GC-IMS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析不同采后處理對(duì) 柑橘果皮揮發(fā)性化合物的影響

李 湘，江 靖，李高陽(yáng)，單 楊，朱向榮

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；4.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

柑橘是我國(guó)第一大水果，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[1]。柑橘果肉多汁，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。但柑橘在采后貯藏期間，易感染青霉病、綠霉病和酸腐病等病害[3-4]，引起腐爛變質(zhì)，其腐損率高達(dá)20%～30%，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且污染環(huán)境[5]。目前，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)發(fā)了許多柑橘采后保鮮技術(shù)，如化學(xué)防腐、物理保鮮和生物保鮮等，都可以降低柑橘果實(shí)腐爛，延長(zhǎng)貨架期[6]。

熱處理（heat treatment，HT）是目前公認(rèn)的綠色環(huán)保型保鮮處理手段，可抑制病原菌的生長(zhǎng)，降低果蔬病害發(fā)生率[7]。HT在柑橘采后指狀青霉菌的抑制[8]、甜瓜腐爛率降低[9]方面發(fā)揮著較大作用。溫州蜜橘經(jīng)HT，果皮中抗性相關(guān)蛋白、木質(zhì)素及黃酮類物質(zhì)等主要代謝產(chǎn)物含量增加，這對(duì)果實(shí)抗病性具有重要意義[10]。臭氧具有分解快、殘留效應(yīng)小等特點(diǎn)，是普遍公認(rèn)安全性的食品防腐劑替代品[11]。適當(dāng)?shù)某粞跆幚砜烧T導(dǎo)與抗氧化、抗菌活性相關(guān)的初級(jí)代謝產(chǎn)物參與果實(shí)衰老和病害調(diào)控，果實(shí)產(chǎn)生抗性，抑制葡萄、木瓜和蘑菇等果蔬致病菌菌絲的生長(zhǎng)[12-14]。但以上研究多從次生代謝產(chǎn)物變化入手，而對(duì)揮發(fā)性成分變化研究較少。柑橘等水果果皮包含檸檬烯、芳樟醇、辛醛、癸醛、γ-松油烯和α-松油醇等主要揮發(fā)性成分，對(duì)霉菌具有較強(qiáng)的抑制活性[15]。因而分析揮發(fā)性成分變化與果蔬抑菌保鮮的聯(lián)系有重要意義。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)和氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GCIMS）技術(shù)是分析揮發(fā)性化合物中常用的技術(shù)手段。與GC-MS相比，GC-IMS是利用GC在極短時(shí)間內(nèi)分離復(fù)雜混合物，使混合物成為單一組分后，根據(jù)氣相離子遷移率對(duì)化合物進(jìn)行表征的方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)十億分之一，具有極高的分辨率、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[16-17]。近年來(lái)，GC-IMS被廣泛應(yīng)用于食品中的揮發(fā)性化合物分析、食品摻假鑒別及品種溯源等領(lǐng)域[18-21]。

本研究采用HT和臭氧熏蒸（ozone fumigation，OF）對(duì)柑橘進(jìn)行采后處理，利用GC-IMS技術(shù)快速檢測(cè)柑橘果皮中揮發(fā)性化合物，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）法，分析處理前后柑橘果皮揮發(fā)性化合物的變化，鑒定與誘導(dǎo)抗性相關(guān)的化合物，以期為柑橘采后綠色保鮮技術(shù)的使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溫州蜜橘，產(chǎn)自湖南郴州東江湖，2019年9月10日購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙市毛家橋水果市場(chǎng)。

FlavourSpec?風(fēng)味分析儀 山東海能科學(xué)儀器有限 公司；HH-8數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 常州億通分析儀器制造有限公司；氣調(diào)保鮮試驗(yàn)箱 杭州屹石科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

挑選無(wú)損傷、外觀顏色、大小相近的溫州蜜橘，洗凈并晾干，經(jīng)HT（50 ℃水浴2 min）和OF（熏蒸30 min）后，剝?nèi)」?，置于?0 ℃冰箱中冷凍保存。不經(jīng)處理的溫州蜜橘作對(duì)照（CK）。隨機(jī)分別稱取CK、HT、OF柑橘果皮樣品1 g，置于20 mL頂空瓶中，每組取3 個(gè)樣品，測(cè)3 次平行。

1.2.2 GC-IMS分析條件

分析時(shí)間：20 min；色譜柱類型：FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm）；柱溫：60 ℃；載氣/漂移氣：N2；IMS溫度：45 ℃；采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為200 μL；孵育時(shí)間：15 min；孵育溫度：40 ℃；進(jìn)樣針溫度：65 ℃；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用儀器配套的分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和3 款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件、Dynamic PCA插件）以及GC×IMS Library Search從不同角度進(jìn)行樣品分析；采用Origin 2020軟件中的Heat map with dendrogram插件繪制聚類分析熱圖；采用SIMCA 14.1進(jìn)行PLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理柑橘果皮中揮發(fā)性化合物GC-IMS分析

使用Reporter插件生成了不同處理柑橘果皮中揮發(fā)性化合物的GC-IMS二維俯視圖，如圖1所示，左側(cè)紅色豎線為反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP），整個(gè)背景圖為藍(lán)色，反應(yīng)離子峰右側(cè)每一點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物，顏色深淺程度代表?yè)]發(fā)性化合物含量，白色區(qū)域代表化合物含量低，紅色區(qū)域代表化合物含量高。如圖1所示，大部分信號(hào)出現(xiàn)在遷移時(shí)間1.0～1.8 ms和保留時(shí)間100～700 s的區(qū)域，不同處理組與CK組中A、B區(qū)域相比較，紅點(diǎn)區(qū)域變大、顏色變深，說(shuō)明HT和OF能使柑橘果皮揮發(fā)性化合物含量增加。

圖1 不同處理柑橘果皮中揮發(fā)性化合物GC-IMS二維俯視圖Fig. 1 Two-dimensional GC-IMS topographic maps of volatile compounds in citrus peel under different treatments

2.2 不同處理柑橘果皮中揮發(fā)性化合物定性分析

利用離子遷移時(shí)間和保留指數(shù)對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性鑒別，柑橘果皮揮發(fā)性部分化合物會(huì)產(chǎn)生二聚體甚至三聚體，它們保留時(shí)間相近，但遷移時(shí)間 不同[22]。柑橘果皮揮發(fā)性化合物定性分析如圖2所示，CK、HT和OF樣品中揮發(fā)性化合物圖譜基本一致，但化合物含量存在差異。

圖2 柑橘果皮中揮發(fā)性化合物信號(hào)峰位置點(diǎn)Fig. 2 Signal peak location points of volatile compounds in citrus peel

從GC×IMS文庫(kù)中共鑒定出49 種典型化合物，表1 列出了樣品中所有已鑒定的物質(zhì)，化合物屬性包括名稱、保留指數(shù)、保留時(shí)間和遷移時(shí)間。結(jié)果顯示，柑橘果皮中揮發(fā)性化合物包括13 種醇類、12 種醛類、9 種萜烯類、7 種酯類、4 種酮類、3 種呋喃類和1 種酸類。

表1 柑橘果皮中揮發(fā)性化合物的定性測(cè)定Table 1 Volatile compounds identified by GC-IMS in citrus peel

2.3 不同處理柑橘果皮中揮發(fā)性成分的指紋圖譜分析

根據(jù)Gallery Plot插件生成的不同處理柑橘果皮的指紋圖譜，能直觀且定量地比較不同處理樣品之間揮發(fā)性化合物差異。圖中每行代表一個(gè)柑橘果皮樣品中所含的揮發(fā)性化合物，每列表示不同樣品之間同一種揮發(fā)性化合物的對(duì)比。顏色深淺程度代表?yè)]發(fā)性化合物的含量，顏色越亮，含量越高。如圖3所示，對(duì)照組與兩個(gè)處理組樣品差異顯著，如CK樣品中丙醛、3-甲基丁醛、丁醛、乙縮醛、3-羥基丁酮、2-丁酮、丙酮和乙酸等含量較高，但總體而言，從圖3可知，處理組樣品中許多揮發(fā)性化合物含量高于對(duì)照組，OF處理樣品中α-松油醇、β-松油醇、苯甲醛、2-乙?；秽?、2-乙基呋喃、1-戊醇、甲酸乙酯、2-己酮等含量較高，HT處理樣品中丁酸丙酯、正己醇、丙酸乙酯等含量較高。

圖3 不同處理柑橘果皮中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of volatile compounds in citrus peel under different treatments

2.4 不同處理柑橘果皮揮發(fā)性化合物的PCA

PCA核心思想是降低由大量相關(guān)變量組成的數(shù)據(jù)集維數(shù)，同時(shí)盡可能保留數(shù)據(jù)集中存在的變化[23]。使用Dynamic PCA插件對(duì)不同處理的柑橘果皮樣品進(jìn)行PCA。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同處理的柑橘果皮揮發(fā)性化合物含量進(jìn)行PCA，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，并給出前2 個(gè)PC的分布圖。一般來(lái)說(shuō)，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到80%以上的前幾個(gè)PC，都可以選作最后的PC，實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的區(qū)分。結(jié)果表明，前2 個(gè)PC方差貢獻(xiàn)率分別為66.4%和14.2%。如圖4所示，基于揮發(fā)性化合物含量的差異，PCA可以將CK、HT、OF不同組樣品進(jìn)行有效區(qū)分。

圖4 不同處理樣品中揮發(fā)性化合物的PCA圖Fig. 4 PCA plot for discriminating volatile compounds in different treated samples

2.5 不同處理樣品揮發(fā)性化合物的PLS-DA

PLS-DA與PCA是通過(guò)降維將復(fù)雜數(shù)據(jù)直觀化，與PCA不同的是，PLS-DA是有監(jiān)督的分析，屬于模型的方法。有監(jiān)督的PLS-DA有助于高維數(shù)據(jù)的可視化、判別分析與代謝變化有關(guān)的潛在代謝物。另外，在PLS-DA中使用交叉驗(yàn)證和置換檢驗(yàn)可以評(píng)價(jià)模型的性能指標(biāo)[24]。經(jīng)PLS-DA，R2X=0.989，R2Y=0.999，Q2=0.983，R2X和R2Y分別表示模型所能解釋X和Y矩陣信息的百分比，R2X－R2Y＜0.3代表該模型較可靠。使用置換檢驗(yàn)的方法對(duì)PLS-DA進(jìn)行驗(yàn)證，次數(shù)為200 次，得到檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量評(píng)估模型擬合的質(zhì)量。圖5是PLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果，右側(cè)是原始值，左側(cè)是模擬值，所有左側(cè)的R2和Q2均比右側(cè)低，R2和Q2的回歸線斜率大于1，且Q2的回歸線截距為負(fù)值，說(shuō)明該模型穩(wěn)定性較好，未出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測(cè)能力[25]。

圖5 柑橘果皮中揮發(fā)性化合物PLS-DA Permutations圖Fig. 5 Permutation test plot of volatile compounds in citrus peel

2.6 不同處理柑橘果皮標(biāo)志揮發(fā)性化合物分析

PLS-DA載荷圖通過(guò)擴(kuò)大組間差異、減少組內(nèi)差異的分析方法尋找標(biāo)記物，每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的揮發(fā)性化合物被認(rèn)為對(duì)樣本的分類貢獻(xiàn)最大。變量投影重要性（variable important in the projection，VIP）通過(guò)PLS-DA載荷圖判別所得，一般VIP＞1表示在判別過(guò)程中具有重要作用。VIP值越大，說(shuō)明在不同處理下該揮發(fā)性化合物的差異越顯著[25]。共篩選出17 種標(biāo)志揮發(fā)性化合物，在圖6中以紅色顯示。為了分析不同處理下柑橘果皮標(biāo)志揮發(fā)性化合物變化，根據(jù)標(biāo)志揮發(fā)性化合物的峰值強(qiáng)度進(jìn)行熱圖聚類分析。如圖7所示，HT與OF柑橘果皮中標(biāo)志揮發(fā)性化合物較為相似，其中I區(qū)域中揮發(fā)性化合物經(jīng)HT和OF處理，其含量增加；II區(qū)域中揮發(fā)性化合物含量經(jīng)過(guò)HT和OF處理呈下降趨勢(shì)。

圖6 柑橘果皮中揮發(fā)性化合物PLS-DA載荷圖Fig. 6 PLS-DA loading plot for volatile compounds in citrus peel

圖7 柑橘果皮中標(biāo)志揮發(fā)性化合物聚類分析的熱圖Fig. 7 Cluster heat map of volatile marker compounds in citrus peel

2.6.1 柑橘果皮中醇類及醛類物質(zhì)的變化

利用GC-IMS從柑橘果皮中共檢測(cè)出13 種醇類物質(zhì)（表1），經(jīng)PLS-DA，5 種醇類物質(zhì)是標(biāo)志揮發(fā)性化合物，包括α-松油醇、β-松油醇、反-2-己烯醇（D）、正己醇、乙醇（D）（圖7）。經(jīng)HT和OF處理，這些醇類物質(zhì)總含量增加，與CK組樣品差異顯著（P＜0.05） （表2）。HT和OF處理后，4 種標(biāo)志醇類化合物含量顯著增加，而反-2-己烯醇（D）含量顯著降低。利用GCIMS從柑橘果皮中共檢測(cè)出12 種醛類物質(zhì)（表1），經(jīng)PLS-DA，4 種醛類物質(zhì)是標(biāo)志揮發(fā)性化合物，包括癸醛（M）、癸醛（D）、正己醛、乙縮醛（圖7），經(jīng)HT和OF處理樣品，標(biāo)志醛類化合物總含量呈下降趨勢(shì)，且不同處理之間差異顯著（P＜0.05）（表2），只有癸醛（D）經(jīng)HT處理后含量顯著增加。

表2 柑橘果皮中標(biāo)志揮發(fā)性成分峰值強(qiáng)度Table 2 Peak intensities of volatile marker component in citrus peelmV

2.6.2 柑橘果皮中酯類物質(zhì)的變化

利用GC-IMS從柑橘果皮中共檢測(cè)出7 種酯類物質(zhì)（表1），經(jīng)PLS-DA，4 種酯類物質(zhì)是標(biāo)志揮發(fā)性化合物，包括丁酸丙酯（D）、丙酸乙酯（D）、乙酸乙酯（M）、甲酸乙酯（圖7），經(jīng)HT和OF，標(biāo)志酯類化合物總含量顯著增加，與CK組樣品差異顯著（P＜0.05）（表2），以上4 種酯類化合物含量呈顯著上升趨勢(shì)。

2.6.3 柑橘果皮中萜烯類物質(zhì)的變化

利用GC-IMS從柑橘果皮中共檢測(cè)出9 種萜烯類物質(zhì)（表1），經(jīng)PLS-DA，只有α-葑烯是標(biāo)志揮發(fā)性化合物（圖7），經(jīng)HT和OF處理樣品，α-葑烯含量有少量的增加，不同處理之間差異不顯著（表2）。

2.6.4 柑橘果皮中酮類及呋喃類物質(zhì)的變化

利用GC-IMS從柑橘果皮中共檢測(cè)出4 種酮類物質(zhì)（表1），經(jīng)PLS-DA，只有2-丁酮和丙酮是標(biāo)志揮發(fā)性化合物（圖7），經(jīng)HT和OF處理樣品，這些酮類物質(zhì)總含量顯著下降，與CK樣品差異顯著（P＜0.05） （表2）。從柑橘果皮中共檢測(cè)出3 種呋喃類物質(zhì)，經(jīng)PLS-DA，只有2-乙基呋喃是標(biāo)志揮發(fā)性化合物 （圖7），經(jīng)OF處理樣品，其含量增加，與CK、HT處理樣品差異顯著（P＜0.05）（表2）。

3 討 論

本研究對(duì)柑橘進(jìn)行HT和OF處理后，采用GC-IMS檢測(cè)分析不同處理前后揮發(fā)性化合物的變化，結(jié)果表明，許多揮發(fā)性化合物顯著增加，主要包括醇類、醛類、酯類和萜烯類。這些化合物構(gòu)成了水果特有的香味，并有助于提高水果的風(fēng)味[26]。芳樟醇、α-松油醇作為山茱萸揮發(fā)油的成分，具有抗氧化活性和體外抗菌活性，經(jīng)HT和OF處理，α-松油醇含量顯著增加[27]。因成熟度增加反-2-己烯醇含量減少[28]。柑橘果皮油的主要成分包括辛醛、癸醛、香葉醛等醛類和芳樟醇、α-松油醇、香葉醇等醇類物質(zhì)，其具有較強(qiáng)的抗真菌活性，其中的辛醛、癸醛、芳樟醇及α-松油醇在本實(shí)驗(yàn)中均鑒定出，經(jīng)HT和OF處理，癸醛和α-松油醇含量增加[29]。在水果果實(shí)成熟和衰老過(guò)程中，其果皮中醛類物質(zhì)含量趨于下降，這與本研究中標(biāo)志性醛類化合物總含量呈下降趨勢(shì)一致[26]。臭氧處理能顯著延緩火龍果果實(shí)的衰老，在此過(guò)程中 2-庚醛、2-辛烯醛和4-庚醛含量顯著增加[30]。癸醛也是甜橙皮精油的主要醛類[31]。以上研究表明，揮發(fā)性醛類可能是溫州蜜橘果皮代謝的產(chǎn)物。在本研究中，癸醛可能在提高果實(shí)抗病性中起到積極作用。

天然的風(fēng)味和芳香源于多種化合物的復(fù)雜混合物，揮發(fā)性酯類是主要成分[32]。乙酸芳樟酯是檸檬葉精油中主要化合物，檸檬葉精油可作用于細(xì)菌細(xì)胞壁和質(zhì)膜，其被視為合成抗菌素的天然替代品[33]。柑橘經(jīng)臭氧處理后，其果皮中乙酸橙花酯、乙酸香葉酯和乙酸辛酯含量顯著增加，這可能與延緩果實(shí)采后貯藏中的腐爛有關(guān)[34]。碳?xì)漉?，尤其是乙酸辛酯等酯類化合物具有較強(qiáng)的清除自由基和抗菌活性[35]。乙酸橙花酯、乙酸香葉酯作為柑橘果皮油的主要成分，對(duì)細(xì)菌及真菌具有較強(qiáng)抑菌效果[29]。在本研究中，經(jīng)HT和OF處理，丁酸丙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯和甲酸乙酯等酯類化合物含量顯著增加。

萜烯類物質(zhì)在植物精油成分中占有重要地位，植物精油的抑菌活性與其化學(xué)成分有關(guān)，牛至精油和羅勒精油的主要成分是萜烯類化合物，能破環(huán)菌體細(xì)胞膜達(dá)到抑制菌體生長(zhǎng)的目的[36]。經(jīng)PLS-DA，只有α-葑烯是標(biāo)志萜烯類化合物，但β-羅勒烯（D）等其他萜烯類物質(zhì)亦少量增加。α-蒎烯、檸檬烯、β-月桂烯、β-石竹烯、β-蒎烯等烯萜類成分對(duì)炭疽菌、灰霉病等植物真菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用[37]。檸檬烯、β-羅勒烯、α-松油烯作為益母草的主要成分，β-羅勒烯、β-石竹烯作為錦葵花葉揮發(fā)油的主要成分，兩者均具有廣譜抗菌活性[38]。白鮮葉和莖中提取的精油，萜烯類化合物所占比例最高（66.7%），其通過(guò)破壞細(xì)胞壁表現(xiàn)出對(duì)真菌的較強(qiáng)抑制能力，從而具有開(kāi)發(fā)天然抗真菌藥物的潛力[39]。萜烯類作為陳皮揮發(fā)油的主要成分，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有不同程度的抗菌活性[40]。綜上所述，經(jīng)HT和OF處理，含量增加的醇類、醛類、酯類和萜烯類化合物大都具有抗菌活性。

4 結(jié) 論

本研究采用HT和OF對(duì)柑橘進(jìn)行采后處理，使用 GC-IMS技術(shù)對(duì)柑橘果皮中揮發(fā)性化合物進(jìn)行有效的分離、檢測(cè)，共鑒定出49 種化合物，包括13 種醇類、12 種醛類、9 種萜烯類、7 種酯類、4 種酮類、3 種呋喃類、1 種酸類。結(jié)合PCA和PLS-DA研究處理前后柑橘果皮揮發(fā)性化合物的變化，篩選出17 個(gè)標(biāo)志揮發(fā)性化合物，并對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HT和OF處理樣品，醇類、醛類、酯類和萜烯類化合物含量增加，并具有抗菌活性。因此，采用HT和OF技術(shù)能增強(qiáng)果實(shí)抗病性，延緩采后腐爛，延長(zhǎng)果實(shí)貨架期，在柑橘貯藏保鮮中具有重要的意義。