison of the weight gain of male mice in the 3 hepatitis B vaccine administration groups

2.2 三種重組乙型肝炎疫苗對雄性豚鼠的影響

2.2.1對豚鼠狀態(tài)的影響：在初試中，CHO細(xì)胞給藥組有1只豚鼠死亡，1只豚鼠體質(zhì)量增長值為6.4 g，漢遜酵母和釀酒酵母組各有1只豚鼠的7 d體質(zhì)量增長值分別為4.4 g和5.5 g，經(jīng)復(fù)試均符合規(guī)定，分析認(rèn)為豚鼠可能在給藥過程中受傷，導(dǎo)致死亡或體質(zhì)量增長緩慢。除此以外，各給藥組其他豚鼠狀態(tài)均未見異常。

2.2.2各組中的不同來源的豚鼠數(shù)：2016年3月—2018年2月，本實驗室使用的豚鼠購自兩個生產(chǎn)廠家，因動物入室后均在同一環(huán)境中飼養(yǎng)和觀察，注射三種疫苗時未區(qū)分豚鼠來源，所以按照疫苗的種類分組。分別處理各組豚鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，將空白對照組數(shù)據(jù)合并。在實驗過程中為減少雌性豚鼠因激素水平的波動而影響實驗，故常選用雄性豚鼠進行異常毒性實驗，文中所有的體質(zhì)量數(shù)據(jù)均來源于雄性豚鼠。統(tǒng)計兩種來源的豚鼠在各組中所占動物數(shù)和比重，分別用維通利華和科宇代指不同的來源。統(tǒng)計時剔除上述的異常動物的體質(zhì)量數(shù)據(jù)。不同來源豚鼠在各組的分布見表3。

表3 兩種來源雄性豚鼠在各組中的分布情況Table 3 Distribution of guinea pigs from 2 sources in each group

2.2.3各組雄性豚鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)分布情況:采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對各組豚鼠的體質(zhì)量和體質(zhì)量增長值進行數(shù)據(jù)分布情況的分析。結(jié)果顯示：給藥前，各組豚鼠的體質(zhì)量分布均不服從正態(tài)分布(P<0.05)；給藥7 d后體質(zhì)量數(shù)據(jù)分布檢驗結(jié)果顯示各組豚鼠的體質(zhì)量均服從正態(tài)分布(P>0.05)；體質(zhì)量增長值的數(shù)據(jù)分布檢驗結(jié)果顯示：漢遜酵母給藥組和釀酒酵母給藥組豚鼠的體質(zhì)量增長值分布不服從正態(tài)分布(P<0.05)，其他各組豚鼠的體質(zhì)量值服從正態(tài)分布(P>0.05)。各組雄性豚鼠體質(zhì)量的描述見圖2和表4。

圖2 雄性豚鼠給藥前和給藥7 d后體質(zhì)量數(shù)據(jù)分布Fig.2 Distribution of body weight data of male guinea pigs before administration and 7 days after administration

表4 雄性豚鼠體質(zhì)量增長值數(shù)據(jù)分布情況Table 4 Distribution of weight gain data of male guines pigs

2.2.4對豚鼠體質(zhì)量增長值的影響:采用兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗中Mann-Whitney U檢驗分析三種乙型肝炎疫苗的給藥組和空白對照組豚鼠體質(zhì)量增長值變化情況，采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗中Kruskal-Wallis檢驗分析三種乙型肝炎疫苗給藥組豚鼠的體質(zhì)量增長值變化情況。結(jié)果顯示：比較空白對照組和三種乙型肝炎疫苗給藥組豚鼠的體質(zhì)量增長值，CHO細(xì)胞給藥組豚鼠與空白對照組豚鼠的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他兩組豚鼠與空白對照組豚鼠的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表5。比較三種疫苗的給藥組豚鼠，各組豚鼠的體質(zhì)量增長值差異沒有顯著性意義(P>0.05)，結(jié)果見表6。

表5 空白對照組和給藥組雄性豚鼠體質(zhì)量增長值比較Table 5 Comparison of the weight gain of male guinea pigs in the blank group and the administration group

表6 給藥組雄性豚鼠體質(zhì)量增長值比較Table 6 Comparison of weight gain of male guinea pigs in administration groups

3 討論

3.1三種疫苗在注射后7 d內(nèi)均未見明顯的異常反應(yīng)，注射過程中造成的動物不適能夠在注射完成后1 min內(nèi)恢復(fù)。注射時，由于動物的掙扎造成對動物的傷害例如出血等，可能影響動物體質(zhì)量的正常增長，日常行為學(xué)觀察未見異常表現(xiàn)。

3.2三種重組乙型肝炎疫苗分別由重組漢遜酵母、重組釀酒酵母和重組CHO細(xì)胞表達的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)經(jīng)純化，加入鋁佐劑制成。在《中國藥典》2015年版中，重組漢遜酵母和重組釀酒酵母表達的HBsAg均是將酵母菌破碎后，除去細(xì)胞碎片，通過硅膠吸附，柱色譜等適宜的方法純化，經(jīng)過除菌過濾獲得原液，原液由甲醛滅活處理后，將蛋白質(zhì)和鋁劑以一定比例混合，在一定條件下形成鋁吸附產(chǎn)物，然后用生理氯化鈉溶液配制為半成品，分裝后即為成品。原液的檢定合格標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg純度為99.0%，雜蛋白含量不超過總蛋白含量的1%，宿主殘留DNA小于10 ng/劑，半成品或成品中游離甲醛含量分別不超過15 μg/mL和20 μg/mL，鋁含量分別為0.45～0.60 mg/mL和0.35～0.62 mg/mL；重組CHO細(xì)胞表達的HBsAg來源于細(xì)胞培養(yǎng)上清液，合并收獲物經(jīng)過澄清過濾、柱色譜純化、甲醛滅活、超濾、濃縮及除菌過濾后，獲得原液。原液加入氫氧化鋁佐劑吸附后，即為半成品，然后分裝為成品。原液檢定合格標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg純度不低于95.0%，支原體檢查合格，CHO細(xì)胞DNA殘留量應(yīng)不高于10 pg/劑，CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量應(yīng)不高于總蛋白含量的0.05%，成品中游離甲醛含量不高于50 μg/mL，鋁應(yīng)不高于0.43 mg/mL。企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的控制要求應(yīng)與《中國藥典》相同或嚴(yán)于藥典標(biāo)準(zhǔn)，三種疫苗的生產(chǎn)過程中均使用鋁佐劑為蛋白吸附劑，且含量遠高于其它雜質(zhì)和HBsAg，鋁佐劑是疫苗中的主要成分和主要輔料。根據(jù)楊赟昀等[4]報道，鋁佐劑有可能導(dǎo)致動物出現(xiàn)腹部刺激癥狀。本研究中涉及的三種疫苗均未見明顯的腹部刺激反應(yīng)，說明鋁佐劑作為疫苗制劑中主要的輔料，不同廠家的鋁佐劑，質(zhì)量控制要求和使用要求各不相同。《中國藥典》2020年版四部中新增了氫氧化鋁佐劑的質(zhì)量控制通則(通則3650)[1]，對制備方法和檢定項目進行了說明，該通則可以為疫苗生產(chǎn)用鋁佐劑提供質(zhì)量控制參考和安全保障。

3.3乙型肝炎疫苗為新生兒基礎(chǔ)免疫疫苗，疫苗說明書中描述為一般情況下每次免疫劑量為HBsAg10 μg。正常新生兒體質(zhì)量一般為2 500～4 000 g[5]，按新生兒體質(zhì)量2 500 g計算臨床HBsAg給藥劑量為4 μg/kg，動物體質(zhì)量按22 g/只(小鼠)和350 g/只(豚鼠)計算給藥劑量為454.5 μg/kg(小鼠)和285.7 μg/kg(豚鼠)，分別相當(dāng)于新生兒臨床給藥劑量的113倍和71倍，小鼠的給藥劑量大于豚鼠的給藥劑量。從給藥7 d后動物體質(zhì)量增長值的數(shù)據(jù)分析可以發(fā)現(xiàn)，實驗用小鼠在給藥后7 d內(nèi)的體質(zhì)量增長值疫苗組動物和空白對照組動物無顯著性差異，但三種疫苗中釀酒酵母組動物的體質(zhì)量增加均值大于另外兩種疫苗；豚鼠注射7 d后，CHO細(xì)胞給藥組動物的體質(zhì)量增加均值小于空白組動物，與另外兩種疫苗組動物比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)顯示不同生產(chǎn)工藝的疫苗對異常毒性實驗中小鼠的體質(zhì)量增長有影響，但對豚鼠的體質(zhì)量增長未見明顯影響。

3.4由于疫苗的生產(chǎn)工藝不斷改進，生產(chǎn)過程和所用物料的質(zhì)量控制日趨完善，部分國家取消了異常毒性檢查項，國內(nèi)學(xué)者對異常毒性檢查項的適用性產(chǎn)生了不同的意見[6-7]。小鼠具有體型小、飼養(yǎng)管理易于控制、生產(chǎn)繁殖快、有明確的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、對各種毒素、病原體和化學(xué)物質(zhì)等敏感的特點[8]。小鼠實驗最早作為安全性檢查實驗也是由于它對制劑中防腐劑苯酚的濃度有高度敏感性[9]。在異常毒性檢查實驗中，小鼠體質(zhì)量要求在18～22 g之間，復(fù)試時的體質(zhì)量應(yīng)為19～21 g。體質(zhì)量范圍控制嚴(yán)格，同批動物的體質(zhì)量和日齡差異較小，給藥劑量較大，通過實驗容易表現(xiàn)受試物間的差別。豚鼠有固有特性可用于實驗研究，它對很多致病菌和病毒十分敏感[8]。德國從1901年開始采用豚鼠實驗進行白喉抗血清的特異性毒性和安全性控制，德國將小鼠的安全性檢查實驗和豚鼠的特異性毒性檢查實驗整合，建立生物制品的異常毒性檢查[9]。豚鼠體型較大，生產(chǎn)繁殖周期較長，在異常毒性檢查實驗中豚鼠的體質(zhì)量要求在250～350 g之間。受試豚鼠的同批動物之間的體質(zhì)量和日齡存在較大差異，與小鼠相比，給藥劑量較小，動物反應(yīng)不易觀察。金先梅[10]和袁文琳等[11]報道，臨床有患者接種乙型肝炎疫苗后出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，疫苗的變態(tài)反應(yīng)與個人的體質(zhì)相關(guān)，雖然豚鼠適用于藥物的變態(tài)反應(yīng)實驗，但異常毒性檢查實驗并不是檢測抗原的檢查方法。

因此，由重組漢遜酵母、重組釀酒酵母和重組CHO細(xì)胞表達乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)經(jīng)純化，加入鋁佐劑制成的重組乙型肝炎疫苗，在工藝和輔料使用方面均有差異。通過對三種疫苗成品的異常毒性檢查所獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，動物的一般狀態(tài)觀察未見明顯差別，均沒有觀察到文獻記載的因鋁佐劑導(dǎo)致的小鼠腹膜刺激癥狀。三種重組乙型肝炎疫苗對小鼠給藥后7 d內(nèi)的體質(zhì)量增長值的影響不同，對豚鼠給藥后7 d內(nèi)的體質(zhì)量增長值未見明顯影響。