馬寶珠,劉世軍△,李 慧,劉 永
1陜西中醫(yī)藥大學,陜西 咸陽712083;2陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心;3秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育);4陜西省創(chuàng)新藥物研究中心
大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實[1],具有“補中益氣,養(yǎng)血安神”的功效[2]。大棗作為藥食同源的食品,被人們廣泛使用。研究表明,大棗中含有三萜酸類、黃酮類、環(huán)核苷酸類、多酚類、多糖、低聚糖等多種成分[3-5],具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、防治心血管疾病、提高免疫力等作用[6]。
目前,我國大棗產(chǎn)量雖高,但對大棗多樣化產(chǎn)品的開發(fā)程度不夠。大棗含糖量約50%~80%,其中一些糖分對人們有益,而另外一些糖分則不太受到人們的歡迎,如葡萄糖和果糖[7-8]。本實驗利用不同的膜,依據(jù)“篩分”效應(yīng)來試驗大分子與小分子之間的分離,對大棗水提液中不同的糖進行分離。依據(jù)分離效果,找出最適合的膜。
1.1 儀器LNG-HFM-101型中空纖維膜分離設(shè)備(膜型號LNG-HFM U6,LNG-HFM U0.2,上海郎級膜分離設(shè)備工程有限公司);LNG-HFM-101型中空陶瓷膜分離設(shè)備(膜型號LNG-CM 0.2 μm,LNG-CM0.05 μm,上海郎級膜分離設(shè)備工程有限公司);電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司);KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-2600紫外可見分光光度計(日本島津公司);電子分析天平(賽多利斯科科學儀器有限公司)。
1.2 試劑葡萄糖(分析純,天津市大茂化學試劑廠);3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid)(化學純,上??曝S實業(yè)有限公司);氫氧化鈉(分析純,天津市天力化學試劑有限公司);硫酸(分析純,成都市科隆化學品有限公司);無水乙醇(分析純,安徽安特食品股份有限公司);亞硫酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉(均為分析純,天津市天力化學試劑有限公司)。
2.1 樣品的制備將大棗洗凈去核干燥處理,用12倍水煎煮3次,每次2 h,提取液過濾,濃縮為浸膏,冷藏備用。取80 mL浸膏加純化水稀釋至2000 mL,即為原樣品溶液,生藥含量約為0.1 g/mL。
2.2 樣品的過膜經(jīng)考察確定,過膜時陶瓷膜和中空纖維膜壓力各為0.5 MPa,溫度為30℃。將2000 mL的原樣品溶液分別過0.2、0.05 μm的微濾陶瓷膜,剩余截留液為100 mL時停止過濾,所得截留液分別為Ⅰ號樣品和Ⅱ號樣品。將2000 mL的原樣品溶液分別過U6的超濾纖維膜和U0.2的微濾纖維膜,剩余截留液為100 mL時停止過濾,所得截留液分別為Ⅲ號樣品和Ⅳ號樣品。
2.3 總糖含量測定方法[9]總糖標準曲線的繪制:分別精密抽取0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中,加純化水至2 mL,然后加入6%苯酚溶液(由80%苯酚現(xiàn)配)1.0 mL,搖勻,加入濃硫酸5.0 mL后,常溫放置30 min,再冰水浴5 min,于490 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度值??瞻讓φ談t以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標準曲線圖則以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標進行繪制,見圖1?;貧w方程:y=17.674x-0.0556;相關(guān)系數(shù):R2=0.9972。見圖1。
圖1 總糖測定中葡萄糖標準曲線
2.4 還原糖含量的測定方法[10-12]
2.4.1 DNS試劑的配置A液:稱取6.3 gDNS,21.0 g氫氧化鈉充分溶解于400 mL加熱脫氣后的純化水中。B液:稱取182.0 g酒石酸鉀鈉溶解于400 mL脫氣后的溫水中,再加入5.0 g苯酚,5.0 g亞硫酸鈉,攪拌使其溶解,并放置至常溫。最后將A液與B液混合均勻,倒入1000 mL的棕色容量瓶中并定容至刻度線,即為配制好的DNS試劑。將DNS試劑冷藏于冰箱中備用,至少放置7天后使用。
2.4.2 還原糖標準曲線的制備 精密移取1.00 mg/mL的葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于25 mL容量瓶中,加純化水至2 mL,再移取5.0 mLDNS試劑加入容量瓶中。搖勻,沸水浴5 min后,立即置于冰水中20 min,最后定容至刻度線,于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度??瞻讓φ談t以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標準曲線圖則以橫坐標為濃度,縱坐標為吸光度進行繪制,見圖2?;貧w方程:y=32.113x-0.0853;相關(guān)系數(shù):R2=0.9989。見圖2。
圖2 還原糖測定中葡萄糖標準曲線
2.4.3 條件優(yōu)化
2.4.3.1 顯色條件 通過閱讀文獻發(fā)現(xiàn),苯酚-硫酸法測總糖的方法比較穩(wěn)定,而DNS法測還原糖時,顯色條件有較大的不同。因此,針對還原糖的測定進行顯色條件優(yōu)化。
2.4.3.2 最大吸收波長 精密移取1.00 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL于25 mL容量瓶中,加純化水至2 mL。搖勻后加入5.00 mLDNS試劑,沸水浴3 min后,立即放入冰水中冷卻20 min,最后定容至刻度線,于450~600 nm波長范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計進行光譜掃描,測其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖溶液作空白對照。見圖3。由圖可知,波長為493 nm時有最大吸光度,故本實驗還原糖測定時選用的波長為493 nm。
圖3 光譜掃描圖
2.4.3.3 顯色劑用量 在6只25 mL容量瓶中,分別加入1 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL,并補純化水至2 mL。在分別依次加入2、3、4、5、6、7 mL的DNS溶液,搖勻后立即沸水浴3 min。取出,冰水浴20 min,再加純化水定容至刻度線,搖勻,于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標準溶液作空白對照。結(jié)果見圖4。由圖4可知,DNS用量為4~7 mL時,吸光度趨于穩(wěn)定,DNS用量為5 mL時,吸光度最大,故選擇加入顯色劑的用量為5 mL。
圖4 顯色劑用量對吸光度的影響
2.4.3.4 顯色反應(yīng)時間 分別加入1 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL于5只25 mL容量瓶中,并補純化水至2 mL。再各加入5 mL的DNS溶液,搖勻后分別沸水浴3、4、5、6、7 min顯色,取出,冰水浴20 min,再加純化水定容,搖勻,于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替葡萄糖標準溶液作空白對照。見圖5。由圖可知,顯色反應(yīng)時間為5 min時測定的吸光度最大,故選擇顯色反應(yīng)時間為5 min。
圖5 顯色反應(yīng)時間對吸光度的影響
2.4.4 方法學考察
2.4.4.1 精密度實驗 分別精密移取0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶,按照還原糖標準曲線測定方法測定吸光度值,測得吸光度分別為0.567、0.559、0.572、0.565、0.563、0.577,RSD=1.14%。結(jié)果表明,吸光度無明顯變化,說明方法精密度良好。
2.4.4.2 穩(wěn)定性實驗 分別精密移取0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶,按照還原糖標準曲線測定方法每隔5 min測一次吸光度,連續(xù)30 min考察穩(wěn)定性。測得吸光度分別為0.560、0.576、0.564、0.576、0.559、0.561,RSD=1.40%。結(jié)果表明,吸光度值30 min內(nèi)無明顯變化,說明方法穩(wěn)定性良好。
2.4.4.3 還原糖加樣回收實驗 精密移取已知還原糖(大棗粉末還原糖)含量為0.513 8 mg/mL的樣品溶液0.5 mL,按還原糖含量的80%、100%、120%,加入對應(yīng)葡萄糖濃度的溶液0.5 mL,按照“2.4.2”還原糖標準曲線測定方法測定吸光度值,計算回收率,結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,還原糖平均加樣回收率為101.00%,RSD為4.48%。符合要求。見表1。
表1 還原糖加樣回收實驗
2.5樣品中總糖和還原糖的測定將樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號分別加純化水稀釋至合適的倍數(shù),搖勻,即得樣品溶液。測定前,將樣品溶液搖勻,精密移取2 mL于具塞試管中,加入6%的苯酚溶液1 mL,搖勻后立即加入濃硫酸5 mL。常溫放置30 min后冰水浴5 min,于490 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度值。空白對照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。最后根據(jù)“2.3”項所得的總糖標準曲線線性回歸方程求得樣品溶液中總糖濃度。見表2。
表2 樣品過不同膜后含糖量測定
將樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號分別加純化水稀釋至合適的倍數(shù),搖勻,即得樣品溶液。取1 mL樣品溶液并加純化水1 mL于25 mL容量瓶中。加入5 mL的DNS溶液,搖勻后沸水浴5 min顯色,然后冰水浴20 min后,加純化水定容至刻度線,搖勻,于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替樣品溶液作空白對照。最后根據(jù)“2.4.2”項中還原糖標準曲線線性回歸方程求得樣品溶液中還原糖濃度。見表2。
大棗中的糖分為單糖、低聚糖和多糖,由于多糖和低聚糖的含量無法直接測定,因此以總糖和單糖(還原糖)之差來反映低聚糖和多糖的含量。見表2。
由表2可知,在壓力為5 MPa,溫度為30℃的情況下,通過比較0.2 μm和0.05 μm微濾陶瓷膜、U6和U0.2超濾纖維膜這4種膜。4種不同膜對大棗單糖(還原糖)的透過效果依次為:U6超濾纖維膜>U0.2微濾纖維膜>0.05 μm微濾陶瓷膜>0.2 μm微濾陶瓷膜。4種不同膜對大棗多糖及低聚糖的截留效果依次為:U6超濾纖維膜>U0.2微濾纖維膜>0.2 μm微濾陶瓷膜>0.05 μm微濾陶瓷膜。因此U6超濾纖維膜對大棗的過膜效果相對最好,過膜速度也較快。
本研究利用膜分離技術(shù)對大棗水提液的截留效果進行初步考察。結(jié)果表明,膜分離技術(shù)對大棗多糖和低聚糖有一定的截留效果,同時截留液中還原糖含量也有所降低。但就膜而言,過膜效率低,過膜時間久,膜的清洗也需花費大量時間;就大棗而言,大棗中含糖量高,同時糖類成分復(fù)雜、差異大。過膜要將其完全分開存在一定困難。因此,應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)中對大棗水提液含糖量的實際需要選擇0.2、0.05 μm的微濾陶瓷膜或U6、U0.2的微濾纖維膜。