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      香花油茶果殼與果殼芯總多酚和鞣花酸含量測定

      2021-11-05 07:26:04蘇宏偉馬錦林李桂珍甘春雁
      廣西林業(yè)科學 2021年4期
      關鍵詞:花酸香花果殼

      蘇宏偉,谷 瑤,馬錦林,楊 漓,李桂珍,甘春雁

      (1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室,廣西南寧 530002;2.廣西靈水林化有限公司,廣西南寧 530199)

      香花油茶(Camellia osmantha)是2012年在廣西壯族自治區(qū)南寧市發(fā)現(xiàn)的油茶新物種,出籽率高,油脂特征較其他油茶品種差異較大[1-3]。據(jù)統(tǒng)計,2019年廣西香花油茶的種植面積達616 hm2[4]。油茶果殼約占整個茶果鮮重的50%~60%,含有植物單寧、多糖、黃酮和多酚等活性物質(zhì),活性物質(zhì)的含量因油茶品種不同而差異明顯[5-7]。油茶果殼提取物因多酚類物質(zhì)含量較高,具有較強的生物活性,有減肥、降脂、降糖和預防前列腺增生等功效[8-10]。鞣花酸屬于多酚類物質(zhì),是沒食子酸的二聚衍生物,以游離鞣花酸或其衍生物等形式廣泛存在于各種軟果、堅果的組織中[11];不同品種果實中的鞣花酸含量差異明顯[12],仙居普通油茶(Camellia oleifera)果的鞣花酸含量為2.062 9 mg/g[13],黑樹莓(Rubus mesogaeus)中的鞣花酸含量高達90 mg/g[11]。采用大孔樹脂分離純化油茶果殼提取物,鞣花酸含量明顯提高[13]。研究表明,香花油茶果殼提取物對膀胱癌細胞表現(xiàn)出較強的抑制作用,其中主要作用物質(zhì)為鞣花酸[14]。目前,油茶果殼的研究主要有總多酚提取和純化工藝[15-17]等,關于香花油茶果殼和果殼芯的總多酚和鞣花酸含量提取還未見報道。

      為了提高香花油茶果殼的綜合利用率,本研究以香花油茶為研究對象,通過紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法分別測定果殼和果殼芯的總多酚和鞣花酸含量,計算總多酚中鞣花酸的占比,為香花油茶鞣花酸的純化提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 樣品與試劑

      2019年11月,隨機采集種在廣西南寧(NN)、橫州(HZ)、田陽(TY)、來賓(LB)等地的5年生香花油茶的成熟果實5~10 個,鮮果經(jīng)自然晾曬、脫殼,將香花油茶果殼陰干至水份含量15%~20%。油茶果殼芯是指油茶果內(nèi)分隔油茶籽中間的條狀物,一般粘附在果殼上[18]。用粉碎機將果殼和果殼芯分別粉粹至50 目,再用高速粉碎機粉碎至100 目,裝入樣品袋。果殼樣品編號為NNK、HZK、TYK 和LBK,果殼芯樣品編號為NNX、HZX、TYX和LBX,備用。

      無水乙醇、碳酸鈉(Na2CO3)、氫氧化鈉(NaOH)、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)和磷酸均為AR 級;乙腈為色譜純;自制高純水;鞣花酸標準品(HPLC ≥98.0%,四川省維克奇生物科技有限公司);沒食子酸標準品(北京盛世康普化工技術研究院);福林酚試劑(國藥集團化學試劑有限公司)。

      1.2 儀器

      EGLL - 230B 電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);離心機(L530,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);超聲波清洗器(HN10-2500,上海汗諾儀器有限公司);微型植物粉碎機(FZ102,天津市泰斯特儀器有限公司);高速萬能粉碎機(FW100,天津市泰斯特儀器有限公司);液相色譜儀(Waters e2695);TP3200 電子天平;純水儀(優(yōu)普,TKA LABUPW12);UV-1750 紫外分光光度計(日本Shimadzu公司)。

      1.3 總多酚檢測

      1.3.1 沒食子酸標準曲線繪制

      稱取沒食子酸標準品0.100 g,用蒸餾水溶解并定容至100 mL,制成沒食子酸母液。移取一定體積母液,配制成濃度為10、20、30、40 和50 μg/mL 沒食子酸標準溶液。

      分別吸取1 mL 不同濃度的沒食子酸標準溶液至10 mL 容量瓶中,加入5 mL 濃度為10%的福林酚溶液,搖勻后靜置5 min,用4.5 mL的7.5%Na2CO3溶液定容,靜置1 h。用紫外-可見分光光度法[19]在765 nm波長下測定吸光度值。

      1.3.2 樣品檢測

      分別稱取1.000 g 香花油茶果殼和果殼芯粉末(水份含量15.24%),用50 mL 70%甲醇溶液浸泡,用超聲波清洗器在70 ℃下提取30 min。離心過濾后,取上層清液,重復浸提3次,合并清液,在200 mL棕色容量瓶中定容。吸取1 mL浸提液稀釋至10 mL,從中吸取1 mL 至10 mL 容量瓶,加入5 mL 濃度為10%的福林酚溶液,搖勻后靜置5 min,用4.5 mL 的7.5% Na2CO3溶液定容,靜置1 h。在765 nm 波長下測定吸光度值。重復3次,取平均值。

      1.4 鞣花酸檢測

      1.4.1 標準曲線繪制

      稱取鞣花酸標準品10 mg,添加50%甲醇溶液或DMSO 溶液,采用超聲波清洗器輔助溶解,滴入1% NaOH 溶液(或不添加),至鞣花酸全部溶解,用50%甲醇或DMSO 溶液定容至100 mL,制成鞣花酸母液。

      移取母液0、0.25、2.50、5.00和12.50 mL至25 mL棕色容量瓶,用50%甲醇溶液定容,配制成濃度為0、1、10、20、50 和100 μg/mL 的標準溶液。采用高效液相色譜在波長254 nm 下進行測定,計算吸收峰面積。色譜柱規(guī)格為C18色譜柱,250 mm×4.6 mm(粒徑5 μm);流動相為乙腈+0.2%磷酸(18+82)溶液;流動相流量為1 mL/min;進樣量為20 μL;柱溫30 ℃。

      1.4.2 檢測限

      采用不同溶劑溶解鞣花酸標準品,多次稀釋,進行液相色譜分析,測定鞣花酸標準品的最小檢測限(LOD)。LOD 定義為信噪比等于3(S/N=3)時對應的進樣濃度。

      1.4.3 樣品檢測

      分別稱取1.000 g果殼和果殼芯粉末,加入10 mL離心管中,加入50%甲醇溶液,采用超聲波清洗器在45 kHz 和55 ℃條件下萃取40 min,冷卻至室溫后,以3 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min,取上層清液,萃取3 次,合并上層清液,至25 mL 容量瓶中定容。在進樣檢測前,待樣品經(jīng)0.45 μm 超濾膜進行過濾。重復3次,通過檢測樣品的響應峰面積,計算果殼和果殼芯鞣花酸的平均含量。

      1.4.4 加樣回收試驗

      稱取已知鞣花酸含量的果殼芯樣品6 份,每份1.000 g。分別加入一定量鞣花酸標準品,選用不同溶劑進行浸提,按照1.3.2 方法進行制樣,采用1.4.1里的液相色譜條件進行測定,計算回收率。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 香花油茶果殼和果殼芯總多酚含量

      4 個產(chǎn)地香花油茶果殼的總多酚含量差別不大,南寧含量最高(52.0 mg/g),來賓最低(49.5 mg/g);果殼芯的總多酚含量差別不大,南寧含量最高(39.9 mg/g),田陽最低(35.7 mg/g);果殼的總多酚含量高于果殼芯(表1)。以總多酚濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線,可知方程為y=0.010 6x+0.002 8。

      表1 香花油茶果殼和果殼芯總多酚含量Tab.1 Content of total polyphenol in shell and core of C.osmantha fruit(mg/g)

      2.2 香花油茶果殼和果殼芯鞣花酸含量

      2.2.1 試驗條件選擇

      以吸收峰面積為縱坐標、鞣花酸濃度為橫坐標,繪制標準曲線。添加50%甲醇溶液,鞣花酸標準品保留時間為19.468~ 19.961 min,R2為0.997 3,檢測限為0.138 μg/mL(表2~3)。添加NaOH溶液助溶,鞣花酸標準品保留時間為23.324 ~ 24.114 min,R2為0.999 1,檢測限為3.310 μg/mL,當濃度為1 μg/mL時,沒有信號峰出現(xiàn),可能是NaOH 溶液與鞣花酸部分反應,使鞣花酸水解物的信號峰出現(xiàn),該信號峰與標準樣信號峰偏差較大。添加DMSO 溶液,R2為0.999 9,擬合度好,檢測限為0.056 μg/mL,樣品回收率為97.29%,故選用DMSO 作為溶劑溶解鞣花酸標準品。

      表2 不同溶劑下鞣花酸的線性回歸方程、相關系數(shù)和檢測限Tab.2 Regression equations,correlation coefficients and detection limits of ellagic acid in different solvents

      表3 鞣花酸在不同溶劑中的加樣回收率Tab.3 Recovery rate of ellagic acid in different solvents

      2.2.2 樣品檢測

      香花油茶的果殼鞣花酸含量均低于果殼芯,果殼和果殼芯的鞣花酸含量最高分別可達187 和426 μg/g(表4);田陽的果殼芯鞣花酸在總多酚中的占比最高(1.18%),南寧的最低(1.05%),各組間差異不大。果殼芯鞣花酸在總多酚中的占比約為果殼的3倍。

      表4 香花油茶果殼和果殼芯的鞣花酸含量和其在總多酚中的占比Tab.4 Contents of ellagic acid in shell and core of C.osmantha fruit and their relative contents in total polyphenols

      續(xù)表4 Continued

      3 討論與結(jié)論

      本研究發(fā)現(xiàn)廣西4個地點的香花油茶果殼和果殼芯的鞣花酸和總多酚含量受油茶種植地域影響較小。果殼的總多酚含量均高于果殼芯,最高為52.0 mg/g,高于油茶果殼的總多酚含量(46.38 mg/g)[9]。果殼芯的鞣花酸含量明顯高于果殼,且果殼芯的鞣花酸占總多酚的比值約為果殼的3倍。根據(jù)目前鞣花酸的市場需求,可從果殼芯中提取鞣花酸,進行純化,提升油茶加工剩余物高值化利用率。

      本研究建立香花油茶果殼和果殼芯的鞣花酸定量分析方法,采用高效液相色譜法,選取二甲基亞砜溶劑溶解鞣花酸標準品和待檢樣品,處理方法簡單,穩(wěn)定性高,為香花油茶果殼高附加值活性成分的提取和分離提供了科學依據(jù)。

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