張 坤，江欣瑤，王 琰，唐萬(wàn)佳，劉 瑤，梁 東，夏 惠*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.四川華勝農(nóng)業(yè)股份有限公司，成都 618200）

獼猴桃屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），屬下有 66個(gè)種，118個(gè)變種及變型，是多年生落葉木質(zhì)藤本果樹，原產(chǎn)于中國(guó)，種群資源豐富，分布廣泛，是我國(guó)主要栽培的優(yōu)勢(shì)種質(zhì)[1]。獼猴桃屬植物是雌雄異株[2]，雌花雖是兩性器官的完全花，但雄蕊敗育不產(chǎn)生有活力的花粉，不被用做授粉樹；雄花則由雌蕊敗育而成，故不形成胚珠[3]，且后代常出現(xiàn)雄性多于雌性的現(xiàn)象[4-6]。獼猴桃雌雄株早期在形態(tài)差異細(xì)小，常規(guī)手段不能識(shí)別，只能在開花后才可識(shí)別，而獼猴桃植株一般從播種至開花結(jié)果約需4年以上，大大延遲育種時(shí)間，且獼猴桃群落中雄株數(shù)量大于雌株[7]。但在生產(chǎn)中獼猴桃雌雄植株的合理搭配可提高產(chǎn)量，因此早期鑒定栽培苗的雌雄，可以為后續(xù)研究及育種節(jié)省大量的時(shí)間、人力和物力[8]。

近年來(lái)，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)被開發(fā)利用于獼猴桃種質(zhì)資源以及生物學(xué)性狀的鑒定[9]。DNA分子標(biāo)記是不同生物基因組中某種特異性差異DNA序列的直觀反映[10]，它不受時(shí)空影響且在生物發(fā)育的不同階段，因此可以應(yīng)用于獼猴桃的早期性別鑒定。這些年，獼猴桃雌雄株鑒別的分子標(biāo)記也在國(guó)內(nèi)外相繼開發(fā)。C.Harvey等[11]用BSA混合分離分析法對(duì)12株中華獼猴桃雜交群體混合組進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)2個(gè)與雌雄相關(guān)的性別標(biāo)記，即雄性標(biāo)記SmY1和雌性標(biāo)記SmX。G.Gill等[12]進(jìn)而將RAPD的SmX轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的特異引物SCARs，提高了鑒別準(zhǔn)確率。姚春潮等[13]開發(fā)的2個(gè)雄性RAPD標(biāo)記S1032850和S79750，并在美味獼猴桃、中華獼猴桃雌雄個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證，前者的鑒定準(zhǔn)確率高于后者。柯輝鵬等[14]選取的4對(duì)引物分別對(duì)12株獼猴桃雌雄樣品進(jìn)行AFLP標(biāo)記擴(kuò)增，結(jié)果顯示同一品種的雌雄個(gè)體間擴(kuò)增出差異條帶，表明在DNA水平上不同性別的多態(tài)性差異。李旭等[15]以軟棗獼猴桃為材料進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記，結(jié)果表明me2-em1、me6-em6、me7-em5和me7-em7這4對(duì)引物在軟棗獼猴桃雌雄株間的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)出多態(tài)性，有效的對(duì)其雌雄株進(jìn)行分類。張瓊等[16]以F1代（山梨獼猴桃與中華獼猴桃種間雜交）為材料，通過(guò)構(gòu)建RAD-seq基因遺傳圖譜獲得基因組多態(tài)性分析標(biāo)記（SNPs），進(jìn)而開發(fā)出A001、A002和A003這3個(gè)雌雄鑒定的SSR標(biāo)記，能夠有效鑒定獼猴桃雌雄。張璐生等[17]以中華獼猴桃為材料，通過(guò)對(duì)雄性和雌性群體的RAPD分析，篩選出4個(gè)與性別基因連鎖的RAPD標(biāo)記。通過(guò)進(jìn)一步PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，引物OPA-9在雄性植株上都擴(kuò)增出特異性條帶（R4），而在雌性個(gè)體中僅有1株出現(xiàn)此帶。通過(guò)前人在獼猴桃植株上對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)的運(yùn)用，為本研究提供了可靠的參考。

雖然國(guó)內(nèi)外開發(fā)的獼猴桃雌雄株分子標(biāo)記眾多。然而至今，國(guó)內(nèi)外依舊未有對(duì)眾多性別鑒定相關(guān)分子標(biāo)記收集、利用及評(píng)價(jià)研究報(bào)道，且在國(guó)內(nèi)獼猴桃育種實(shí)踐應(yīng)用還較少。究其原因是對(duì)眾多雌雄株分子標(biāo)記的適用范圍，可操作性知之甚少。本研究旨在通過(guò)收集已開發(fā)的獼猴桃雌雄分子標(biāo)記，并對(duì)比其適用性和可靠性，篩選出最適用于鑒別獼猴桃雌雄的分子標(biāo)記，為獼猴桃早期選育工作節(jié)約時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 植物材料

41株已知性別的獼猴桃雌雄株材料（表1）于2020年6月采自四川華勝農(nóng)業(yè)股份有限公司九龍基地資源圃，選擇無(wú)病害、5年生以上植株，取其一年生枝上的幼嫩葉片，及本實(shí)驗(yàn)室繁殖10株當(dāng)年生實(shí)生苗。采摘后立即經(jīng)液氮速凍后帶回，放入-80℃超低溫冰箱中保存待用。

表1 本研究中使用的獼猴桃雌雄株材料Table 1 Male and female kiwifruit samples used in this study

(續(xù)表1)

1.2 獼猴桃性別分子標(biāo)記收集

經(jīng)前人研究，共收集到獼猴桃性別相關(guān)分子標(biāo)記5個(gè)，信息見(jiàn)表2，其中SCAR標(biāo)記2個(gè)，SNP標(biāo)記2個(gè)，RAPD標(biāo)記1個(gè)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小在304～950 bp。

表2 收集的獼猴桃雌雄標(biāo)記信息Table 2 Collected male and female marker information of Actinidia

1.3 DNA提取

通過(guò)改良的CTAB方法提取獼猴桃雌雄植物的基因組DNA[18]，并在1.0%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260和280 nm波長(zhǎng)處的OD值，以檢測(cè)其純度和濃度，并將其稀釋成濃度為20～30 ng/μL的工作液，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

使用20 uL反應(yīng)體系，正、反向引物各400 nmol/L，10 μL X Taq Master Mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），20 ng DNA模板。

參考G.Gill等[12]SCAR標(biāo)記擴(kuò)增的方法，參考郭丹丹等[19]SNP標(biāo)記擴(kuò)增的方法，參考姚春潮等[13]RAPD標(biāo)記擴(kuò)增的方法，并均略加改動(dòng)。SCAR/SNPPCR和RAPD-PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、1×TAE緩沖液、電泳的電壓為100 V/40 min中檢測(cè)，以每個(gè)標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物中條帶清晰、長(zhǎng)度大致合適為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 SCAR/SNP-PCR和RAPD-PCR的擴(kuò)增程序Table 3 Amplification procedures of SCAR/SNP-PCR and RAPD-PCR

1.5 獼猴桃雄性基因特異標(biāo)記片段序列分析

選取擴(kuò)增效果好、條帶單一的SmY1特異性回收產(chǎn)物，并送到成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在線進(jìn)行同源搜索，使用DNAstar軟件中MegAlign進(jìn)行序列比對(duì)驗(yàn)證[20]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)電泳圖譜中清晰條帶，保留穩(wěn)定可見(jiàn)的弱帶，忽略不穩(wěn)定的條帶，計(jì)算雌、雄性別的特異性條帶數(shù)，樣品間同一位點(diǎn)上的遷移條帶記為“+”，無(wú)則記為“-”。每個(gè)獼猴桃雌雄植株的鑒定準(zhǔn)確率計(jì)算方法為：鑒定正確的樣品數(shù)/樣品總數(shù)×100%=鑒定準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

提取41份已知獼猴桃性別及10株實(shí)生苗基因組DNA，部分DNA提取質(zhì)量如下所示（圖1），泳道無(wú)拖尾，表明DNA完整，且濃度都在20 ng/μL以上，可用于PCR模板。

圖1 部分樣品DNA電泳圖Figure 1 DNA electrophoresis of some samples

2.2 SmY1和SmX標(biāo)記擴(kuò)增體系的建立及通用性驗(yàn)證

分別對(duì)SmY1和SmX標(biāo)記在12份獼猴桃雌雄樣品進(jìn)行的體系優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明獼猴桃雌雄樣品中SmY1和SmX標(biāo)記擴(kuò)增的最適退火溫度分別為58.2℃和61℃。SmX標(biāo)記和SmY1標(biāo)記在部分獼猴桃基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果表明（圖2），在6份雌性樣品中，編號(hào)為2號(hào)和6號(hào)試材能擴(kuò)增出特異性條帶；在6份雄性樣品中，22號(hào)、24號(hào)和25號(hào)試材擴(kuò)增出特異性材料，且與預(yù)期標(biāo)記條帶位置一致。所以SmX標(biāo)記多態(tài)性表現(xiàn)差，沒(méi)有性別特異性，而與前人研究表明SmX是雌性特異標(biāo)記[11]，僅出現(xiàn)在雌性樣品中的結(jié)果不一致。因此SmX標(biāo)記不能廣泛應(yīng)用于獼猴桃性別鑒定。SmY1擴(kuò)增結(jié)果顯示，6份雌性樣品未能擴(kuò)增出雄性標(biāo)記SmY1條帶；而在6份雄性樣品全部擴(kuò)增出特異性條帶，且與預(yù)期標(biāo)記條帶位置一致，鑒別準(zhǔn)確率為100%，與前人報(bào)道SmY1為雄性特異標(biāo)記結(jié)果一致[11]?？捎糜讷J猴桃性別鑒定，但仍需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。

圖2 部分樣品SmX和SmY1標(biāo)記擴(kuò)增圖譜Figure 2 Amplification maps of SmX and SmY1 in some samples

2.3 L11和L51標(biāo)記擴(kuò)增體系的建立及通用性驗(yàn)證

分別對(duì)L11和L51標(biāo)記在12份獼猴桃樣品進(jìn)行體系優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證。結(jié)果表明L11標(biāo)記在12份試材都未擴(kuò)增特異性，而L51標(biāo)記僅在22號(hào)品種擴(kuò)增出特異性條帶（圖3），與前人研究結(jié)果不一致[19]。因此L11和L51標(biāo)記都無(wú)法廣泛用于雌雄株鑒定。

圖3 部分樣品L11和L51標(biāo)記擴(kuò)增圖譜Figure 3 Amplification map of L11 and L51 in some samples

2.4 S1032850標(biāo)記擴(kuò)增體系的建立及通用性驗(yàn)證

通過(guò)在S1032850標(biāo)記中的驗(yàn)證表明（圖4），4份雌性植株均未能夠擴(kuò)增出目的條帶；4份雄性樣品中，雖擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，但與目標(biāo)條帶大小不一致。這也與原報(bào)道中S1032850為雄性特異標(biāo)記結(jié)果不符[13]，但本研究中其它特異性條帶微弱，后期可以通過(guò)調(diào)整體系等進(jìn)行優(yōu)化。也進(jìn)而表明該標(biāo)記不能廣泛應(yīng)用于雌雄鑒定。

圖4 部分樣品S1032850標(biāo)記擴(kuò)增圖譜Figure 4 Amplification map of S1032850 in some samples

2.5 SmY1特異擴(kuò)增序列比對(duì)

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SmY1回收產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其結(jié)果表明擴(kuò)增序列與登錄號(hào)為AY336259.1的序列相似性最高，而AY336259.1是與性別相關(guān)的RAPD標(biāo)記片段。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，將兩條序列分進(jìn)行比對(duì)分析（圖5），結(jié)果顯示序列的相似性為82.39%，因此，SmY1標(biāo)記可廣泛地應(yīng)用于獼猴桃雌雄性別鑒定。

圖5 SmY1標(biāo)記產(chǎn)物序列與相似序列比對(duì)結(jié)果Figure 5 SmY1 labeled product sequence and similar sequence alignment results

2.6 SmY1標(biāo)記在剩余樣本的進(jìn)一步驗(yàn)證

對(duì)剩余的獼猴桃樣品進(jìn)行SmY1標(biāo)記（圖6），PCR擴(kuò)增結(jié)果表明21份雌性樣品在SmY1標(biāo)記中均未擴(kuò)增出雄性特異性條帶；而在20份雄性樣品中，17份材料擴(kuò)增出SmY1標(biāo)記條帶，且與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。

圖6 SmY1標(biāo)記在部分獼猴桃的擴(kuò)增圖譜Figure 6 Amplification map of SmY1 label in some kiwifruit

由表4可知，SmY1標(biāo)記對(duì)21個(gè)雌性樣品的鑒定準(zhǔn)確率為100%，而在對(duì)20個(gè)雄性個(gè)體檢測(cè)中，僅有3個(gè)樣品未出現(xiàn)特異條帶，雄性鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率為85%。

2.7 應(yīng)用SmY1標(biāo)記對(duì)實(shí)生幼苗鑒定

將SmY1標(biāo)記應(yīng)用到實(shí)生幼苗的鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表5，結(jié)果表明在10份實(shí)生苗樣品中，能夠擴(kuò)增出特異性條帶的材料僅有3份，進(jìn)而表明SmY1標(biāo)記在實(shí)生幼苗中能擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶，可應(yīng)用于實(shí)生苗的鑒定，但其鑒定結(jié)果還須下一步進(jìn)行田間調(diào)查來(lái)驗(yàn)證該標(biāo)記鑒定的準(zhǔn)確性。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析，也被應(yīng)用于植物的早期性別鑒定，有利于開展植物性別鑒定工作。特別是在傳統(tǒng)方法應(yīng)用于性別鑒定受到一定限制時(shí)，研究者往往會(huì)運(yùn)用生物技術(shù)等分子方法來(lái)鑒定植物雌雄性別。R.W.Michelmore等[21]根據(jù)混合分組分析法（BSA）的基因標(biāo)記定位，與分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，獲得與雌雄異株植物性別相關(guān)的連鎖標(biāo)記；姚春潮等[13]將RAPD標(biāo)記S1032850在中華和美味獼猴桃原變種雄株中進(jìn)行驗(yàn)證，其可鑒定部分中華系雄株個(gè)體。但在本研究中，存在由于條帶微弱；鑒定效果不明顯的現(xiàn)象，這可能是由于該標(biāo)記為轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記的原因。L.G.Fraser等[22]在將雄性性別標(biāo)記SmY1定位在了染色體性別決定區(qū)域[23]，通過(guò)對(duì)SmY1特異性條帶的擴(kuò)增回收比對(duì)，SmY1對(duì)性別具有特異性，表明其是雄性連鎖標(biāo)記。郭丹丹[19]利用SmX、SmY1對(duì)軟棗獼猴桃的驗(yàn)證，表明SmX未表現(xiàn)出雌雄特異性，雖SmY1在軟棗獼猴桃中能夠擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，但未表現(xiàn)出雌雄特異性。但在本研究中發(fā)現(xiàn)SmY1標(biāo)記對(duì)中華獼猴桃鑒定準(zhǔn)確率高，更具鑒定可靠性，而SmY1對(duì)其他種的鑒定準(zhǔn)確率仍不穩(wěn)定，還需大量樣本驗(yàn)證。此外，還對(duì)郭丹丹[19]經(jīng)全基因組重測(cè)序篩選得到2個(gè)性別特異序列標(biāo)記，即L11和L51，但本研究中華獼猴桃和美味獼猴桃都未擴(kuò)增出特異性條帶，與原研究在中華獼猴桃通用性好結(jié)果相反。這可能是由于該性別標(biāo)記是經(jīng)SNP變異位點(diǎn)[24]篩選而成，而常規(guī)瓊脂糖電泳可能無(wú)法擴(kuò)增出特異性條帶，還需改進(jìn)PCR擴(kuò)增體系以及擴(kuò)大軟棗獼猴桃種質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。SmY1能在實(shí)生幼苗擴(kuò)增出特異性條帶，后期可結(jié)合田間調(diào)查以驗(yàn)證鑒定的準(zhǔn)確率，以此將該標(biāo)記應(yīng)用于獼猴桃實(shí)生幼苗的鑒定。

本研究通過(guò)對(duì) SmX、SmY1、S1032850、P11和P51的初步篩選對(duì)比發(fā)現(xiàn)：SmX和S1032850標(biāo)記所擴(kuò)增的條帶未表現(xiàn)雌雄特異性，準(zhǔn)確率很低，后期可以通過(guò)調(diào)整體系、篩選最適退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化；L11、L51未擴(kuò)增出條帶，無(wú)法用于雌雄株鑒定；而利用SmY1對(duì)41份已知性別的獼猴桃材料的通用性進(jìn)行了檢驗(yàn)。結(jié)果表明SmY1表現(xiàn)出良好的性別特異性，雄性植株性別鑒定準(zhǔn)確率85%，雌性為100%，可在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用于中華獼猴桃雌雄的早期鑒定，減少人力、物力和選育成本的開支，也對(duì)后續(xù)性別標(biāo)記的開發(fā)提供參考依據(jù)。