青霉菌液體發(fā)酵及發(fā)酵液效價測定

奚逢源，薛長艷，季芳琴，屈曉璐

[1.臺州技師學(xué)院（籌），浙江 臺州 318001；2.臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 臺州 318000]

青霉素從發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用對人類的生命征途起到了巨大的作用[1]。青霉素不是單一的結(jié)構(gòu)，又被稱為青霉素G[2]、青霉素鈉等。青霉素分為天然青霉素和半合成青霉素，兩者的生產(chǎn)方法有著天壤之別。例如青霉素G的生產(chǎn)較為簡單，只需要通過培養(yǎng)青霉菌孢子培養(yǎng)物來進(jìn)行發(fā)酵，再提取青霉素精制就可以獲得鈉鹽[3]。半合成青霉素則是通過裂解工藝得到的6APA與多種合成有機酸發(fā)生?；磻?yīng)而得。青霉素的發(fā)酵難以實現(xiàn)在線測量關(guān)鍵變量，所以發(fā)酵過程的控制是一個較大的難題?，F(xiàn)如今，對青霉素發(fā)酵的優(yōu)化重點就在于如何減輕污染以及對發(fā)酵過程中的相關(guān)生理特性進(jìn)行優(yōu)化，盡量降低發(fā)酵成本[4]。在青霉素多年的研究中，其生產(chǎn)工藝也在不斷完善[5]。本實驗首先對青桔霉進(jìn)行搖瓶淺層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)以獲取青霉素，其次對獲得的發(fā)酵液進(jìn)行效價測定來觀察發(fā)酵液中青霉素的抑菌活性[6]。通過簡單的實驗來學(xué)習(xí)效價測定的方法和青霉素對微生物的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

（1）菌種：青桔菌，保藏于臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院。

（2）指示菌：金黃色葡萄球菌。

（3）用具及試劑：培養(yǎng)皿（90 mm），試管，錐形瓶 （250.0 mL），移液槍，移液管，無菌水，生理鹽水，pH為6.0的磷酸緩沖溶液（PBS），氨芐青霉素鈉鹽（1 667.00 U/mL）。

1.2 儀器設(shè)備

超凈臺、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機等。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3.00 g/L，氯化鈉1.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，瓊脂20.00 g/L，pH為7.4～7.6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200.00 g/L，瓊脂20.00 g/L，葡萄糖20.00 g/L，純化水。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5.00 g/L，蔗糖60.00 g/L，玉米淀粉20.00 g/L，碳酸鈣5.00 g/L，硫酸銨10.00 g/L，純化水，pH為6.4。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉0.30 g/L，葡萄糖0.40 g/L，蛋白胨0.04 g/L，KH2PO40.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，純化水。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種活化

將在-20 ℃下保藏的青桔霉甘油凍存管放置在室溫自然融化，然后在PDA斜面培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)6～7 d。

1.4.2 搖瓶種子培養(yǎng)

從生長好的PDA斜面培養(yǎng)基接種到液體種子培養(yǎng)基中，25 ℃條件下 200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

1.4.3 菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)3 d的種子液以10%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d。

1.4.4 制備金黃色葡萄球菌菌懸液

NA培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水清洗菌體，3 000 r/min下離心5 min，去除上清液，洗濯1～2次。稀釋成濃度約109個/mL的菌懸液后，在冰箱4 ℃下保存待用。

1.4.5 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）青霉素標(biāo)準(zhǔn)母液：稱取純氨芐青霉素鈉鹽0.06 g，溶解在100.0 mL、0.2 mol/L、pH為6的磷酸鹽緩沖溶液中，制成1 000.00 U/mL的青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，冷藏存放。

（2）青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：按照表1配成不同濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 不同濃度青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4.6 制備生測平板

在超凈工作臺上，以瓊脂培養(yǎng)基為底，取實驗用菌懸液 1.0 mL，加入未凝固（一般細(xì)菌48～50 ℃，芽孢菌60 ℃）的NA培養(yǎng)基中，取約20.0 mL NA注入雙碟上層，參考劑量和其他劑量點各1皿，重復(fù)2次，用滅菌1.0 mL移液槍槍頭打孔（4個/皿，間距相等），用陶瓷蓋覆蓋，放置20～30 min，備用。

1.4.7 滴加抗生素溶液

每孔滴加0.2 mL，注意滴加溶液間隔不可過長，溶液的擴(kuò)散時間不同會影響測定結(jié)果。滴加完畢后，用陶瓷蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3個，以免受熱不均，影響抑菌圈大小，將制好的雙碟以水平方向平穩(wěn)移入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h[7]。

1.4.8 測定抑菌圈的直徑大小

用直尺或游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，以毫米為單位，誤差不超過0.1 mm，記錄，并以青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)、抑菌圈直徑的校正值為橫坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.9 發(fā)酵液效價的測定

將發(fā)酵液離心，取上清液原液進(jìn)行生測，每個被測樣品進(jìn)行3次重復(fù)測試，測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定[8]。在37 ℃下培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑并記錄在表中。

1.4.10 發(fā)酵液效價的計算

求校正值，校正發(fā)酵液的值，檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，即發(fā)酵原液的效價（如發(fā)酵液經(jīng)過稀釋的效價值×稀釋倍數(shù)即發(fā)酵液原液的效價值）[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

每一稀釋度做2次重復(fù)實驗，首先算出實驗組平均抑菌圈直徑，其次算出各組100.00 U/mL青霉素抑菌圈直徑平均值及8套平皿中100.00 U/mL青霉素抑菌圈直徑總平均值，以 100.00 U/mL抑制圈的總平均值來校正各組的100.00 U/mL抑制圈平均值，求得各組的校正數(shù)值，最后以各組100.00 U/mL抑制圈的校正數(shù)值來校正各單位濃度的抑制圈直徑，獲得各組抑制圈的校正值。本次實驗數(shù)據(jù)驗證和實踐總結(jié)表明，青霉素濃度越高，抑菌圈直徑越大，60.00 U/mL青霉素?zé)o抑菌圈，可能是因為濃度太低，起不到抑菌、殺菌的效果。以標(biāo)準(zhǔn)青霉素效價為縱坐標(biāo)、抑菌圈直徑的校正值為橫坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 發(fā)酵液效價測定

將發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行生測，做3次重復(fù)實驗，將青霉素標(biāo)準(zhǔn)測定液（100.00 U/mL）在3套培養(yǎng)皿中抑菌圈的平均值與在曲線上100.00 U/mL抑菌圈的直徑相比，求得其校正數(shù)值-0.812 5 mm。運用此校正值校正被檢發(fā)酵液抑菌圈直徑，求得其校正值10.217 5 mm，檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，將此校正值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得被檢發(fā)酵液青霉素濃度為137.42 U/mL。

3 總結(jié)與討論

研究了青霉素的發(fā)酵工藝，學(xué)習(xí)了發(fā)酵液的效價測定，實驗數(shù)據(jù)表明，青霉素能對細(xì)菌起到有效殺滅作用[10]。通過斜面菌種制作、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液預(yù)處理，再進(jìn)行青霉素效價測定，測得抑菌圈大小并判斷青霉素對細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果表明，青霉素濃度越高，抑菌作用越好。發(fā)酵過程的控制和培養(yǎng)基的配制都至關(guān)重要，對發(fā)酵工藝的優(yōu)化在今后的實驗中也可深入進(jìn)行[11]，做到減輕污染、提高效率。在實驗中，注意嚴(yán)謹(jǐn)、規(guī)范地在超凈工作臺上操作，避免雜菌的污染導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生誤差或?qū)嶒炇　?/p>