林婷，楊勝平,2，郁佳怡，謝晶,2，錢韻芳,2*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)，又名凡納濱對蝦，其富含的蝦青素具有抗氧化、抑制炎癥及調(diào)節(jié)免疫活性等多種生物功能，因此深受消費(fèi)者歡迎。腐敗希瓦氏菌在南美白對蝦貯藏過程中代謝產(chǎn)生異臭味物質(zhì)，導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)[1]。黑變是導(dǎo)致蝦類水產(chǎn)品品質(zhì)劣變的另一重要原因，且黑變速率往往早于微生物腐敗[2-3]。雖然黑色素的產(chǎn)生并不會造成食用安全性問題，但增加了消費(fèi)者感官上的不可接受性[4]。現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為，黑變的發(fā)生主要是在蝦內(nèi)源性多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化下酪氨酸氧化成L-3,4-二羥基苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenylL-alanine，L-DOPA)，而后轉(zhuǎn)變成醌類物質(zhì)[5]，從而進(jìn)一步氧化成深棕色黑色素或參與蛋白質(zhì)官能團(tuán)的聚合反應(yīng)，形成交聯(lián)聚合物，呈現(xiàn)為深色的黑色素[6]，而不是由微生物代謝產(chǎn)生的，但其激活過程可能與微生物有關(guān)[7]。

為了解微生物在蝦類黑變過程中的作用，本研究將腐敗希瓦氏菌接種于經(jīng)滅菌處理的南美白對蝦上，分析南美白對蝦在貯藏過程中的品質(zhì)和理化指標(biāo)的變化，探究腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦黑變及品質(zhì)劣變的影響，以期為揭示南美白對蝦品質(zhì)劣變的原因提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

腐敗希瓦氏菌(ShewanellaputrefaciensQY38，NCBI號：KX692894)，課題組前期從腐敗南美白對蝦中分離、篩選并鑒定，并在-80 ℃下保存菌株。

南美白對蝦購于上海市浦東新區(qū)蘆潮港海鮮市場，用碎冰使其休克失活，并用雙蒸水清洗2次。

1.2 試驗(yàn)試劑

4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol，4-HR)，上海阿拉丁試劑公司；Proclin-300、PPO活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鐵瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；CR-400型色差計(jì)，日本Konica Minolta公司；Kjeltec 2300型凱氏定氮儀，瑞士FOSS公司；超凈工作臺，上海康福特環(huán)境科技有限公司；XB220A-SCS分析天平，北京普利賽斯科技有限公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì)，美國尤尼柯儀器有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；LHS-100CL型恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MR23-060H-I型低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化

參考YANG等[8]的方法，腐敗希瓦氏菌QY38菌株實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行活化處理：30 ℃水浴解凍凍存的腐敗希瓦氏菌菌液，取1 mL至滅菌的9 mL腦心浸肉湯中30 ℃、150 r/min活化18 h，取活化菌液1 mL至9 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h，得到在對數(shù)期的腐敗希瓦氏菌菌液(108CFU/mL)，使用前用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL。

1.4.2 樣品預(yù)處理

將鮮活的南美白對蝦用碎冰低溫致死，挑選無損傷且質(zhì)量在16～18 g的蝦若干，先經(jīng)過0.05% Proclin-300浸泡10 min滅菌處理，然后用無菌水沖洗3遍，之后隨機(jī)分為3組。以未接菌為對照組(A組)，接種腐敗希瓦氏菌為B組及以0.15 mg/mL 4-HR浸泡5 min并接種腐敗希瓦氏菌的組別為C組。在無菌密封袋中，4 ℃冰箱貯藏，各指標(biāo)測定1次/d。

1.4.3 感官評分

依據(jù)對蝦的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)并參考趙海鵬等[9]的方法，對南美白對蝦從肌肉組織、外觀和氣味等方面進(jìn)行評分。

1.4.4 色差值

根據(jù)QIAN等[10]的方法稍做修改，用白色校準(zhǔn)板校準(zhǔn)色差計(jì)后，測定南美白對蝦頭和第二腹節(jié)的L*、a*、b*的值，每個平行樣品測定3次，取平均值。

根據(jù)公式(1)計(jì)算總白度值[11]，平行測定3次。

白度值=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]0.5

(1)

式中：L*值為亮度，黑白差值；a*值為紅綠差值；b*值為黃藍(lán)差值。

1.4.5 質(zhì)構(gòu)特性的測定

根據(jù)藍(lán)蔚青等[12]的方法稍做修改，對南美白對蝦第二腹節(jié)肌肉置于測試面中心進(jìn)行質(zhì)地多面分析(texture profile analysis，TPA)。測試條件為：平底柱形探頭P50、測前速率3.00 mm/s、測試速率1.00 mm/s、測后速率1.00 mm/s、壓縮變形率30%，每個樣品測試6次，取平均值。

1.4.6 揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)測定

參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》，利用自動凱氏定氮儀平行測定各組樣品貯藏期間的TVB-N值，每組5 g樣品做3個平行，取平均值，結(jié)果以mg/100g表示。

1.4.7 PPO活性

參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以1 min 1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中使410 nm處吸光度變化的值表示酶活力。

1.4.8 菌落總數(shù)(total viable count，TVC)測定

在超凈臺上操作，稱取25.00 g蝦肉于225 mL無菌生理鹽水中混合，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》中的方法用鐵瓊脂培養(yǎng)基測定蝦的菌落數(shù)。每個稀釋度作2次平行，以滅菌的稀釋度作為空白對照試驗(yàn)，結(jié)果以lgCFU/g表示。

1.4.9 低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)分析

將整只帶殼南美白對蝦用保鮮膜包裹，放入核磁檢測管中。參考張楠楠等[13]的方法設(shè)置參數(shù)，通過對序列指數(shù)衰減曲線圖經(jīng)分析軟件進(jìn)行批量反演，得到樣品在不同時期的橫向弛豫時間T2譜圖。

1.4.10 核磁共振成像技術(shù)(magnetic resonance imaging，MRI)分析

采用MRI技術(shù)測定樣品的質(zhì)子密度圖譜，將帶殼南美白對蝦包上保鮮膜后直接放入直徑70 mm的核磁管中，隨后在低場核磁共振成像儀中予以成像分析。

1.4.11 肌漿蛋白組成測定

參考NIAMNUY等[14]的方法，取蝦肉5 g，加入10倍體積預(yù)冷的緩沖液A(15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5)均質(zhì)，4 ℃下10 000 r/min 離心15 min，再在沉淀中加入10倍體積緩沖液A，重復(fù)上述操作2次，將3次離心后的上清液合并，即為肌漿蛋白提取液。

將不同待測樣品溶液與2倍上樣緩沖液等體積混合，沸水浴5 min。采用12%分離膠和5%濃縮膠制膠，使用80 V進(jìn)行SDS-PAGE，待樣品進(jìn)入分離膠時電壓調(diào)至100 V，直至電泳結(jié)束，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色液染色，使用脫色液脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)試驗(yàn)平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖，組間分析采用t檢驗(yàn)，顯著性界值以P<0.01為極顯著，P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種腐敗希瓦氏菌的南美白對蝦微生物生長情況

4 ℃條件下不同處理方式的南美白對蝦微生物變化情況如圖1所示。A組初始菌落數(shù)為3.44 lgCFU/g，而新鮮南美白對蝦的初始菌落總數(shù)一般為4.28 lgCFU/g[15]，說明Proclin-300處理能夠減菌90%左右，且在貯藏過程中始終與接菌組保持2 lgCFU/g左右的差值。B、C接菌組的初始菌落總數(shù)為6.11 lgCFU/g和6.27 lgCFU/g,比對照組至少高2.67 lgCFU/g，說明背景雜菌在接種腐敗希瓦氏菌的群落中占比較小。在貯藏過程中，3組樣品的菌落總數(shù)、嗜冷菌和產(chǎn)H2S菌的菌落數(shù)均呈上升趨勢，且2組接菌組微生物數(shù)量相近。接菌組中產(chǎn)H2S菌數(shù)量與菌落總數(shù)和嗜冷菌接近，而腐敗希瓦氏菌屬于產(chǎn)H2S菌[16]，說明接菌組中能產(chǎn)H2S的腐敗希瓦氏菌占主導(dǎo)地位，對蝦可能產(chǎn)生的腐敗影響主要由腐敗希瓦氏菌產(chǎn)生。

a-總菌；b-嗜冷微生物；c-產(chǎn)H2S菌圖1 不同處理方式南美白對蝦微生物的變化圖Fig.1 Changes in microorganism of shrimps in different treatment groups

2.2 接種腐敗希瓦氏菌的南美白對蝦感官評分

南美白對蝦的感官評分主要由肌肉組織、外觀和氣味3部分組成，其變化如圖2所示。4 ℃條件下未接菌的A組在Proclin-300的作用下微生物生長較緩，雖然肉質(zhì)、氣味、脫殼松軟度方面較接菌組好，但在貯藏2 d后就出現(xiàn)了黑變現(xiàn)象，說明Proclin-300不能抑制黑變；B組為添加了Proclin-300的接菌組，不僅發(fā)生了嚴(yán)重的黑變，且在腐敗希瓦氏菌的作用下出現(xiàn)汁液流失、散發(fā)強(qiáng)烈的氨臭味和硫臭味、蝦殼變軟等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，感官評分最低；C組為添加了4-HR的接菌組，該組別在4-HR的作用下顯著延緩南美白對蝦黑變，蝦身呈現(xiàn)灰白色不透明狀，因黑變程度低，其感官總體評分仍高于其他2個組別，進(jìn)一步證實(shí)4-HR是一種有效的抑黑變保鮮劑[4]。

2.3 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦PPO活性的影響

PPO大部分分布于對蝦血液里、頭胸部和關(guān)節(jié)處等，是其免疫應(yīng)答系統(tǒng)的重要組成部分[17]，也是多酚氧化酶原激活系統(tǒng)(propolyphenol oxidase activating system，proPPO-AS)級聯(lián)反應(yīng)鏈中的關(guān)鍵酶，是黑色素形成的限速條件[18]。圖3為不同處理組對蝦PPO活性的變化情況。

圖2 不同處理方式南美白對蝦的感官評分變化Fig.2 Changes of sensory score of shrimps in different treatment groups

圖3 不同處理組對蝦PPO活性的變化Fig.3 Changes of PPO activity of shrimps in different treatment groups

從3圖中可以看出，3組樣品中A組的PPO活性初始值最高，為7.92 U/g，而C組PPO活性僅為 0.12 U/g，這與4-HR對蝦中PPO活性抑制作用有關(guān)，而Procline-300抑菌處理對PPO活性無顯著影響。研究表明Procline-300是一種微生物抑制劑，但對酶活性的影響較小[19]。A組PPO活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，可能與初始微生物數(shù)量較低，其后緩慢增加的變化趨勢有關(guān)。有研究表明微生物多糖如幾丁質(zhì)，β-葡聚糖，脂多糖和脂蛋白酸等免疫調(diào)節(jié)性碳水化合物可以激活proPPO-AS系統(tǒng)[20]，在對蝦血淋巴中通過一系列級聯(lián)反應(yīng)將無活性的多酚氧化酶原(propolyphenol oxidase，proPPO)轉(zhuǎn)化為有活性的PPO[21]。B組的初始PPO活性為3.84 U/g，第3天后快速升高，第5天時達(dá)到7.08 U/g，且已超過A組，說明接種腐敗希瓦氏菌能夠促進(jìn)PPO活性的升高。C組PPO活性在初始階段因受到4-HR的抑制而明顯偏低，但在貯藏過程中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這可能與接菌后PPO在微生物和內(nèi)源酶的作用下不斷被激活釋放有關(guān)，但整體水平始終低于B組和A組。

2.4 接種腐敗希瓦氏菌的南美白對蝦色差值變化

南美白對蝦在貯藏和加工過程中，體表會出現(xiàn)黑斑，是多酚氧化酶催化酪氨酸氧化等一系列反應(yīng)產(chǎn)生的黑色素[22]。由圖4-a和圖4-b可知，隨著貯藏時間的延長，4-HR抑酶組白度值始終高于未抑酶組，說明抑制PPO活性能夠顯著延緩南美白對蝦的黑變。而同樣經(jīng)過Proclin-300處理的接菌組白度值低于未接菌組，可能是由于腐敗希瓦氏菌的細(xì)胞壁能激活酪氨酸酶原，進(jìn)而影響黑變的反應(yīng)速度[23]。

新鮮蝦體因蝦青素與蛋白質(zhì)復(fù)合而呈綠或藍(lán)色，但在貯藏過程中其蛋白質(zhì)-色素復(fù)合體被分解，導(dǎo)致色素游離使體表變紅[24]，通常由a*值表示蝦體紅變情況。由圖4-c和圖4-d可知，隨著貯藏時間的延長，樣品a*值持續(xù)增加。由于南美白對蝦頭部含有內(nèi)臟等不透明的有色物質(zhì)，頭部較蝦體較早開始變紅，且接菌組始終高于未接菌組，說明腐敗希瓦氏菌促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解進(jìn)而促進(jìn)蝦體內(nèi)的蝦青素或蝦青素酯的釋放。而蝦身樣品色澤相對透明，各組別a*值雖持續(xù)上升但顯著性差異不明顯，僅最后1 d的接菌組顯著高于未接菌組。

a、c-蝦頭；b、d-蝦身圖4 不同處理組的白度值和a*值的變化Fig.4 Changes in variance of lightness and redness (a*) in different treatment groups

2.5 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦TVB-N含量的影響

TVB-N含量常用于評價水產(chǎn)品腐敗程度，通過反映水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)在微生物和酶的共同作用下，分解而產(chǎn)生的三甲胺、二甲胺、氨和其他胺類等堿性含氮物生成量[12, 25]。由圖5可知，3組樣品TVB-N值含量在貯藏初期分別為5.49、7.78、9.38 mg/100g，接菌組樣品的TVB-N值略高，這可能與接種腐敗希瓦氏菌的浸泡處理有關(guān)。隨著貯藏時間的延長，3組樣品的TVB-N含量整體呈上升趨勢，B和C兩組接菌組在貯藏前2 d TVB-N含量相近，且略高于未接菌組，表明TVB-N含量的上升與腐敗希瓦氏菌生長代謝活動有關(guān)。貯藏3 d后，C組TVB-N值整體水平明顯高于A組和B組，且組別間差異逐漸增大，這可能與該組別中在4-HR的作用下黑色素生成減少有關(guān)。有研究表明黑色素物質(zhì)具有抑制腐敗菌生長的作用[26]，而本研究表明黑色素物質(zhì)的作用可能更多表現(xiàn)在抑制腐敗菌的致腐能力。

圖5 不同處理組對蝦TVB-N值的變化Fig.5 Changes in TVB-N value of shrimps in different treatment groups

2.6 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦質(zhì)構(gòu)特性的影響

蝦類等水產(chǎn)品在微生物與內(nèi)源酶的作用下，其肌肉組織與質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生相應(yīng)變化，最終導(dǎo)致肌體軟化、彈性和食用口感下降，其中彈性反映食品恢復(fù)形狀的能力，可部分反映食物的口感[12]。如圖6所示，隨著南美白對蝦貯藏時間的延長，各組硬度、彈性均呈下降趨勢。貯藏至第3天時，B組樣品的硬度降至6 536.80 g，A、C組在第3天的時候分別為6 475.26和6 690.36 g；同時，樣品的彈性由初期0.91、0.90、0.92在貯藏末期分別降至0.85、0.80、0.69，彈性損失率分別為7.02%、11.57%、24.14%。在整個貯藏期間，A組樣品的硬度略高于B、C組，但B、C組差異不明顯。如圖6-b所示，隨著貯藏時間的延長，咀嚼性下降幅度增加，第5天時咀嚼性分別降低 53.94%、54.49%、54.57%，且在貯藏過程中，A、B組樣品的咀嚼性下降速度緩于C組。由質(zhì)構(gòu)結(jié)果的組間差異顯著性分析，肌肉硬度、肌肉細(xì)胞間凝聚力與彈性下降會造成樣品的咀嚼性降低(P>0.01)。這可能表明接種腐敗希瓦氏菌會加速南美白對蝦肌肉蛋白的腐敗，最終導(dǎo)致硬度和彈性的下降。C組的硬度和彈性在貯藏中后期出現(xiàn)明顯的下降，與TVB-N的變化呈負(fù)相關(guān)，說明C組蝦肉蛋白在貯藏中后期發(fā)生了更嚴(yán)重的降解劣變。

a-硬度；b-彈性圖6 不同處理組對蝦硬度和彈性的變化Fig.6 Changes of polyphenol oxidase activity of shrimps in different treatment groups

2.7 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦核磁共振與成像的影響

MRI通過呈現(xiàn)二維的質(zhì)子密度圖，能夠直觀地檢測到肌體內(nèi)水分的空間分布狀態(tài)。樣品不同區(qū)域的信號強(qiáng)度與水分子含量成正比，一般來說，圖像中顏色越亮，代表此區(qū)域的水質(zhì)子信號越強(qiáng)，表明蝦仁體內(nèi)的水分含量就越高[12]。如圖7所示，相較于新鮮樣品，處理后蝦頭部水分含量有所下降，蝦質(zhì)子密度圖整體色澤仍呈紅色，主要集中在蝦頭。隨著貯藏時間的延長，3組南美白對蝦蝦肉中質(zhì)子密度加權(quán)像偽彩圖的亮度逐漸減弱，在3 d后開始蝦身呈現(xiàn)與底色相近的藍(lán)色，蝦頭部的紅色區(qū)域也逐漸變小、變黃，表明水分逐漸流失，說明品質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重的劣變。LF-NMR的橫向弛豫時間圖譜上有3個峰，分別是T21(0.1～4.0 ms)、T22(10～86 ms)、T23(200～900 ms)[12]。在整個貯藏期間，隨著貯藏時間的延長，3組樣品T22振幅均明顯降低，說明在對蝦中自由水移動性逐漸增強(qiáng)，即蝦肉持水性降低。其中未接種腐敗希瓦氏菌的組別蝦肉中非水組分物質(zhì)結(jié)合更牢固，表明腐敗希瓦氏菌影響南美白對蝦的腐敗，破壞其肌肉結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致束縛水向自由水轉(zhuǎn)變，肌肉中水分流失。

a-1H-MRI圖；b-信號強(qiáng)度圖圖7 不同處理組對蝦的1H-MRI圖和信號強(qiáng)度圖Fig.7 Pseudo color of 1H-MRI and signal intensity for shrimps in different treatment groups注：X-鮮樣；A-Proclin-300處理；B-Proclin-300+ 腐敗希瓦氏菌處理；C-4-HR處理；0～5分別表示貯藏0～5 d

2.8 接種腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦肌漿蛋白的影響

水產(chǎn)品肌肉蛋白質(zhì)可以分為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(肌原纖維蛋白、肌漿蛋白)和細(xì)胞外蛋白質(zhì)(堿溶性蛋白和肌基質(zhì)蛋白)，其中肌漿蛋白是水溶性蛋白的主要成分，其變化可用于指示蝦的鮮度變化[27]。由圖8可知，A組中條帶I(66 kDa)，光密度在貯藏前后變化不明顯，但在B、C組中快速消失，說明腐敗希瓦氏菌會加速條帶I蛋白的分解。3組樣品中條帶II(45 kDa)、III(27～45 kDa)、IV(14.4～27 kDa)光密度在貯藏過程逐漸減弱直至消失，說明這幾種主要的肌漿蛋白也發(fā)生了降解，這可能是內(nèi)源性蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶共同作用的結(jié)果。

圖8 不同處理組對蝦肌漿蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein for shrimps in different treatment groups

3 結(jié)論

本文分別以未接菌組和4-HR處理的接菌組為對照，探究了腐敗希瓦氏菌對南美白對蝦黑變及品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌不僅與蝦肉蛋白的降解、水分流失、硬度和彈性的下降明顯相關(guān)，且具有促進(jìn)PPO活性和對蝦黑變的作用，該作用機(jī)理可能與PPO原激活系統(tǒng)有關(guān)，因此其生長變化應(yīng)受到關(guān)注和抑制。4-HR作為蝦類保鮮劑僅能通過抑制PPO酶活性發(fā)揮防黑變作用，而對微生物引起的腐敗變質(zhì)沒有影響，因此在使用過程中需要配合抑菌劑才能達(dá)到相對較好的保鮮效果。