葉綠素a測(cè)定方法的改進(jìn)

李偉明

（福建省泉州環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，福建 泉州 362000）

葉綠素a是反映水體初級(jí)生產(chǎn)力的首要指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)水體富營(yíng)養(yǎng)化水平的重要參數(shù)[1]。環(huán)境保護(hù)部[2]發(fā)布的《水質(zhì) 葉綠素a的測(cè)定 分光光度法》（HJ 897—2017，下稱國(guó)標(biāo)法）在地表水環(huán)境監(jiān)測(cè)中應(yīng)用最廣泛，以90.0%丙酮為溶劑研磨提取葉綠素a。該方法過(guò)程煩瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，容易因?yàn)槎啻无D(zhuǎn)移樣品產(chǎn)生操作誤差和受光降解反應(yīng)影響導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果失真。為了優(yōu)化葉綠素a的提取過(guò)程、提高監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究探討了葉綠素a的提取方法。

提取葉綠素a的關(guān)鍵在于對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行有效的破壞?，F(xiàn)代動(dòng)植物細(xì)胞破壁技術(shù)主要有超聲波法、珠磨法、化學(xué)滲透法[3-4]。超聲波法和珠磨法被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)樣品的研磨與提取，本研究在此基礎(chǔ)上改進(jìn)方法。在實(shí)驗(yàn)室中，分別用研磨法和超聲波法對(duì)泉州市某水庫(kù)水樣的葉綠素a進(jìn)行多次測(cè)定及比較，證實(shí)將超聲波法和珠磨法應(yīng)用于葉綠素a的測(cè)定是可行的，實(shí)驗(yàn)取得了令人滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

（1）儀器：分光光度計(jì)（Ⅴ-1800，上海美譜達(dá)儀器有限公司），離心機(jī)（TDZ5-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），超聲儀（杭州飛華環(huán)保器材廠），抽濾裝置。

（2）試劑：90.0%丙酮，1.0%碳酸鎂懸濁液。

1.2 樣品采集及處理

使用有機(jī)玻璃采水器采集泉州市某水庫(kù)某斷面表層、中層及底層水樣，采樣體積為1.0 L，轉(zhuǎn)移至1.0 L配有磨口塞的棕色玻璃瓶中，每升樣品加1 mL碳酸鎂懸濁液，以防止酸化引起色素波長(zhǎng)偏移，同時(shí)套上黑色布袋避光保存。

1.3 國(guó)標(biāo)法制備試樣

準(zhǔn)確量取500 mL混勻水樣，用0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行抽濾，再用少量蒸餾水清洗濾器壁，在樣品剛剛完全通過(guò)濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子取下濾膜，將有樣品的一面對(duì)折，用濾紙吸干濾膜水分。將樣品濾膜置于研缽中，加入3～4 mL 90.0%丙酮，研磨至糊狀，補(bǔ)加3～4 mL 90.0%丙酮繼續(xù)研磨。保證充分研磨5 min以上，將完全破碎的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度離心管中，用丙酮沖洗研缽和研磨杵，一并轉(zhuǎn)移至離心管中，定容至10 mL?；靹蚝笥? ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡過(guò)程中顛倒混勻3次。用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min，用針式過(guò)濾器過(guò)濾上清液得到丙酮提取液（試樣），待測(cè)。

1.4 珠磨法制備試樣

準(zhǔn)確量取500 mL混勻水樣，用0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行抽濾，再用少量蒸餾水清洗濾器壁，在樣品剛剛完全通過(guò)濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子取下濾膜，將有樣品的一面對(duì)折，用濾紙吸干濾膜水分。將樣品對(duì)折后置于15 mL具塞刻度離心管中，用90.0%丙酮溶液定容至10 mL標(biāo)線后加入3顆不銹鋼珠。將離心管置于研磨儀中，在50 Hz的頻率下振動(dòng)研磨 5 min后，于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡過(guò)程中顛倒混勻3次。用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min，用針式過(guò)濾器過(guò)濾上清液得到丙酮提取液（試樣），待測(cè)。

1.5 超聲波法制備試樣

準(zhǔn)確量取500 mL混勻水樣，用0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行抽濾，再用少量蒸餾水清洗濾器壁，在樣品剛剛完全通過(guò)濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子取下濾膜，將有樣品的一面對(duì)折，用濾紙吸干濾膜水分。將樣品對(duì)折后置于15 mL具塞刻度離心管中，用90.0%丙酮溶液定容至10 mL標(biāo)線。將離心管置于50 ℃水浴中，在100 Hz的頻率下超聲破碎20 min后，于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡過(guò)程中顛倒混勻3次。用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min，用針式過(guò)濾器過(guò)濾上清液得到丙酮提取液（試樣），待測(cè)。

1.6 樣品的測(cè)定

將用不同方法制備的試樣移至1 cm比色皿中，以90.0%丙酮溶液為參比溶液，于波長(zhǎng)750、664、647、630 nm處測(cè)量吸光度[2]。用下式計(jì)算葉綠素a的質(zhì)量濃度。

式中：ρ為試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；A750為試樣在750 nm波長(zhǎng)下的吸光度；A664為試樣在664 nm波長(zhǎng)下的吸光度；A647為試樣在647 nm波長(zhǎng)下的吸光度；A630為試樣在 630 nm波長(zhǎng)下的吸光度；V為提取液定容后的體積，mL；0.5為本次水庫(kù)水樣的體積，L。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 比對(duì)實(shí)驗(yàn)

采集泉州市某水庫(kù)同一斷面表層、中層及底層水樣，分別用國(guó)標(biāo)法、珠磨法及超聲波法制備7個(gè)試樣進(jìn)行測(cè)定分析。通過(guò)對(duì)3種方法測(cè)定結(jié)果（見表1）的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，測(cè)定結(jié)果有明顯差異，超聲波法與珠磨法的測(cè)定值明顯高于國(guó)標(biāo)法，從相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出，超聲波法與珠磨法的平行性差異不明顯，離散情況優(yōu)于國(guó)標(biāo)法。

表1 實(shí)際水樣精密度測(cè)定結(jié)果

2.2 原因分析

通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，超聲波法與珠磨法的測(cè)定值相近且高于國(guó)標(biāo)法，平行性優(yōu)于國(guó)標(biāo)法。根據(jù)同系統(tǒng)專家意見，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于國(guó)標(biāo)法需要進(jìn)行2～3次人工研磨，在提取葉綠素a的過(guò)程中，每個(gè)樣品要光照約20 min，葉綠素a容易發(fā)生光敏降解反應(yīng)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，葉綠素a在高溫和光照條件下能降解。在15 ℃、正午日照條件下，葉綠素a的降解半衰期為6～7 min，在日光燈照射下為5.5 h，在黑暗處為23 d[5]。此外，按照國(guó)標(biāo)法操作，樣品提取液在多次轉(zhuǎn)移過(guò)程中容易損失，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度。因此，超聲波法及珠磨法的提取過(guò)程基本在密閉容器中的黑暗處進(jìn)行，環(huán)境溫度控制在室溫20 ℃左右，可以有效減少高溫及光照對(duì)葉綠素a降解的影響，同時(shí)不需要對(duì)樣品提取液進(jìn)行再次轉(zhuǎn)移，避免了轉(zhuǎn)移造成的樣品損失，能保證較高的提取效率。

3 結(jié)論

（1）丙酮是低毒物質(zhì)，主要對(duì)中樞神經(jīng)起麻醉作用，濃度較高時(shí)會(huì)引起耳鼻等部位的炎癥，特別嚴(yán)重的情況下甚至?xí)斐苫杳浴Ｏ啾扔趪?guó)標(biāo)法，超聲波法和珠磨法減少了操作人員和丙酮的接觸，保護(hù)了操作人員的身體健康，而且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，減少了樣品轉(zhuǎn)移、研磨不完全和光敏降解反應(yīng)造成的樣品損失，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性。

（2）通過(guò)不同方法的實(shí)驗(yàn)室比對(duì)發(fā)現(xiàn)，超聲波法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.8%～3.3%，珠磨法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.5%～4.0%，國(guó)標(biāo)法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在4.9%～5.4%，可見超聲波法及珠磨法的精密度優(yōu)于國(guó)標(biāo)法，滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)分析要求，適合在環(huán)境監(jiān)測(cè)工作中推廣應(yīng)用。