張?zhí)锪x,賴新星,李婷婷,解小龍,劉偉地,楊芩瑜,李 影,高 穎
(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 東直門醫(yī)院、2. 中醫(yī)腦病研究院,北京 101121)
缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是指因腦部血液循環(huán)障礙,發(fā)生缺血、缺氧所導(dǎo)致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損。在世界范圍內(nèi),中風(fēng)是致死、致殘的首要原因。缺血性腦卒中約占卒中總?cè)藬?shù)的80%。然而,目前治療缺血性卒中的最有效手段是溶栓或機(jī)械取栓,但由于受眾面小,且時(shí)間窗狹窄,故僅有少數(shù)的人從這些有限的有效干預(yù)中受益[1],挖掘和開發(fā)對缺血性卒中的有效治療方式具有重要的臨床和公共衛(wèi)生價(jià)值。
缺血性卒中屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇,傳統(tǒng)治法包括益氣活血法、化痰祛瘀法等,近年來隨著研究治法的深入,發(fā)展了清熱化瘀、溫陽通絡(luò)等治法。在中醫(yī)治療中風(fēng)病長期歷史實(shí)踐中,包括董老在內(nèi)的眾多中醫(yī)名家皆有經(jīng)驗(yàn)方傳承,且臨床效果甚佳,但因?yàn)橹嗅t(yī)藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn),尚未闡明作用機(jī)制。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù),初步探索董老經(jīng)驗(yàn)藥對功勞葉、仙鶴草(Gonglaoye and Xianhecao herbal pair,GLY-XHC)治療中風(fēng)的作用機(jī)制,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和臨床推廣提供思路。鑒于功勞葉和枸骨葉在歷史上存在名稱混淆現(xiàn)象,從現(xiàn)代研究看枸骨葉提取成分與傳統(tǒng)北方處方的功勞葉作用相符,故本文通過檢索枸骨葉獲取功勞葉藥物成分[2]。
1.1 GLY-XHC化學(xué)成分的收集通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫,分別以“枸骨葉”“仙鶴草”為關(guān)鍵詞檢索功勞葉、仙鶴草中的化合物成分。以藥物動力學(xué)原理為基礎(chǔ),以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選條件,篩選出符合條件的成分作為活性成分。
1.2 GLY-XHC靶點(diǎn)篩選及“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建查閱文獻(xiàn)及檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫,篩選功勞葉、仙鶴草活性成分及其相對應(yīng)的靶點(diǎn),借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)對靶點(diǎn)的基因名稱進(jìn)行校正。將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)筑“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。
1.3 GLY-XHC治療缺血性中風(fēng)的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測分別在DrugBank(https://go.drugbank.com),GeneCards(https://www.genecards.org),DisGeNET(https://www.disgenet.org),Therapeutic Target Database(http://db.idrblab.net/ttd)和OMIM(https://omim.org)中以“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲取疾病相關(guān)基因,將其與“1.2”項(xiàng)下篩選得到的復(fù)方靶點(diǎn)相互映射,獲得治療IS疾病的潛在靶點(diǎn)。
1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將“1.3”項(xiàng)下篩選得出GLY-XHC可能具有治療IS作用的潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org),規(guī)定種屬為“Homo Sapiens”,得到蛋白互作關(guān)系并將數(shù)據(jù)保存為TSV格式文件。將所得文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.1軟件中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并分析條件篩選核心靶點(diǎn)。
1.5 靶點(diǎn)富集分析為深入了解上述篩選出的GLY-XHC治療IS的潛在作用靶點(diǎn)基因的功能以及在信號通路中的作用,運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行GO及KEGG 通路富集分析,設(shè)置P<0.05,將物種定義為“Homo Sapiens”。按照其富集的靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序,選取KEGG通路前20個(gè)條目進(jìn)行可視化。
1.6 分子對接為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的可靠性,從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中獲得核心靶點(diǎn),進(jìn)行分子對接。我們使用Autodock Vina分析每種蛋白質(zhì)配體的結(jié)合特性[4],為了準(zhǔn)確評估預(yù)測目標(biāo),蛋白結(jié)構(gòu)在對接之前需要對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理,因?yàn)榈鞍捉Y(jié)構(gòu)解析的時(shí)候會存在結(jié)構(gòu)缺失,原子的局部電性沒有標(biāo)出,沒有明確水分子的位置,以及氫原子的位置信息。首先從RCSB Protein Data Bank(http://www.pdb.org)下載PPI 網(wǎng)絡(luò)中前5的核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu),為了保證分子對接的可靠性,我們選擇分辨率小于3.0 a的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)來建立分子對接模型。可以通過PyMOL篩選制備對接配體,包括水缺失和原始配體的提取。然后通過Autodock工具以PDBQT格式保存蛋白質(zhì)和配體[3]。最后通過Dock計(jì)算,將預(yù)測的藥效團(tuán)特征與前5個(gè)目標(biāo)化合物分子擬合。當(dāng)Docking Score絕對值>4.25表示分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合能力,>5.0表示結(jié)合能力較強(qiáng),>7.0表示結(jié)合能力很強(qiáng)[4]。
2.1 GLY-XHC中活性成分的篩選通過 TCMSP數(shù)據(jù)庫得到GLY-XHC中化合物共97個(gè),其中56個(gè)來自功勞葉,41個(gè)來自仙鶴草,根據(jù)OB≥30%同時(shí)DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn),篩選得出GLY-XHC的活性化合物去重后共11個(gè),再根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)告了藥對中含量較高,藥理活性較強(qiáng),雖然不滿足OB及DL,也補(bǔ)充進(jìn)藥物主要成分,如熊果酸(ursolic acid)、綠原酸(3,4-di-o-caffeoylquinic acid)、金絲桃苷(Hyperin)等[5]。匯總后藥物化合物成分共17個(gè),見Tab 1。
2.2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析分析網(wǎng)絡(luò)中包含464個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中藥物節(jié)點(diǎn)2個(gè),活性化合物節(jié)點(diǎn)去重后17個(gè),以及445個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))及1 874條邊。網(wǎng)絡(luò)中黃色橢圓代表功勞葉和仙鶴草,紅色三角形代表復(fù)方活性化合物,靶基因用紫色橢圓表示。在網(wǎng)絡(luò)中,每條邊表示節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的互作關(guān)系。度值表示節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目,運(yùn)用“Network analyze”插件進(jìn)行分析。篩選度值(degree)較為顯著的節(jié)點(diǎn),所得節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵作用?;钚曰衔锱c靶點(diǎn)之間的多重對應(yīng)關(guān)系體現(xiàn)了中藥復(fù)方的復(fù)雜性,同時(shí)各成分與靶點(diǎn)之間相互作用可能是中藥復(fù)方發(fā)揮整體性治療的體現(xiàn)?;谝陨侠碚?,根據(jù)度值(degree)排名前5位的分別為槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、熊果酸、金絲桃苷、木犀草素,可與202、202、202、202、101個(gè)靶基因相互作用,其中前4位為藥對共有的化合物,度值較高,可能在藥對中起關(guān)鍵作用,是藥對的核心化合物。在靶點(diǎn)中,根據(jù)degree排名前 5位的靶點(diǎn),分別是CYP19A1、ALOX5、ESR2、TERT、MMP2,分別能與 18、16、16、15、14 個(gè)活性化合物相互作用。
2.3 GLY-XHC治療缺血性中風(fēng)核心靶點(diǎn)預(yù)測及篩選運(yùn)用DrugBank、GeneCards、DisGeNET,TTD和OMIM數(shù)據(jù)庫共篩選得到3 238個(gè)IS的潛在靶點(diǎn),運(yùn)用Venny 2. 1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制GLY-XHC活性成分靶點(diǎn)和IS靶點(diǎn)的韋恩圖,并得到交集靶點(diǎn)共296個(gè),即為預(yù)測GLY-XHC治療IS的潛在靶點(diǎn)。
2.4 GLY-XHC治療缺血性中風(fēng)的核心靶點(diǎn)預(yù)測及分析將“2.3”項(xiàng)下篩選得到的296個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中,得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),其中共包含296個(gè)節(jié)點(diǎn),4 212條邊。同樣應(yīng)用Network analyse插件進(jìn)行分析,得出靶點(diǎn)度值(degree),根據(jù)度值降序排序,排名前5的靶點(diǎn)為AKT1、MAPK3、IL6、ALB、TNF,分別能與86、86、83、77、73個(gè)靶點(diǎn)相互作用,可能是GLY-XHC藥對的核心靶點(diǎn)。
2.5 富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫分析得到2 500個(gè)GO富集條目(P<0.05),其中包括126類細(xì)胞組分(cell composition,CC)、161種細(xì)胞功能(molecular function,MF)和2 213個(gè)生物過程(biological processes,BP)。BP方面主要涉及對氧化合物的反應(yīng)、對有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞代謝的正調(diào)控、恒定作用、積極調(diào)節(jié)刺激反應(yīng)、細(xì)胞通訊等過程。MF方面,離子結(jié)合、有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合、信號傳導(dǎo)器活性、信號受體活性等富集較為顯著,見Fig 1。
Fig 1 GO enrichment of GLY-XHC targets
通過 DAVID 數(shù)據(jù)庫共篩選得到 KEGG 通路119條(P<0.05),主要涉及神經(jīng)活性受體配體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、cAMP信號通路、Ras信號通路、鈣信號通路等。排名前20的通路利用氣泡圖進(jìn)行可視化(Fig 2)??v軸表示通路的名稱,橫軸表示富集值,氣泡的大小表示富集在該通路上的基因數(shù)目。
Fig 2 KEGG enrichment of proteins in core PPI network
2.6 分子對接在分子對接前,將核心靶點(diǎn)AKT1,MAPK3,IL6,ALB,TNF的蛋白結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫下載。分子對接結(jié)果顯示GLY-XHC的核心化合物和潛在作用靶點(diǎn)的對接得分均≤-5.0 kcal·mol-1,由此可以表明GLY-XHC與預(yù)測的作用靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合活性。具體分子對接分?jǐn)?shù)見Tab 2。配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低,發(fā)生的作用可能性越大[3]。Fig 3-5以三維模式表示了各核心受體的活性位點(diǎn)中與小分子配體的結(jié)合模式,細(xì)節(jié)圖顯示小分子配體與受體H原子發(fā)生氫鍵作用,相應(yīng)的殘基通過標(biāo)簽標(biāo)出,因此通過驗(yàn)證我們認(rèn)為熊果酸、金絲桃苷等是GLY-XHC中重要的潛在活性化合物。
Tab 2 Five potential target protein interacting with five key molecules
Fig 3 Receptor reacting with ligands
缺血性中風(fēng)發(fā)病原因、病理過程及相關(guān)機(jī)制復(fù)雜多樣,除靜脈溶栓和機(jī)械取栓外只能以內(nèi)科保守治療為主,缺乏有證據(jù)的有效治療措施,中藥具有多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),可針對缺血性卒中發(fā)病的各個(gè)時(shí)點(diǎn),不受時(shí)間窗局限,因此基于名家經(jīng)驗(yàn)探討中藥治療中風(fēng)的機(jī)制具有重大意義。
傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為中風(fēng)是陰陽失調(diào)、氣血逆亂,上犯于腦所引起的以突然昏仆,不省人事,半身不遂,口舌歪斜,為主要表現(xiàn)的一種病證,其理論源流從《內(nèi)經(jīng)》薄厥、風(fēng)痱到《金匱要略》內(nèi)虛邪中,發(fā)展到明清時(shí)期的肝陽化風(fēng),氣血并逆,直沖犯腦所致。隨著生活節(jié)奏的加快和工作壓力的提升,中風(fēng)的發(fā)病群體逐漸向中年人、青年人群偏移,其“內(nèi)風(fēng)正虛”應(yīng)有別于傳統(tǒng)的年老氣血本虛。其病機(jī)一方面由于壓力過大,煩勞過度使陽氣升張,另一方面兼有生活節(jié)奏加快、休息不足造成的氣血耗傷,從而陰陽失調(diào),氣血逆亂,發(fā)為中風(fēng)。古云:“氣有余便是火,氣不足便是寒”,但是針對上述的中風(fēng)好發(fā)證型,兼有氣不足、虛火上浮,陽氣升張的情況,若大量黃芪、人參補(bǔ)氣虛,會發(fā)生舌躁目赤、胸腸滿悶等狀況。這就是補(bǔ)氣藥不適量導(dǎo)致的虛火上浮、虛不受補(bǔ)。若用少量參芪,療效又不顯著,因個(gè)體差異大,故最適劑量難以掌握。若以仙鶴草、功勞葉搭配補(bǔ)氣則可虛火不生,彌補(bǔ)參芪補(bǔ)氣之不足。
Fig 4 Receptor reacting with ligands
Fig 5 Receptor reacting with ligands
功勞葉、仙鶴草是中醫(yī)內(nèi)科學(xué)奠基人董建華教授的臨證經(jīng)驗(yàn)藥對,在董老的學(xué)術(shù)傳承過程中,被應(yīng)用在脾胃病、老年病、中醫(yī)急癥等各個(gè)方面,且取得了良好的臨床療效。仙鶴草始載于《滇南本草》,苦涼之品,入肺、肝、脾,具有收斂止血、解毒補(bǔ)虛的功效,因其藥性平和,兼有補(bǔ)虛固脫的作用?!栋俨葭R》言其可“下氣活血,理百病”。古今醫(yī)家取其收斂止血之功治療吐血、瘧疾寒熱等癥,但對其補(bǔ)氣功效則多忽略。江浙一帶農(nóng)村稱本品為“脫力草”,有補(bǔ)虛強(qiáng)壯之功,可用治勞力過度所致的脫力勞傷,癥見神疲乏力、面色萎黃者,常配紅棗煮食,調(diào)補(bǔ)氣血、治脫力勞傷,效果很好。現(xiàn)代藥理研究表明,仙鶴草提取物在抗炎、抗氧化領(lǐng)域具有確切的藥理作用,抗炎機(jī)制除了絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)/p38信號通路外,還可能涉及到iNOS和COX2蛋白表達(dá)水平的下調(diào),以及MAPK/JNK的失活[6]。仙鶴草能夠抑制TNF-α、IL-6、IL-1等促炎因子的表達(dá),通過調(diào)節(jié)TRIF依賴的Syk-PLCγ/AKT信號通路發(fā)揮抗炎作用。仙鶴草內(nèi)酯和去甲基仙鶴草內(nèi)酯通過清除自由基的活性,激活Nrf2通路,抑制p38磷酸化,激活ERK、JNK、MAPK蛋白磷酸化,提高SOD抗氧化酶活性,有效地減輕了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。功勞葉又稱枸骨葉,性涼味苦,入肝腎,清熱養(yǎng)陰,益腎平肝,用于肺癆咯血,骨蒸潮熱,頭暈?zāi)垦??!侗窘?jīng)逢源》中記載功勞葉與紅棗熬蜜膏可治勞傷失血萎蒻?,F(xiàn)代藥理研究表明,枸骨葉具有降血脂、抗心肌缺血、抗氧化、抗菌、免疫抑制等作用,將仙鶴草與功勞葉配伍,用于氣虛患者,絕無虛火上浮之弊。有虛火者亦能清退。
為了進(jìn)一步研究與探討功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風(fēng)的藥效基礎(chǔ)及潛在的生物學(xué)機(jī)制,本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺技術(shù),通過篩選功勞葉、仙鶴草17個(gè)化合物,篩選藥效靶點(diǎn),獲得296個(gè)疾病與藥物交集靶點(diǎn),構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),基因靶點(diǎn)富集分析及通路預(yù)測等手段,得到5個(gè)相關(guān)重要成分,分別是槲皮素、山萘酚、熊果酸、金絲桃苷、木犀草素。其中槲皮素、山奈酚、熊果酸、金絲桃苷可與202個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用,可見其是GLY-XHC治療缺血性中風(fēng)關(guān)鍵成分。槲皮素具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎的作用,廣泛應(yīng)用于腦及脊髓損傷的動物模型中,有研究表明槲皮素可以通過保護(hù)神經(jīng)元及線粒體功能來減輕腦卒中后帶來的繼發(fā)性損害[7]。槲皮素神經(jīng)保護(hù)功能已得到廣泛應(yīng)用,但槲皮素的藥理機(jī)制研究仍在深入,其臨床使用價(jià)值還在不斷進(jìn)行探索。而山奈酚具有抗氧化活性,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞,保護(hù)細(xì)胞損傷。近年來研究標(biāo)明熊果酸具有多種神經(jīng)保護(hù)作用,已經(jīng)在缺血性腦血管病中顯示出治療前景,主要通過激活Nrf2-ARE通路,減少脂質(zhì)過氧化物的堆積,保護(hù)大腦免受局灶性腦缺血后的氧化損傷;抑制MAPK信號通路的激活,減輕腦缺血/再灌注損傷;抑制Ca2+內(nèi)流改善缺血區(qū)血流狀況。金絲桃苷也被報(bào)告了對腦缺血、缺氧具有保護(hù)作用,主要通過抑制NO釋放、Ca2+超載減少神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷。
根據(jù)功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風(fēng)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析得出296個(gè)靶點(diǎn),通過分析發(fā)現(xiàn)AKT1、MAPK3、IL6、ALB、TNF等靶點(diǎn)可能是治療缺血性中風(fēng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中AKT是一種激酶,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和存活過程中發(fā)揮重要作用,Akt包含3種結(jié)構(gòu)相似的同型異構(gòu)體,分別為Akt1,Akt2和Akt3。Akt1在控制細(xì)胞增殖、存活和凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要作用,能被多種上游細(xì)胞因子(如血管內(nèi)皮生長因子等)激活,進(jìn)而對缺血性損傷后的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。Akt1基因缺失會誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,細(xì)胞血管平滑肌遷移和存活改變,促進(jìn)動脈粥樣硬化[8]。MAPK3(絲裂原活化蛋白激酶,又稱JNK),屬于MAPK和JNK家族成員,激活的JNK信號通路對細(xì)胞分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等生理病理過程起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[9]。白細(xì)胞介素-6(interleukin6,IL-6)是一種集多種生物學(xué)效應(yīng)如機(jī)體防御、免疫反應(yīng)和造血反應(yīng)等于一身的細(xì)胞因子,缺血半暗帶中神經(jīng)元損傷程度與IL-6表達(dá)水平高度相關(guān)[10]。人血白蛋白(ALB)也被證明在缺血/再灌注的治療中有作用,有研究表明,大劑量ALB可顯著減少大鼠模型缺血再灌注導(dǎo)致的腦梗死體積以及減輕腦水腫[11]。腫瘤壞死因子(TNF)屬于發(fā)生缺血早期產(chǎn)生的炎性因子,可激活白細(xì)胞黏附到腦缺血區(qū)微血管內(nèi)皮細(xì)胞上,引起內(nèi)皮細(xì)胞皺縮、破裂和壞死,破壞血腦屏障,并可在細(xì)胞因子作用下進(jìn)入缺血區(qū)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),從而加重腦組織損傷,也有研究表明TNF與IS后梗死體積相關(guān)[12]。本文篩選得到的核心靶點(diǎn)和文獻(xiàn)報(bào)道的腦缺血重要靶標(biāo)基本一致。
通過GLY-XHC治療缺血性中風(fēng)的靶點(diǎn)GO富集分析得出,對氧化合物的反應(yīng)、對有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞代謝的正調(diào)控、恒定作用、積極調(diào)節(jié)刺激反應(yīng)、細(xì)胞通訊等過程。KEGG富集通路分析得出,功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風(fēng)的潛在靶點(diǎn)主要涉及神經(jīng)活性受體配體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、鈣信號通路等。鈣信號通路是導(dǎo)致神經(jīng)元缺氧損傷的重要因素,腦缺血能導(dǎo)致胞膜及胞內(nèi)鈣通道激活,改變了神經(jīng)元中的Ca2+信號傳導(dǎo),進(jìn)而影響它們對缺血的反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高,是缺血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號通路激活的重要介質(zhì)[13]。Rap1信號通路在血小板整合素激活及血小板生成過程中發(fā)揮重要作用[14]。其中,PI3K-Akt信號通路通過分析發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用廣泛,與多條調(diào)節(jié)通路有關(guān)。在腦中風(fēng)早期,神經(jīng)細(xì)胞以壞死為主,其后以凋亡為主,在大鼠局灶性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)凋亡現(xiàn)象,PI3K-Akt 信號通路與腦缺血發(fā)生后細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系,多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、缺血后處理及中藥通過激活 PI3K/Akt信號通路抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)的營養(yǎng)及保護(hù)作用[15]。由此可見,GLY-XHC藥對主要通過PI3K-AKt通路以及與腦缺血相關(guān)的多個(gè)通路影響腦缺血后的病理變化。
分子對接結(jié)果顯示,功勞葉、仙鶴草藥對的核心有效化合物槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、熊果酸和木犀草素(luteolin)與核心靶蛋白AKT1、IL-6、ALB、TNF、MAPK3的結(jié)合能均遠(yuǎn)小于-5 kJ·mol-1,由此可見這些核心化合物與受體蛋白的結(jié)合活性較高,進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得出的結(jié)果。
綜上所述,本文基于董老經(jīng)驗(yàn)藥對,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對功勞葉、仙鶴草用于缺血性中風(fēng)治療的作用機(jī)制進(jìn)行了分析討論,在初步篩選出的作用靶點(diǎn)基礎(chǔ)上再結(jié)合分子對接分析進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,GLY-XHC藥對中金絲桃苷和熊果酸等成分可能通過PI3K/AKT等信號通路,作用于AKT1、IL-6、ALB、TNF、MAPK3等靶點(diǎn),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、減輕再灌注損傷、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎等作用。并從中醫(yī)整體觀出發(fā),揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同治療作用,對后期進(jìn)一步確定關(guān)鍵活性成分、新藥研發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。但本研究仍有一定的局限性,由于數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)有限,基于本文所預(yù)測得出功勞葉-仙鶴草治療靶點(diǎn)所展示的相關(guān)通路,后續(xù)將重點(diǎn)開展GLY-XHC治療腦缺血的相關(guān)實(shí)驗(yàn)實(shí)證工作,以期為IS治療藥物的研發(fā)提供方向及依據(jù)。